Chimica fisica - dicroismo circolare

Misure spettroscopiche di dicroismo circolare dei peptidi KYN e MET

Introduzione alla luce e polarizzazione

La luce può essere descritta come un'onda elettromagnetica composta dai vettori campo elettrico, E, e magnetico, H, perpendicolari tra loro che oscillano in fase in tutte le direzioni normali a quella di propagazione. La luce piano-polarizzata o linearmente polarizzata si ottiene facendo passare la luce non polarizzata attraverso un polarizzatore, ad esempio uno schermo Polaroid o un prisma di Nicol, che lascia passare solo le componenti del campo elettrico che sono parallele all’asse del polarizzatore. Il piano di polarizzazione coincide con quello individuato dal vettore elettrico e dalla direzione di propagazione. Nella luce polarizzata sul piano, il vettore campo elettrico E mantiene costante la sua direzione che è perpendicolare alla direzione di propagazione ed ha un'ampiezza che varia in modo sinusoidale nel tempo e lungo la direzione di propagazione. Si osserva sperimentalmente che la velocità con cui si propaga la luce in un mezzo trasparente è minore di quella nel vuoto.

Indice di rifrazione

Il parametro che indica di quanto è rallentata la velocità di propagazione della luce nel mezzo rispetto a quella nel vuoto è l'indice di rifrazione definito come:

dove c è la velocità della luce nel vuoto e v è la velocità della luce nel mezzo. L'indice di rifrazione di un mezzo non è costante, ma dipende dalla lunghezza d'onda della radiazione utilizzata, e un grafico dell'indice di rifrazione in funzione di λ mostra una curva di dispersione che indica in quale modo un certo materiale disperde luce di differente lunghezza d'onda.

Polarizzazione circolare

Un'onda elettromagnetica si dice polarizzata circolarmente quando il suo vettore campo elettrico E ruota attorno ad un asse di propagazione z mantenendo costante il modulo e descrivendo un giro in un periodo T, cioè in una λ. Il vettore E descrive un'elica che è destrogira per la luce polarizzata circolarmente destra, ed è levogira nell'altro caso. Secondo la convenzione, la polarizzazione destrogira si ha quando guardando verso la sorgente, il vettore campo elettrico ruota in senso orario, viceversa per la polarizzazione levogira.

Luce polarizzata linearmente e mezzo otticamente attivo

La luce polarizzata linearmente può essere decomposta in due onde polarizzate circolarmente in fase tra loro, una destrogira e l'altra levogira, i cui vettori elettrici hanno ampiezza pari alla metà della radiazione risultante.

Effetti sul passaggio attraverso un mezzo otticamente attivo

Quando la luce polarizzata linearmente attraversa un mezzo otticamente attivo, i vettori campo elettrico delle sue componenti circolarmente polarizzate, una destrogira, E_R e l'altra levogira, E_L, ruotano con velocità differenti perché l’indice di rifrazione per l’onda circolarmente polarizzata destra, n_R, è differente da quello per l’onda circolarmente polarizzata sinistra, n_L. Questo effetto provoca uno sfasamento delle due componenti circolarmente polarizzate dell’onda linearmente polarizzata, che ricombinandosi danno luogo ad una radiazione che è ancora piano polarizzata ma nella quale il piano di polarizzazione risulta ruotato rispetto alla direzione della luce incidente. L’angolo di rotazione del piano di polarizzazione è dato, in gradi, dall'equazione di Fresnel dove l è il cammino ottico espresso nelle stesse unità di misura della lunghezza d’onda λ della luce nel vuoto.

Dispersione ottica rotatoria (ORD)

La rotazione ottica, che dipende dall’indice di rifrazione, deve variare con la lunghezza d’onda. Si indica con ORD, dispersione ottica rotatoria, la variazione della rotazione ottica con la lunghezza d’onda. Lo strumento che misura le curve ORD è detto spettropolarimetro e differisce dal polarimetro in quanto quest’ultimo usa una sola lunghezza d’onda.

