Appunti di citogenetica

EX.

Si sono osservate diverse malattie in una popolazione di 14'000 individui.

Mettendo una soglia di P-value.

Nel caso dell’ipertensione si è visto che non esiste nella popolazione, andando a

genotipizzare SNP, una correlazione tra SNP e malattia. Andando a vedere altre

malattie hanno trovato dati significativi.

Per il diabete di tipo 2 si vede che:

Crom 10 TCF7L2 transcription factor 7-like 2

Crom 16 FTO fat mass and obesity associated

Crom 6 CDKAL1 = CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like

Si ricontrollano in un altro gruppo di pazienti andando a rianalizzare gli SNP rivelati significative per vedere se

effettivamente sono dati corretti.

Il gruppo di malattie multifattoriali hanno una frequenza alta nella popolazione ma sono dovute al

 contributo di diverse versioni alleliche di suscettibilità, hanno una penetranza difficile da definire perché è

l’interazione tra i loci che determina lo scaturire o meno della malattia.

EPIGENETICA

Oltre al ruolo strutturale si ha un ruolo funzionale, regolando le proteine che avvolgono il DNA si può avere una

variazione nel fenotipo.

d

Epigenetica: efinita come lo studio dei meccanismi responsabili di cambiamenti ereditabili nelle funzioni del

genoma che non richiedono la modificazione nella sequenza del DNA. Sono eventi che influiscono sul carattere ma

non sono necessariamente mutazioni, possono essere cambiamenti ereditabili. Solitamente si associa la mutazione

sul DNA con carattere ereditabile ma alcune modificazioni sul DNA possono essere tramandati.

L’epigenetica ci aiuta a spiegare come da un unico genoma, identico in tutte

le cellule, si può avere una interpretazione diversa.

Diversi epigenomi permettono di leggere in maniera diversa uno stesso

genoma.

Gli epigenomi possono essere modificati molto più semplicemente rispetto al

genoma, si può revertire e cambiare il destino di una cellula per prevenire la

manifestazione di un gene malattia.

13/04

20/04

Esiste un meccanismo che porta all’inattivazione, basato su due lunghi RNA che sono trascritti solo suk cromosoma

X inattivato dallo stesso gene in direzione opposta viene trascritto un altro RNA che invece sarà trascritto sul

cromosoma che viene mantenuto attivo.

Hp: RNA Xist una volta trascritti riescono a reclutare i complessi polycomb che appongono un marchio repressivo,

avviando una serie di modifiche epigenetiche che spengono l’intero cromosoma.

Come mai da una parte il si trascrive Xist?

Ogni cellula nel processo in cui si stabilisce l’inattivazione, si ha inattivazione casuale dell X materno o paterno.

L’ipotesi è che ci sia una regolazione, nelle staminali embrionali si ha l’espressione di fattori che mantengono la

staminalità e non c’è una trascrizione preferenziale di xist, ma durante il differenziamento ci sono proteine che

promuovono in modo specifico la trascrizione di Xist.

Nel momento in cui Xist viene trascritto riesce a

reclutare il complesso PRC2 per una sequenza che ha

sul suo RNA. Forma un complesso ribonucleico che

porta alla repressione del gene. Esso ha un sito di binding attraverso il fattore trascrizionale YY1 sul gene stesso di

Xist, che diventa un punto di nucleazione dove inizia la repressione.

L’X che diventerà inattivo avrà una marcata espressione di Xist.

RNA di Xist vanno a partire dal punto di nucleazione dove inizia la repressione si espande poi alle estremità,

coprendo questo X che deve essere inattivato e da diversi successivi processi di inattivazione che passano attraverso

modifiche epigenetiche mediate da diversi complessi.

Durante le prime fasi di differenziamento si ha la nuova inattivazione random di uno o dell’altro X, in vitro si può

ricapitolare la reazione dove mandando le cellule embrionali a differenziare si ha un inizio della inattivazione

mediato dalla trascrizione di Xist e si verifica la presenza di diversi complessi come Polycomb che portano a

modifiche istoniche su H3/4/2. I geni che si trovano su uno delle due X vengono repressi.

All’inizio nelle prime fasi della formazione dello zigote si ha l’inattivazione selettiva solo dell’X paterno, nella

formazione della blastocisti si ha l’inattivazione random.

Alcune malattie che vedono malattie cromosomiche su X non sono così devastanti perché c’è un sistema di conta

sul sistema X tale per cui in una configurazione (ex XXX) la cellula riconosce che ci sono due X soprannumerali e

riesce a inattivarle.

Ci saranno delle parti del cromosoma X che dovranno essere attive, ci sono geni conservati sia sull’X che su Y.

Alcune regioni rimangono attive con regolazione fine. ci sono regioni pseudoautosomiche che devono essere

risparmiate dal processo di inattivazione.

Ci sono zone ripetute nei nostri geni e in regioni intergeniche.

Molte delle malattie viste sono dovute da una mutazione nella regione codificanti (ex fibrosi cistica). Possono

esserci frame shift o delezioni, mutazioni.

Queste mutazioni portano alla perdita della funzione della proteina.

Si sono però identificate malattie in cui non si osservava una ereditarietà mendeliana classica e con il tempo,

andando a sequenziare, si è visto che in realtà in un certo gruppo di malattie si vedeva l’espansione di alcune

sequenze, in particolare di alcune triplette.

