Appunti di citogenetica

Citogenetica e genetica molecolare umana

CITOGENETICA 20/03 Testo: genetica molecolare umana T. Strachan, A. Read, Zanichelli. Dalla genetica è noto l’utilizzo di sistemi modello. Un esempio è E.coli che presenta molteplici vantaggi tra cui riproduzione rapida, facilità di gestione con budget limitato, il suo limite è essere lontano dall’uomo. I ceppi possono essere distinti in maniera precisa, è facile formare degli incroci, anche con studi di complementazioni (se la mutazione è sugli stessi alleli o meno).

S. Cerevisiae: velocità alta di duplicazione, meccanismi di base conservati nell’uomo come polimerasi. Drosophila: la complessità del genoma è inferiore a quella dell’uomo ma si hanno strutture e tessuti simili. Mancano alcune organizzazioni come il SNC simile all’uomo. Un’altra caratteristica dei modelli è quella di dare una progenie molto alta.

Per avvicinarci all’uomo, il sistema modello più usato è il topo, con complessità genomica simile e i tempi di riproduzione sono abbastanza rapidi (3 mesi).

Studio della genetica umana

Nello studio di genetica umana si usa un approccio diverso dai sistemi modelli per una serie di motivi:

• Non si possono creare degli incroci, bisogna servirsi dei dati con uno studio retrospettivo (in base alle famiglie di malati si risale al tipo di ereditarietà associata)
• Non si avrà un ceppo puro, gli individui hanno diversi geni diversi, quindi una maggiore complessità. Spesso nelle famiglie non si ha nemmeno una prole abbondante.

Da un certo punto di vista si può usare nell’analisi delle malattie genetiche i murini come surrogato della malattia genetica, d’altro canto dobbiamo fare uno studio retrospettivo per cercare di capire il legame tra un genotipo malato e un fenotipo malattia. Per fare ciò si utilizzano popolazioni (più famiglie, in cui si analizzano almeno 3 generazioni) in modo da applicare dei sistemi statistici per capire come viene ereditato un certo carattere.

Costruzione di un pedigree

Si parte da un probando, il primo individuo malato che si trova, da cui si ricostruisce un albero genealogico di almeno 3 generazioni. Nelle malattie recessive un individuo può essere portatore, segnato con un pallino all’interno del quadrato/cerchio. Si utilizzano poi software che integrano informazioni da famiglie molto estese. Il codice colore indica i sintomi e la loro gravità.

Da un certo punto di vista ci aiutano a studiare come viene trasmessa una malattia e capire la trasmissione del carattere (autosomica, recessiva o dominante), molto importante nella consulenza genetica nel calcolo del rischio di avere dei figli malati. Da un punto di vista sperimentale è importante per studiare i geni associati e per capire meglio le origini molecolari e per capire la localizzazione genetica.

Classificazione delle malattie genetiche

• Cromosomiche: derivanti da anomalie cromosomiche (numeriche e strutturali).
• Monogeniche a ereditarietà mendeliana: determinate da mutazioni su singolo gene. Hanno un’ereditarietà mendeliana. Possono essere autosomiche e X-linked, in entrambi i casi possono essere dominanti o recessive.
• Multifattoriali
• Geni a ereditarietà non mendeliane, pur essendo causate da un gene solo.
• Mitocondriali

Malattie monogeniche

Nelle malattie monogeniche la maggior parte del fenotipo è determinato dal genotipo di un singolo gene, da una singola mutazione. Ci può essere un contributo dell’ambiente o dallo stile di vita, ma in maniera marginale. Ci può essere anche influenza di altri geni, il fenotipo di altri alleli.

Nelle malattie multifattoriali si ha l’assenza di un singolo gene dominante che causa la malattia ma un contributo di diverse forme alleliche che contribuiscono a raggiungere una soglia prima di scatenare la malattia. Nelle malattie complesse l’ambiente e lo stile di vita giocano un ruolo molto più importante rispetto alle malattie monogeniche.

Le complesse, tra cui ipertensioni, diabete, tumori, sono quelle più diffuse in cui è difficile riconoscere i singoli geni coinvolti. La velocità con cui si sono studiati i caratteri a trasmissione mendeliana è aumentata. Per i caratteri più complessi si ha uno studio lento, proprio perché è difficile risalire alla fonte.

L’aumento esponenziale dello studio mendeliano è avvenuto in contemporanea allo sviluppo della biologia molecolare e agli studi di mappatura del genoma che hanno permesso di capire dove un certo gene malattia si trovasse. Si avevano mezzi adatti per studiare le malattie genetiche dovute a un singolo gene.

