Che materia stai cercando?

Chimica fisica - dicroismo circolare

Appunti di Chimica per l’esame della professoressa Lombardi. Gli argomenti trattati sono i seguenti: elletticità, chiralità, effetto Cotton, studio delle proteine, metalloproteine, l'onda polarizzata (a) destro-circolarmente e (b) levo-circolarmente, ORD, dispersione ottica rotatoria.

Esame di Chimica fisica docente Prof. A. Lombardi

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

Un parametro che determina la possibilità che in una banda di assorbimento si generi

attività ottica, analogo alla forza di dipolo elettrico D per l’intensità di

0m

assorbimento, è la forza rotazionale R , definita dall’equazione

0m

dove Im( ) indica che si deve prendere la parte immaginaria del numero complesso

contenuto entro parentesi.

Siccome l’intensità nel CD dipende dal prodotto dei due momenti elettrico e

magnetico, la transizione elettronica deve essere accompagnata sia da una traslazione

μ

di carica misurata dal momento di dipolo elettrico della transizione , che da

0m

una rotazione di carica che è misurata dal momento di dipolo magnetico della

m

transizione . Pertanto per avere attività ottica gli elettroni durante una

m0

transizione si devono ridistribuire percorrendo un cammino elicoidale.

Poiché l’operatore momento lineare è immaginario, il momento di dipolo magnetico

m

della transizione è anch’esso immaginario. Comunque R è la parte

0m

m0

immaginaria di un prodotto tra un numero reale e un numero immaginario. Quindi,

R è un numero reale perché è una quantità fisicamente osservabile.

0m

La forza rotazionale per scopi pratici può anche essere espressa dalla seguente

relazione

μ m

dove e sono i moduli reali dei momenti elettrico e magnetico della

0m m0

μ , m

( ⃗ )

transizione e è l’angolo tra i due vettori.

0m m0

μ m

Il fatto che i due vettori e siano entrambi diversi da 0 è condizione

0m m0

necessaria ma non sufficiente affinché ci sia attività ottica: l’esistenza di dicroismo

μ m

circolare richiede anche che i due vettori e non siano ortogonali in

0m m0

quanto la forza rotazionale dipende dal coseno dell’angolo tra i due vettori.

m

Pertanto per avere attività ottica il momento di dipolo magnetico deve

m0 μ

possedere almeno una componente parallela al momento di dipolo elettrico ,

0m

per cui la luce deve indurre una circolazione di carica elicoidale intorno alla

μ

direzione di .

0m

Si verifica questa situazione solo quando una molecola è asimmetrica altrimenti non

ci può essere una direzione elicoidale preferita.

La forza rotazionale R può avere sia segno positivo che segno negativo in base

0m μ m

all’ampiezza dell’angolo tra i due vettori e ; per questo motivo viene

0m m0

definita una quantità pseudoscalare perché non è caratterizzata soltanto dal modulo.

Le quantità pseudoscalari non cambiano segno se vengono applicate le operazioni di

simmetria primarie, che sono le rotazioni pure di qualsiasi ordine C , mentre

n

cambiano segno se vengono applicate le operazioni di simmetria secondarie, che sono

le rotazioni improprie, dette anche rotoriflessioni, di qualsiasi ordine S .

n

La forza rotazionale si annulla per tutte le transizioni elettroniche se la molecola

appartiene ad un gruppo di punto che ha tra i suoi elementi una o più rotoriflessioni

di qualsiasi ordine. Come detto precedentemente, quando vengono applicate rotazioni

improprie, la forza rotazionale cambia segno, per cui in una regione di spazio assume

valori positivi che vengono bilanciati esattamente dai valori negativi assunti nella

regione di spazio complementare.

Pertanto molecole che appartengono a gruppi di punto che possiedono tra gli elementi

almeno un’operazione di rotoriflessione, non mostrano attività ottica, per cui sono

achirali.

In una molecola achirale la ridistribuzione di carica netta è sempre planare.

μ m μ

⃗ ⃗

Normalmente è lineare (con ≠ 0, = 0) o circolare (con = 0,

0m 0m

m0

μ

m m

⃗ ⃗

≠ 0), ma non ha mai entrambi ed diversi da 0. Quest’ultimo

0m

m0 m0

caso è proprio delle molecole chirali, dove gli elettroni durante una transizione si

distribuiscono secondo un’elica.

Per discriminare le due componenti circolarmente polarizzate della luce piano-

polarizzata che non sono sovrapponibili, una molecola deve essere chirale, come sono

la maggior parte delle molecole biologiche.

Studio delle proteine attraverso il dicroismo circolare

Laddove si verifica assorbimento della radiazione, si ottiene un segnale CD; per cui

ad ogni caratteristica strutturale di una molecola, corrisponde una specifica banda

spettrale, facilmente assegnabile.

