Chimica farmaceutica - antracicline

Analisi della 3'-epidaunorubicina

HOOCH O OH3 NH2H C O3 3'OH

Fig.2: 3'-epidaunorubicina

Tale modificazione però non è clinicamente significativa poiché la 3'-epidaunorubicina è meno attiva dei lead compounds. Tuttavia da questi dati si può dedurre che la daunosamina è la parte di molecola5 .che interagisce con il DNA fino alla posizione -2.

Inoltre si è visto che un analogo privo di sostituenti in posizione 3' è in grado di stimolare cleavage tanto alle sequenze preferite dai farmaci progenitori quanto a quella preferita dalla 3'-epidaunorubicina. Quindi è proprio l'amminogruppo dello zucchero che, in base al suo orientamento, stabilisce il sito di cleavage.

D'altra parte è stato dimostrato che il sostituente al 3' non è indispensabile all'attività del farmaco, dal momento che composti non sostituiti (come quello rappresentato in figura 3) mantengono la medesima attività degli

analoghi6 .sostituiti 5 OO OH 9 OHOO OHCH O3H N2 3'Fig.3: 3'-deamino-4'-deossi-4'-epi-amino-idarubicina

Dal momento che la 9-deossi-doxorubicina (rappresentata in figura 4) èmolto meno attiva dei lead compounds, si può dedurre che l'OH al C9dell'anello A è coinvolto nell'interazione con il complesso enzima-DNA.

O OH O OH9A HOO OHOCH3 H C O3 3'H N2OHFig.4: 9-deossi-doxorubicina

Inoltre, dall'osservazione che l'idarubicina è addirittura più attiva delladaunorubicina, si è dedotto che il gruppo 4-metossi non sia fondamentale perl'attività antitumorale.

In definitiva la sintesi di derivati delle antracicline e la successiva analisi ditali molecole su campioni biologici, ha permesso di dedurre le seguenti relazionistruttura-attività: 6• Il sostituente idrossilico al carbonio 9 è un determinante strutturale importanteper avere attività citotossica.• La

daunosamina svolge un ruolo chiave nell'identificazione del sito di cleavage e quindi è fondamentale nell'interazione con il DNA. Il gruppo 4-metossi non è fondamentale per l'attività antitumorale. Tali studi struttura-attività hanno lo scopo di distinguere tra i determinanti molecolari indispensabili per l'attività del farmaco e le parti strutturali che possono invece essere modificate, con l'obiettivo di migliorare le caratteristiche cliniche delle antracicline. Infatti, un limite al loro utilizzo è rappresentato dalla loro intrinseca cardiotossicità. Pertanto, il bisogno di migliorare l'indice terapeutico ha spinto la ricerca a indagare su analoghi delle antracicline più maneggevoli. La ricerca si è mossa su due differenti binari: da una parte sintetizzare analoghi dei lead compounds con piccole sostituzioni nell'ossatura principale, nel tentativo di trovare una struttura che

Presentasse un migliore profilo farmacodinamico e tossicologico rispetto ai farmaci genitori; dall'altra comprendere meglio il target di questi antibiotici in modo che, noto il bersaglio, fosse più facile risalire ai determinanti strutturali in grado di colpirlo selettivamente.

Per quanto riguarda il primo approccio, negli ultimi vent'anni sono stati sintetizzati circa duemila analoghi, ma solo pochi sono stati approvati per l'uso clinico. Un lavoro importante in questo contesto ha portato alla sintesi di derivati 4-metossi o 4-demetossi di antracicline disaccaridiche, in cui il primo zucchero è legato ad un secondo attraverso un legame glicosidico. Studi struttura-attività hanno dimostrato che tale sostituzione nella serie 4-metossilata fa ridurre drammaticamente la potenza citotossica, mentre nella serie 4-7 demetossi l'attività antitumorale si è dimostrata di gran lunga maggiore rispetto ai lead compounds se e solo se la

La configurazione al C4' è di tipo assiale. Si è arrivati così alla sintesi di MEN10755 (chiamata anche sabarubicina, fig 5).

Indagini condotte su tumori umani hanno rivelato che MEN 10755 è più efficace della doxorubicina nell'avvelenare la topoisomerasi II e sembra avere inoltre una minore cardiotossicità.

Per quanto riguarda il secondo approccio, studi recenti hanno fornito informazioni importanti riguardo al target.

Infatti si è visto che esistono almeno due isoenzimi della topoisomerasi II nelle α β cellule umane: la topoisomerasi II e la topoisomerasi II che differiscono nel peso molecolare (170 e 180 kDa rispettivamente) e nella localizzazione tissutale ma non nella sensibilità alle antracicline. L'enzima è costituito da tre domini: un dominio all'estremità N-terminale con il sito di legame all'ATP, una regione centrale.

che interagisce con il DNA e un dominio al C-terminale che sembra essere importante per la regolazione dell'attività enzimatica. La recente determinazione della struttura cristallina della porzione centrale (amminoacidi 410-1202) della topoisomerasi II di Saccharomyces Cerevisiae ha rivelato come questo enzima sia una proteina omodimerica a forma di cuore con grossi buchi di 5,5 nm entro cui potrebbero adattarsi le eliche di DNA durante la reazione di rottura e risaldatura (fig. 6).