Tecniche di sequenziamento

Più recentemente si sono sviluppate tecniche di sequenziamento. Un gene si può definire come porzione di genoma che codifica per una proteina ed è associato a un particolare fenotipo. È l’unità funzionale che determina un certo fenotipo. Un locus indica la posizione specifica. Un allele è una variante del gene.

Leggi di Mendel

La seconda legge afferma che ogni coppia allelica segrega l’una dall’altra nella formazione dei gameti. La progenie deriva da uno di questi gameti che porta un singolo allele di ogni gene. La terza legge afferma che i geni che controllano caratteri diversi si distribuiscono in maniera indipendente.

Caratteri mendeliani

• Autosomi: codificati da geni su cromosomi non sessuali.
• Legati al cromosoma X/Y
• Dominanti o recessivi: i caratteri dominanti sono espressi già negli eterozigoti e i recessivi solo negli omozigoti per l’allele mutante.

Mutazioni genetiche

Una malattia con carattere dominante afferma che basta una copia dell’allele mutato per dare la malattia mentre una recessiva necessita di un omozigote. Fanno eccezione gli Emizigosi, c’è una sola copia negli individui maschi. Le mutazioni sono modificazioni del DNA che possono essere espresse. Si trovano o nella linea germinale, con una trasmissione alla prole, o somatiche. Possono essere errori nella replicazione del DNA (spontanee) o indotte da agenti mutageni.

Autosomal Dominant

Il carattere è dominante quindi ogni individuo che eredita il gene malato sarà malato. Tutti gli eterozigoti saranno malati. Una delle caratteristiche è il fatto di non presentare mai salti generazionali. Ci sarà un uguale rapporto maschi/femmine tra individui malati. Il 50% dei figli nati da genitore affetto manifestano la stessa malattia.

Ci sono delle anomalie, delle irregolarità. Può succedere che due genitori sani abbiano un figlio malato, in questo caso è una Neo mutazioni. (mutazione de novo a livello dei gameti o nella fase somatica, nella prima fase delle divisioni embrionali). Si può avere un mosaicismo somatico. Altre caratteristiche sono l’espressività variabile e penetranza, si manifesta con gravità e sintomatologie diverse nei vari pazienti. Può anche avere un’insorgenza irregolare, tardiva.

La mutazione de novo può avvenire durante la meiosi a livello delle cellule gametiche parentali (MOSAICISMO GERMINALE) o nelle prime divisioni dello zigote (MOSAICISMO SOMATICO). Lo zigote si divide ma in una certa cellula può avvenire una mutazione, andando a formare un mosaicismo. Il mosaicismo mostra che un gruppo di cellule sarà mutato, se i gameti portano la malattia essa diventa trasmissibile, se fossero sani allora l’individuo rimane sano e così anche la generazione successiva.

Expressività variabile e penetranza

Altri concetti che determinano anomalie sono l’espressività variabile, che dice che i sintomi associati a una malattia possono essere diversi in diversi individui (la malattia è causata dalla stessa alterazione genetica ma si manifesta in maniera diversa con anche gravità diversa), e la penetranza. La penetranza (o penetranza incompleta) risulta quando la malattia non compare in un individuo sebbene il genotipo sia malato. Per esempio la penetranza in alcuni casi, per alcuni geni, è del 100%, porta alla manifestazione della malattia.

Con penetranza si intende anche come percentuale di individui con un dato genotipo (Aa) e che manifestano il carattere associato con quel genotipo. (come concetto non vale solo per la malattia ma per qualsiasi carattere). L’espressività variabile indica anche quanto un individuo manifesti il fenotipo associato ad una certa malattia.

Esempio di espressività variabile

Ci sono malattie come la distrofia miotonica in cui si hanno dei sintomi diversi. Ex. 112 individui con lo stesso genotipo X; 87 presentano la stessa condizione fenotipica di penetranza 78%. L’espressività afferma quali fenotipi possibili associati a un certo genotipo. Ex. Osteogenesi imperfetta: malattia autosomica dominante. Come sintomo presenta la fragilità di ossa, iperlassità dei legamenti, sordità, ecc. Alcuni membri della famiglia possono avere solo alcuni problemi mentre altri sono quasi completamente invalidi.

Camptodattilia: carattere autosomico dominante provocato da un’attaccatura irregolare dei muscoli delle ossa del mignolo. Un’altra complicazione può essere l’insorgenza tardiva, una manifestazione solo dopo che un individuo ha avuto figli. Sindrome di Marfan. Causata da mutazioni nel gene della fibrillina-1, una glicoproteina che viene a costituire le fibre elastiche del tessuto connettivo. Vi sono circa 500 mutazioni diverse e tutte portano alla sindrome.