L’applicazione principale che riguarda le tecniche CD è lo studio di proteine.

I cromofori di interesse sono:

legame peptidico (circa 210 nm);

● amminoacidi aromatici (range di assorbimento: 260-320 nm);

● ponti disolfurici (assorbono debolmente intorno ai 260 nm).

L’assorbimento del cromoforo peptidico ha origine negli orbitali 2p degli atomi di C,

N e O, che combinandosi, danno vita a 3 orbitali molecolari aventi simmetria π;

inoltre sull’atomo di ossigeno è localizzato un orbitale 2p di non-legame, n,

perpendicolare ai precedenti e contenente una coppia di elettroni spaiati.

+

π π + 3*

n π

1 2

+ -

­

+ - +

Le transizioni a più bassa energia e tipicamente

*

osservabili sono la n →π (~ 220 nm), che coinvolge gli

3

elettroni di non legame dell’atomo di ossigeno del

*

gruppo carbonilico, e la π → π (~ 190 nm), che

2 3

coinvolge invece gli elettroni π di legame del CO.

Le catene laterali aromatiche dei residui di Fenilalanina,

Tirosina e Triptofano, come detto, danno segnali sia nel

vicino UV che nella zona di assorbimento del cromoforo peptidico. Questa zona

spettrale è di particolare importanza per lo studio delle variazioni conformazionali

delle proteine; in genere l’immobilizzazione di un cromoforo comporta un aumento

di attività ottica, e dunque effetti Cotton molto più

forti.

Il cromoforo disolfurico, intrinsecamente chirale, è

molto importante dal punto di vista chiroottico dal

momento che, nonostante assorba debolmente, dà

origine ad effetti Cotton molto intensi.

Inoltre si possono ottenere segnali CD da ligandi che

non hanno chiralità instrinseca ma la acquisiscono dato

l’intorno chimico asimmetrico.

Uno dei maggiori impieghi della spettroscopia CD è stimare la composizione in una

proteina folded delle diverse strutture secondarie. Le principali sono: α-elica, β-

sheet, β-turn e random-coil.

Per un’ α-elica composta da n cromofori, ci si aspetta n modi di accoppiamento dei

*

momento di dipolo elettrico associati alle transizioni π→π . Nonostante ciò solo tre

di questi modi di accoppiamento danno una forza di dipolo e una forza rotazionale

contemporaneamente diverse da zero.

Di questi tre uno si definisce “parallelo”, poiché genera un vettore μ diretto lungo

l’asse dell’ α-elica, mentre gli altri due si dicono “perpendicolari” dal momento che il

vettore μ è diretto normalmente

all’asse dell’ α-elica.

*

La transizione π→π risulta così

sdoppiata in due componenti, una

a ~ 190 nm, relativa agli

accoppiamenti perpendicolari, e

l’altra a ~205 nm , relativa

all’accoppiamento parallelo.

L’accoppiamento parallelo

produce un effetto Cotton

negativo, mentre quelli

perpendicolari generano effetti

Cotton positivi. Calcoli hanno

dimostrato che la banda ║ cade a

energie inferiori rispetto alla

banda ┴ .

Lo spettro CD della

conformazione β antiparallela è

caratterizzato da una banda

negativa a 216-217 nm,

corrispondente alla transizione Linea continua,α-elica; lunga linea tratteggiata, anti-

*

n→ π , e da una banda positiva a parallel β-sheet ; linea punteggiata, type I β-turn; corta

*

195 nm dovuta alla transizione π→ π . linea tratteggiata, random coil.

La struttura disordinata, random-coil, è caratterizzata da una banda positiva molto

debole a ~ 218 nm e da una banda negativa molto intensa a ~ 197 nm, corrispondenti

* *

rispettivamente alle transizioni n→ π e π→ π .

Infine abbiamo la conformazione β-turn che può essere di tipo I,II e III; queste

presentano un minimo CD tra 225 e 230 nm e un massimo tra 200 e 210 nm.

A meno che in una proteina non siano presenti un numero elevato di residui

amminoacidici aromatici, l’attività ottica nella regione dello spettro che va da 190 a

230 nm, è dominata dallo scheletro peptidico. Tra l’altro è stato dimostrato che,

almeno qualitativamente, gli amminoacidi alifatici non interferiscono con gli spettri

CD in questa regione. Dunque in prima approssimazione si può pensare che gli spettri

CD di una proteina siano il risultato di una combinazione lineare delle strutture

secondarie α-elicoidale, β-sheet , β-turn e random-coil.

Si assume che le proprietà ottiche delle conformazioni secondarie più importanti in

una proteina, siano additive; per cui si può scrivere:

dove Χ(λ) è il CD medio per residuo, f è la frazione della i-esima componente e Χ (λ)

i i

è il corrispondente valore di CD per quella componente.