Queste unità ripetute sperse nel genoma possono andare incontro a espansione. Quando iniziano a espandersi

diventano instabili e raggiungono un numero elevato, se sono all’interno di un gene regolatore finiscono per essere

causa di una malattia. da espansione di triplette

malattie

Non vi è una regola sul posizionamento di queste triplette, essendo microsatelliti si trovano ovunque nel genoma.

possono essere in zone non codificanti ma regolatrici, come 5’UTR e 3’UTR (non vengono tradotte ma vengono

trascritte).

Diverse malattie vedono l’espansione negli esoni e in questo caso, trattandosi di una tripletta all’interno dell’esone

porterà alla presenza di tratti di amminoacidi tradotti sovra-numerali. Si tratta di solito di glutammine.

C’è un’ampia eterogeneità nell’unità che vengono ripetute.

Nel caso in cui si aumentino tratti di glutammina si hanno nuove funzioni della proteina e perdita di quelle della

proteina wt. Queste espansioni sono molto dinamiche e quando raggiungono un certo livello si espandono in

maniera esponenziale, sono eventi che possono avvenire in tessuti germinali e somatici.

Possono verificarsi nello stesso tessuto ma in maniera diversa. Più espansioni si osservano, più si ha una severità

della malattia.

La severità si traduce spesso sia in una gravità di sintomi sia in un processo definito di anticipazione. Da una

generazione all’altra la malattia si manifesta prima.

Malattia di Huntington: malattia in cui si verifica un’anticipazione.

Le regioni con sequenze ripetute possono dare strutture del DNA anomale, ipotizzando il DNA come una doppia

elica, quando si hanno regioni ripetute è possibile che ci siano strutture alternative come eliche intramolecolari,

bolle,..

La presenza di sequenze ripetute porta alla formazione di strutture alternative del DNA. Le strutture si formano

quando il DNA viene duplicato, quando è presente un’apertura della doppia elica.

Durante la replicazione la presenza di queste unità ripetute porta a uno sbagliato allineamento delle basi che porta

a uno sbagliato appaiamento.

L’elevato tasso di mutazione nei microsatelliti è dovuto a scivolamento della polimerasi in replicazione. La

mutazione avviene per aumento o diminuzione di una singola unità ripetitiva.

Da una parte bisogna “fare i conti” con il sistema di riparo del DNA. Una struttura alternativa può essere

riconosciuta ed esiste un sistema di riconoscimento del danno che potrebbe cercare di ripararla. Se utilizza il

filamento alternativo come stampo, stabilizzerebbe l’errore e finirebbe per neosintetizzare un complemento che

porta all’espansione.

Il complesso di mismatch repair---

Nella replicazione ci può essere questo scivolamento, ma le strutture alternative si possono formare anche quando

si ha un riparo del DNA o nella trascrizione. Quando infatti la polimerasi apre la doppia elica, i due strand non sono

uniti ma si hanno momenti in cui si possono formare bolle o harpin, laddove ci sono sequenze ripetute.

La presenza di sistemi di riparo del danno possono sortire effetti diversi.

Proprio perché possiamo avere cellule che replicano e cellule che non replicano con momenti di instabilità, le

espansioni possono avvenire sia nella mitosi, quindi nei gameti, sia durante lo sviluppo per via somatica. Nell’ultimo

caso si avranno pattern diversi in diversi tessuti.

L’espansioni e le contrazioni avvengono più spesso se sono ereditate dal padre.

Cosa succede con l’espansione?

I. Le triplette espandono negli esoni e finiscono a dare tratti di poliglutammine che sono in sovrannumero

rispetto al wt. In questo caso spesso si osserva una gain of function perché i tratti con le glutammine

perdono le interazioni con alcune proteine e se ne acquistano altre. Ci sono diverse caratteristiche della

proteina formata che portano all’alterazione della funzione classica. Un meccanismo comune è che non

riesce ad essere completamente degradata all’interno della cellula.

Nel caso della malattia di Huntington proteina di 348kDA, in condizioni normali si ha un numero di triplette

inferiorire a 36, quindi tra le 11 e35 unità ripetute. Ci sono processi di proteolisi che riescono ad eliminare la

proteina, ma nel momento in cui ci sono regioni amplificate di polyQ, alcuni enzimi riescono a tagliare la

proteina ma non vengono mai tagliate le regioni con polyQ che danno aggregati citotossici.

Il gene mutato ha un numero di replicazioni della tripletta aumentato. una delle conseguenze è l’anomala



degradazione proteolitica della hungtingtonina

Ci sono diverse funzioni che vengono alterate dalle unità ripetute.

Come si diagnosticano le malattie? Se hanno un numero variabile di ripetizione, dovremmo trovare un modo per

contare le ripetizioni. In base al prodotto di amplificazione si deduce quante unità ripetute si hanno. In condizioni

normali si ha un amplificato di 300 basi, se invece ne dovesse avere 600 sarebbe anormale.

Un’altra strategia è il southern blot. Utilizzando una sonda radioattiva si misura la lunghezza della banda.

Distrofia miotonica: non si ha un’espansione in un esone ma in regioni del 5’UTR o regioni introniche. la ripetizione

è su un gene diverso in un introne, non è ripetuto un trinucleotide. Si ha una configurazione completamente

diversa. Era importante la presenza di RNA trascritti più lunghi del dovuto. In questo caso non è la proteina ad

avere tratti a