Sindrome di Marfan

Il tessuto connettivo circonda gli organi dell’organismo quindi è localizzato in punti diversi: espressività variabile. Alcuni sintomi sono: crescita ossea evidente, apertura delle braccia superiore all’altezza. Possono essere alterate delle vie nel pathway della crescita ossea. La sintomatologia più grave risiede nella rottura del connettivo dell’aorta, si possono avere rigonfiamenti fino alla lisi. I pazienti con MFS tendono ad essere alti con dita lunghe e un’elevata elasticità. Il disturbo maggiore risiede nei disturbi cardiovascolari. La dilatazione dell’aorta avviene progressivamente nel tempo. Un altro sintomo può essere la lussazione del cristallino.

Il pedigree è formato da quadrati e cerchi divisi in quadranti in base alla sintomatologia, legate alle varie manifestazioni. Il codice colore indica la gravità e la presenza. Le mutazioni a carico della FBN-1 sono sia puntiformi sia che portano a proteine tronche. Il tessuto connettivo è formato da microfibrille costituite da fibrillina e altre glicoproteine. Nei pazienti si ha un connettivo molto più lasso. Sapendo che le microfibrille catturano il transforming growth factor beta (TGFβ) lo mantengono inattivo. A causa delle mutazioni si avrà una quantità minore di fibrillina e di fibre elastiche all’interno del connettivo e un aumento del TGFβ.

La mutazione avviene sul cromosoma 15. Il TGFβ si genera una forma latente non attiva e viene mantenuta tale da LTBP e con processi enzimatici verranno tagliati punti fino a formare la forma attiva nella parte extracellulare. Nelle condizioni normali la fibrillina tiene solida la LTBP all’interno del connettivo. Se il TGFβ si attiva, viene a legarsi ad un recettore, il recettore TGF receptor che inizia una catena di segnali che arrivano al nucleo attraverso fattori di trascrizione Smad. Smad interagiscono tra di loro ed entrano nel nucleo dove attivano, legandosi al DNA, la trascrizione di alcuni geni.

La via di segnale è attivata in cellule target se il TGFβ è attivo. Quando la fibrillina è tronca o mutata, viene ad essere meno efficiente e il TGFβ è più presente come forma attiva e non riesce ad essere sequestrato nel connettivo. In alcuni tessuti si avrà un’attivazione trascrizionale anomala. Nel caso dell’aorta una delle cause principali è dato dalla iperlassità delle strutture che circondano il vaso sanguigno. Nel caso della crescita scheletrica si ha un’attivazione anomala della parte del TGFβ; la sua iperattivazione contribuisce alla patogenesi della sindrome. Sintomatologia nel polmone, parti dell’epitelio sono entrate in apoptosi.

La stessa mutazione sulla fibrillina può portare a caratteristiche diverse, alcune legate alla funzionalità connettivale, altre all’attivazione del TGF, tra cui la crescita ossea.

Mutazioni e strutture connettivali

21/03 Mutazioni indeboliscono le strutture connettivali e hanno un ruolo importante nelle vie del segnale (TGF beta). TGFbeta, una volta legato al recettore di membrana, viene ad attivare una serie di fattori che sarebbero tenuti nel citoplasma, in presenza del fattore, il pathway si accende e si hanno una serie di fosforilazioni di Smad che attivano la trascrizione di geni. Tra questi nell’osso uno dei target dei smad è Runx2.

Inizialmente si ha un’erosione della matrice all’estremo dell’osso e un accrescimento della parte longilinea. Gli osteoblasti portano alla crescita dell’osso. Questi cicli di proliferazione sono mediati dal TGFbeta che attiva Runx2. La pathway del TGFbeta è attivata maggiormente nelle ossa.

Malattia autosomica recessiva

In questo caso si ha una distinzione anche a livello fenotipico, rispetto agli eterozigoti. Immaginando i genitori con Aa (a gene malattia) avremo che da gameti Aa la prole ha un 25% di probabilità di avere genotipo AA. In questo caso si introduce il concetto di essere portatori sani. Gli eterozigoti non sono malati ma portano il gene malattia.

Le caratteristiche di queste malattie:

• Sono necessarie due copie dell’allele mutato.
• I genitori non sono malati ma un figlio su 4 può esserlo.
• Se entrambi i genitori sono omozigoti, sicuramente tutti i figli saranno malati.
• Maschi e femmine sono ugualmente affetti.