Considerate le diverse strutture secondarie, si ottiene:

Note le Χ(λ) a diverse frequenze (in questo caso minimo quattro), si possono usare

come base per risolvere il sistema e trovare i diversi coefficienti f che daranno la

i

composizione della proteina rispetto alle diverse strutture secondarie.

Per una serie di motivi risulta più comodo e preciso derivare questi contributi da

spettri standard di una serie di proteine modello (naturali o sintetiche) di cui è nota la

struttura ai raggi X.

Il motivo principale è che, mentre il contributo standard dell’ α-elica è più o meno

costante passando da proteina a proteina, quelli delle altre strutture sono invece molto

variabili. Quindi una volta inseriti i contributi standard nell’equazione appena vista,

vengono determinati i diversi valori di Χ(λ), impiegati poi per calcolare, attraverso un

apposito “fitting” dello spettro CD, i diversi coefficienti f , f , f e f della struttura

H β t R

incognita.

Quindi data la variabilità dei contributi f , f e f , è importante scegliere in modo

β t R

appropriato il set di proteine “base” da utilizzare per il calcolo.

Se il set di base è scelto accuratamente, considerato il fatto che può essere

ulteriormente ottimizzato, la stima ottenuta è spesso molto buona.

Proteina Raggi X CD CD

(base:poli-L-lys) (base:altre proteine)

% α β R % α β R % α β R

Carbossipeptidasi 23 18 59 13 31 56 26 18 56

α-Chimotripsina 8 22 70 12 23 65 20 20 60

L’importanza del set di proteine di base da utilizzare risulta lampante dai dati riportati

in questa tabella, in cui le varie percentuali di α-elica, β-sheet e random-coil della

Carbossipeptidasi e dell’ α-Chimotripsina, calcolate con il metodo appena illustrato

vengono confrontate con quelle ricavate mediante diffrazione ai raggi X.

Mediante l’analisi di spettri CD è possibile ottenere informazioni anche sulla struttura

terziaria di proteine.

Bande CD , come già detto, vengono osservate nel vicino UV (260-320 nm) quando

una proteina nel suo stato nativo possiede residui amminoacidici aromatici ( Trp, Tyr

e Phe). Lo spettro in questa regione dipende, oltre che dal numero di questi residui ,

anche dalla loro mobilità, dalla natura dell’intorno chimico (presenza di legami a

idrogeno, gruppi polari e polarizzabili) e dalla disposizione spaziale che assumono

nella proteina.

Lo spettro near-UV CD è dunque molto sensibile alla conformazione di una proteina

e può essere utilizzato per valutarne la stabilità termica.

Inoltre, binding di ligandi possono causare variazioni conformazionali in una

proteina, ancora una volta analizzabili mediante l’acquisizione di spettri CD.

Lo spettrofotometro CD

In linea di principio, per acquisire uno spettro CD, occorrerebbero due sorgenti per le

due radiazioni, una polarizzata circolarmente verso destra e l’altra verso sinistra, con

i rispettivi monocromatori. Nella pratica si utilizza invece luce polarizzata

linearmente, che è la somma delle due componenti polarizzate circolarmente.

La radiazione viene prodotta da una lampada a Xeno molto potente (150-450 W) e

che richiede dunque un raffreddamento continuo da parte di un flusso di azoto, che

per altro serve anche ad impedire che la radiazone UV produca ozono dall’ossigeno

atmosferico.

La radiazione attraversa poi il

monocromatore e successivamente il

filtro polarizzatore, per arrivare infine

al modulatore elettro-ottico,

tipicamente un cristallo di quarzo

pizoelettrico accoppiato ad un sottile

strato di materiale isotropo (silice

fusa), capace di fare passare la luce

polarizzata circolarmente verso destra

o sinistra in modo alternato a seconda

del campo elettrico a cui è sottoposto.

Il campione sarà dunque attraversato

alternativamente dalle componenti

destra o sinistra.

Per ultimo vi è il fotomomoltiplicatore che ha la funzione di misurare l’intensità della

luce trasmessa dal campione; il segnale uscente avrà un’intensità oscillante, e

l’ampiezza di questa oscillazione permette di misurare il dicroismo circolare.

Miniaturized metalloproteins

La miniaturizzazione è un processo che ha lo scopo di riprodurre sistemi

macromolecolari naturali, di cui è nota la struttura cristallografica, mediante modelli

sintetici.

È necessario definire (i) il tipo e del numero di costituenti da assemblare, (ii) la

struttura da ricostruire e (iii)la funzione da riprodurre.

Le metalloproteine risultano particolarmente idonee alla

miniaturizzazione.

Il processo applicato alle rubredossine ha generato una

classe di metalloproteine modello, che vanno sotto il nome

di METP (Miniaturized Electron Transfer Protein), molecole

redox attive. La struttura cristallografica della Rubredossina

(Rd) di Desulfovibrio Vulgaris è stata scelta come modello

per la costruzione di un sito di legame tetraedrico per il

ferro.