Le Tyr catalitiche (simboleggiate in figura 6 dagli anelli aromatici) si trovano in un sottodominio compreso nel lievito tra gli amminoacidi 702-790, di struttura simile a quello di CAP, una nota proteina di E.Coli che lega il DNA. Indicate con le frecce, sono le glicine le cui mutazioni in glutammato conferiscono resistenza alle antracicline, confermando come la topoisomerasi II sia il bersaglio dell'azione citotossica di questi farmaci. Analizzando un frammento della topoisomerasi II.

Umana sono state individuate altre mutazioni associate all'acquisizione di resistenza alle antracicline come 740 744 642 11 quella della Ser in Trp, della Thr in Pro e di Ala in Ser. Studi condotti utilizzando proteine mutanti umane hanno permesso di 793 808 riconoscere anche il segmento da Arg fino a Thr come fondamentale per l'attività catalitica e per la sensibilità ai farmaci (fig. 7).

In figura 7 individuiamo in rosso la Tyr catalitica, la quale è fondamentale per l'attività enzimatica e non può essere sostituita con nessun altro amminoacido ed 794 799 801 804 in viola gli amminoacidi Leu (L), Asp (D), Ala (A), Arg (R) che possono essere rimpiazzati solo da amminoacidi con caratteristiche chimico-fisiche simili: la Leu con un altro amminoacido alifatico, l'Asp con uno acido come il Glu, l'Ala con uno di piccole dimensioni come la Gli e infine l'Arg con un 12 amminoacido a catena laterale basica come la Lys.

.10Procedendo su questa linea di studio, recentemente (2004) dal gruppo di ricerca dei professori Moro e Beretta è stato delineato al computer un modello di interazione delle antracicline nel complesso DNA-topoisomerasi II (fig. 8).

Il modello mostra come l'antraciclina interagisca da una parte con il DNA, intercalandosi tra le coppie di basi -2 e +1, e dall'altra con il dominio CAP-like dell'enzima. Nell'interazione con la topoisomerasi II giocano un ruolo fondamentale legami a idrogeno che si stabiliscono tra i sostituenti dell'anello aromatico del farmaco (gruppi idrossilico e carbonilico) e specifici residui amminoacidici che, se mutati, conferiscono infatti resistenza al farmaco.

Nel modello rappresentato in figura 8 si vede come la doxorubicina si intercali perpendicolarmente all'asse del DNA. La daunosamina si posiziona nel solco minore mentre l'anello D nel solco maggiore.

La doxorubicina entra in contatto con il dominio CAP-like.

della topoisomerasi₇₄₀ 744II attraverso legami a idrogeno proprio con la Ser e la Thr , le cui mutazioni come abbiamo già detto erano causa di resistenza alle antracicline. Secondo tale modello la mancanza del gruppo idrossilico al C11 risulta nella perdita di attività delle antracicline. ₇₅₀Un altro legame a idrogeno infine coinvolge la Glutammina e l'idrossile al C14 che però è presente solo nella doxorubicina e nell'epirubicina e quindi è tipico solo di questi derivati. Il gruppo idrossilico al C9 è coinvolto in un legame a idrogeno con l'atomo di N del nucleotide in posizione -1, spiegando in tal modo come i derivati privi del gruppo idrossilico al C9 siano inattivi. Per quanto riguarda l'amminozucchero, il gruppo ammino al 3' interagisce con i nucleotidi del DNA, in accordo con quanto detto precedentemente. Come si era anche dedotto dagli studi di relazione struttura-attività prima visti, il gruppo metossi

al C4 dell'anello D non è richiesto per l'attività anticancro e ciò è sperimentalmente dimostrato dall'elevata efficacia antitumorale dell'idarubicina. Questo è in accordo con il presente modello, poiché l'anello D si proietta verso l'esterno del complesso, e pertanto il gruppo metossile non ha alcuna interazione né con il DNA né con l'enzima.

L'epimerizzazione della posizione 4' non influenza negativamente l'attività del farmaco e infatti l'epirubicina è attiva quanto la doxorubicina, poiché l'interazione con il DNA è ancora favorevole (fig. 9).

Inoltre, in accordo con quanto detto prima, il gruppo NH si estende fino alla posizione -2, come si può apprezzare meglio dalla figura 9 in cui si vede chiaramente come l'amminogruppo protonato interagisca elettrostaticamente con la corrispondente base azotata. Questo

spiega anche l'importanza del gruppo NH nel determinare la sito-selettività delle antracicline, dal momento che in base al suo orientamento cambia la preferenza del nucleotide proprio in posizione 13. In conclusione, si può dire che la conoscenza del bersaglio, oltre a confermare e a spiegare quelle relazioni struttura-attività dedotte esclusivamente in via sperimentale, potrà essere in futuro di enorme vantaggio nella progettazione e nella ricerca razionale di inibitori dell'enzima più efficaci e meno tossici. Dott.ssa Emanu