Spesso riguardano geni che codificano per enzimi. Se rimane una copia sana è sufficiente a fornire una quantità di proteina per far avvenire delle reazioni enzimatiche. Nelle autosomiche dominanti non ha un peso il matrimonio tra consanguinei, nel caso delle recessive, se si ha un allele mutato è importante considerare la frequenza di mutazione del gene nella popolazione e anche la presenza di questi matrimoni.

Non si parla di penetranza nelle malattie autosomiche recessive o espressività variabile. Essendo malattie in cui entrambi gli alleli sono mutati si manifestano dai primi anni di vita. Una caratteristica dei pedigree delle recessive è il fatto di avere una orizzontalità della trasmissione, non è presente in tutte le generazioni ma compare in maniera orizzontale.

Esempi di malattie autosomiche recessive

Esempi classici sono quelli dell’albinismo, mancanza di una tirosinasi. Un enzima che nella conversione della tirosina alla melanina viene a mancare. Non converte la DOPA in melanina. Un’altra malattia è la fenilchetonuria, che riguarda la mancanza di un’idrossilasi in grado di trasformare la P-alanina e si ha un accumulo di acido fenilpiruvico. Fibrosi Cistica.

Bisogna considerare la frequenza di questi alleli in tutta la popolazione, in questo caso abbondante nella popolazione europea e americana. 1:2500 caucasici affetti, portatori 1:22/28. Si tratta di una proteina transmembrana che si è visto essere un canale del cloro, una proteina che regola il flusso di cloro ed è dipendente da cAMP. Gli organi maggiormente colpiti sono gli organi interni, tessuti epiteliali come nel caso del polmone. Le cellule epiteliali hanno un lato sul capillare e uno sul lume.

In basso si ha il flusso sanguigno, permeabile agli ioni che derivano dalla circolazione mentre apicalmente è tutto più controllato. Il flusso è regolato da proteine. Gli ioni sodio riescono a passare abbastanza liberamente tra le cellule dell’epitelio, ci sono dei canali. Il passaggio di Na deve essere controbilanciato da uno ione con carica negativa come il cloro. Esso invece viene veicolato attraverso canali come CFTR. Questo flusso di NaCl richiama anche dell’acqua per osmolarità, che finisce nell’epitelio per mantenere una pressione osmotica regolata.

In condizioni normali una soluzione di NaCl passa sal sangue al lume e questo afflusso mantiene una certa fluidità all’interno del lume. Il muco viene ad essere nel lume abbastanza liquido in condizioni normali. Se all’uscita del sodio non si riesce a mantenere il flusso del cloro, allora si avrà che il sodio non si accumula nel lume ma nella cellula stessa. In questo caso nemmeno l’acqua segue il flusso.

Manca un flusso di una soluzione isotonica con NaCl dal flusso sanguigno al lume degli epiteli. Nel lume polmonare si ha un accumulo di muco che non è reso fluido e si accumula, diventando un luogo dove proliferano batteri e altri microorganismi. Questo avviene nei polmoni in modo prevalente, ma anche in altri organi come intestino, dove l’accumulo non permette un adeguato assorbimento delle sostanze nutritizie.

Una delle prime cose che si guarda nei pazienti è il sudore: Test della salinità del sudore. Il sudore risulta salato. Nel caso della fibrosi si ha un gene coinvolto molto grosso, difficile da clonare. Si sa che è sul cromosoma 7 e i primi dati a disposizione che hanno portato al clonaggio e all’individuazione erano derivati da studi su famiglie. Associazione tra la malattia e alcune isoforme di un enzima, paroxinasi, e di altri marcatori sul genoma. Questi primi elementi derivati dagli studi, con marcatori, hanno localizzato una regione del chr 7 ma, essendo ampia, ci è voluto molto tempo.

Metodi di clonaggio

• Clonaggio funzionale: se si sapeva che un enzima era responsabile a una malattia si cercava di arrivare al sequenziamento proteico, ipotizzando dalla sequenza degli aa, una nucleotidica da cui si disegnava una sonda oligonucleotidica che poteva codificare per la proteina. Da lì si andava a ricercare nel genoma la localizzazione.
• Approccio inverso: non si parte dalla funzione della proteina ma si cerca nel DNA il gene. L’informazione iniziale era la posizione, si trovavano dei marcatori sempre presente negli individui marcati. A partire dalla mappatura dei marcatori polimorfici identificarono dei cloni, in vettori, che includevano il marcatore e il gene malattia.

In alcune malattie, come nella distrofia di Duchenne, la malattia è X-linked, non dominante.