Il METP_click in questione è il dimero di due frammenti,

KYN (costituito da 12 amminoacidi) e ZID (costituito da 11

amminoacidi).

KYN -Ac-Pra-CTKCGAN-Aib-SEI-NH 2

ZID -Ac-CTKCGAN-Lys-6-AHA-SEI-NH 2

dove Pra sta per propargilglicina, Aib sta per acido α-amminoisobutirrico, 6-AHA sta

per acido 6-azido-esanoico.

Quindi il peptide KYN (da alkynic) è il frammento avente una funzione terminale

alchinica, mentre ZID (da azidic) possiede una funzione terminale azidica.

I due frammenti sono analoghi della sequenza 39-49 della Rubredossina (Rd) di

Desulfovibrio Vulgaris, presa come riferimento.

Come si evince dalla sequenza amminoacidica, ognuno dei due frammenti possiede

due cisteine, i cui atomi di zolfo rappresentano i ligandi del ferro nel sito tetraedrico.

ZID e KYN sono stati assemblati mediante una reazione click chemistry.

La click chemistry, forse traducibile come la “chimica a scatto”, è una filosofia della

chimica moderna introdotta all’inizio di questo millennio da Karl Barry Sharpless

(premio Nobel per la chimica nel 2001), distinguendo una categoria di sintesi

molecolari condotte in maniera rapida ed efficace grazie all’impiego di quantità

minime di reagenti.

La click chemistry si ispira alle reazioni chimiche che avvengono in natura e che si

verificano con l’unione di piccole unità modulari, infatti il suo modus operandi imita

le peculiarità delle sintesi biologiche approfittando dei vantaggi che ciò comporta. I

requisiti necessari affinché una reazione rientri nella categoria sopracitata sono

numerosi e non aggirabili: devono essere reazioni modulari e di ampia portata,

devono fornire alte rese, generare sottoprodotti a basso impatto ambientale e inoltre

devono essere stereospecifiche.

Acquisizione degli spettri

KYN e ZID ossidati

Lo scopo di questo lavoro è quello di analizzare le proprietà spettroscopiche di due

peptidi ossidati singolarmente e del complesso dimerico METP_click.

Si è scelto di analizzare le due catene peptidiche ossidate perché sono quelle

utilizzate per condurre la reazione di click chemistry.

I due frammenti peptidici sono stati ossidati singolarmente per evitare che si formino

ponti disolfurici inter- e intramolecolari, che porterebbero ad una grande eterogeneità

del prodotto.

ZID è risultato insolubile nei comuni solventi organici, ma solubile in DMSO

(dimetilsolfossido), non utilizzabile però nel range di lunghezze d’onda di nostro

interesse (190-260 nm).

È stato preparato uno stock di soluzione acquosa di KYN (1244.4 u.m.a) a

concentrazione di 1,19 mg /mL . Dal momento che in cella la concentrazione del

-5

peptide deve essere dell’ordine di 10 M, lo stock è stato diluito 80 volte in un

matraccio tarato.

Le misure di dicroismo circolare sono state eseguite con uno spettrofotometro

JASCO 715. L’intervallo di lunghezza d’onda esplorato è stato 190-260 nm.

Gli spettri CD sono stati registrati con un’ampiezza di banda di 1.0 nm, con

una risoluzione di 0,2 nm, ad una velocità di scansione di 20 nm/min; inoltre la linea

di base è stata corretta sottraendo lo spettro della soluzione tampone. Come primo

tampone è stato utilizzato il MOPS (acido 3-(N-morfolin)propansulfonico) 0,1 M, ma

acquisendo lo spettro del bianco utilizzando una cella in quarzo da 1 cm, è risultato

inadeguato perché interferisce con l’assorbimento del campione. Nonostante sia stato

ridotto il cammino ottico prima a 0,5 cm e poi a 0,2 cm, si è verificata comunque

interferenza. Il MOPS pertanto è stato scartato come tampone da utilizzare. Lo

spettro successivo è stato acquisito in una cella di quarzo da 0,2 cm utilizzando come

tampone NaP (fosfato di sodio) pH 7.0 10 mM in acqua e KYN a concentrazione 5,98

-5

10 M considerando il volume finale della cella di 400 μL.

.


PAGINE

19

PESO

687.76 KB

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in chimica
SSD:
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher chimichella di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Chimica fisica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Napoli Federico II - Unina o del prof Lombardi Angelina.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Corso di laurea in chimica

Chimica - Formulario
Esercitazione
Cristallizzazione - Chimica organica
Appunto
Formazione sali - Mappa concettuale
Appunto
Chimica organica - NMR, spettroscopia di risonanza magnetica nucleare
Appunto