Assorbimento e dicroismo circolare

Se la radiazione incidente ha una lunghezza d’onda che cade in una regione di assorbimento del campione, oltre alla rotazione del piano di polarizzazione, si avrà una differenza di assorbimento della luce polarizzata circolarmente destra e sinistra. Per la luce polarizzata circolarmente sinistra e destra si definiscono i rispettivi coefficienti molari di assorbimento ε_L ed ε_R. Il dicroismo circolare molare è definito dalla differenza tra i coefficienti molari di assorbimento per i due tipi di luce polarizzata circolarmente:

Tutti gli strumenti commerciali di CD misurano ΔA = (A_L - A_R) che è poi trasformato in Δε dall’equazione precedente. Siccome l’assorbanza per le due componenti circolarmente polarizzate è diversa, ciascuna componente rimane polarizzata circolarmente, ma il raggio della circonferenza tracciata dal vettore elettrico di ciascuna componente è diverso. Pertanto l’ampiezza dei vettori elettrici E_R e E_L non risulterà più uguale in seguito all’assorbimento, per cui quando queste due componenti si andranno a ricombinare insieme, daranno luogo ad una luce polarizzata ellitticamente.

Descrizione dell'ellisse di polarizzazione

Dopo il passaggio in un campione otticamente attivo, il vettore elettrico E somma delle due componenti E_R e E_L non si trova in un piano, ma su un’ellisse, considerando la proiezione di E sul piano xy perpendicolare alla direzione di propagazione. Il vettore elettrico dell’onda in uscita dal mezzo, che è la somma delle due componenti E_R e E_L, a causa del dicroismo circolare non sta più sul piano di polarizzazione iniziale ma descrive un’ellisse, il cui asse maggiore è ruotato rispetto al piano di polarizzazione della radiazione in ingresso di un angolo dato dall’equazione di Fresnel, a causa della birifrangenza circolare, che è definita come la differenza tra gli indici di rifrazione sinistro e destro (n_L - n_R).

Ellitticità e dicroismo circolare

Il rapporto tra l’asse minore e l’asse maggiore dell’ellisse descritta dal vettore polarizzazione dà la tangente dell’angolo di ellitticità θ che rappresenta una misura del dicroismo circolare:

L'ellitticità θ dipende dalla lunghezza d'onda, dalla temperatura, dalla lunghezza del cammino ottico, dalla purezza enantiomerica del campione e dalla sua concentrazione e infine dalla natura del solvente. Per poter comparare i risultati tra due diverse sostanze, è necessario renderli indipendenti dalla concentrazione ricorrendo all’ellitticità specifica dove θ è l’angolo di ellitticità in gradi, c è la concentrazione in g/mL, l è il cammino ottico in dm.

Ellitticità specifica molare e ellitticità molare media per residuo

Da θ, normalizzando per la concentrazione della soluzione espressa in molarità e per il cammino ottico della cella espresso in centimetri, si ricava l’ellitticità specifica molare:

dove M indica il peso molecolare della sostanza in esame. Per i peptidi e le proteine è più conveniente esprimere i dati in termini di ellitticità molare media per residuo [θ]_MRW, calcolata dividendo l’ellitticità per la concentrazione molare (usando come peso molecolare quello medio per residuo della proteina) e per la lunghezza della cella in cm.

dove θ è espressa in gradi, c in g/mL, l è il cammino ottico in cm e MRW è il peso molecolare medio per residuo, ottenuto dividendo il peso molecolare della proteina o peptide considerato per il numero di amminoacidi che li compongono. Il valore [θ] è espresso in gradi·cm⁻¹·dmol⁻¹·res⁻¹.

Curve CD e assorbimento elettronico

Riportando l’ellitticità in mdeg in funzione della lunghezza d’onda o della frequenza della radiazione si ottiene una curva CD, caratterizzata da bande positive o negative a seconda del tipo di cromoforo in esame. Le bande di assorbimento elettronico di una molecola chirale possono presentare valori di ε_L − ε_R positivi o negativi; ciò dipende da quale delle due radiazioni polarizzate circolarmente è assorbita in modo maggiore. Il segno e l’intensità delle bande...