Chimica Analitica Strumentale

Sezione 1 - Taratura e caratteristiche degli strumenti

Introduzione

I metodi analitici possono essere divisi in due grandi categorie: metodi classici e metodi strumentali. I metodi classici comprendono tutte le tecniche analitiche nate agli albori di questa scienza che si basano su processi di precipitazione, estrazione e distillazione per la determinazione degli analiti. In questo caso l’analisi qualitativa veniva condotta su proprietà tipiche di un composto, come l’odore, il colore, il punto di ebollizione e di fusione, la solubilità, l’attività ottica e l’indice di rifrazione. L’analisi quantitativa invece riguardava misure gravimetriche o volumetriche (dette anche titrimetiche): nel primo caso si misurava la massa dell’analita, nel secondo caso la quantità di un reagente che reagiva completamente con lo stesso. Queste tecniche, pur rimanendo molto utilizzate, sono state rimpiazzate quasi completamente dai metodi strumentali. I metodi strumentali devono il loro largo impiego allo sviluppo tecnologico degli ultimi decenni che ha permesso la nascita di molte tecniche in grado di analizzare qualitativamente e quantitativamente i composti. Molte di queste tecniche si basano su fenomeni di interazione, sia atomica che molecolare, del campione con una radiazione elettromagnetica, mentre molte altre riguardano le proprietà elettriche e termiche dei composti.

Proprietà caratteristiche dei metodi strumentali

• Spettroscopia di emissione: raggi X, UV, visibile, elettroni, Auger
• Emissione di radiazioni: fluorescenza, fosforescenza e luminescenza (raggi X, UV e visibile)
• Spettrofotometria e fotometria (raggi X, UV, visibile, IR): assorbimento di radiazioni
• Spettroscopia fotoacustica
• Risonanza magnetica nucleare e spettroscopia di risonanza di spin elettronico
• Turbidimetria: diffusione di radiazioni
• Nefelometria
• Spettroscopia Raman
• Rifrattometria: rifrazione di radiazioni
• Interferometria
• Diffrazione di radiazioni: metodi di diffrazione di raggi X e di elettroni
• Polarimetria, dispersione ottica rotatoria, rotazione di radiazioni dicroismo circolare
• Potenziometria: potenziale elettrico
• Cronopotenziometria: carica elettrica
• Coulombometria
• Amperometria: corrente elettrica
• Polarografia: resistenza elettrica
• Conduttometria
• Massa: gravimetria (microbilancia al cristallo di quarzo)
• Rapporto massa/carica: spettrometria di massa
• Velocità di reazione: metodi cinetici
• Gravimetria termica e titrimetria
• Calorimetria a scansione differenziale
• Caratteristiche termiche: analisi termiche differenziali
• Metodi di conduttometria termica
• Radioattività: metodi di attivazione a diluizione isotopica

Taratura

La taratura (o calibrazione) è un processo che determina la relazione tra la risposta del metodo di analisi e la concentrazione dell’analita; riguarda la quasi totalità delle misurazioni, ad eccezione della gravimetria e coulombometria. Possiamo avere quattro tipi di taratura: la comparazione con standard, la taratura con standard esterno, il metodo dell’aggiunta standard e il metodo dello standard interno.

Il metodo di calibrazione per comparazione con standard può essere effettuato mediante comparazione diretta o titolazione. La comparazione diretta consiste nella confronto di una proprietà dell’analita con uno standard, in modo che la proprietà da analizzare sia comparabile a quella dello standard; il processo viene definito anche comparazione ad annullamento o metodo isomatico. La titolazione consiste invece nel far reagire l’analita con un reagente standardizzato in una reazione a stechiometria nota; la quantità del titolante viene variata fino al raggiungimento dell’equivalenza, ovvero il punto in cui si può associare alla quantità di standard impiegato l’esatta quantità di analita presente.

La taratura con uno standard esterno prevede la preparazione di campioni standard separatamente dal campione e viene usata quando, all’interno della soluzione contenente l’analita, non sono presenti interferenze dovute ai componenti della matrice (effetto matrice). Il processo prevede la preparazione di una serie di campioni standard contenenti l’analita a concentrazione nota; fatto ciò, si misura la risposta dello strumento per ogni standard in modo da registrare la funzione esistente tra la risposta e la concentrazione dello standard. La funzione ottenuta viene così impiegata per prevedere, una volta analizzata la soluzione incognita, la concentrazione dell’analita.

Appurato che esista un andamento lineare tra le grandezze in gioco (ad es.: concentrazione ed assorbanza o concentrazione ed altezza del picco), quello che si fa è disporre i punti ottenuti su un grafico, cercando di fittare il loro andamento con una retta dalla forma generica: = + 0 1 Il passaggio importante di questo tipo di calibrazione consiste nel trovare l’equazione della retta migliore che descriva questo andamento. Per fare ciò viene impiegato il metodo dei minimi quadrati, dove il valore di b 1 (pendenza) e b (intercetta) vengono calcolati da:

0 ∑ ( − )( − ) =1 =1 2∑ ( − )=1 = − 0 1

Per dare un’idea di quanto la retta calcolata si discosti dai punti, si calcola la deviazione standard della regressione su y:

2∑ ( − ŷ )=1√ = −2Dove N, il numero di gradi di libertà del sistema, viene ridotto di due unità perché un grado di libertà viene perso per calcolare b e uno per calcolare b .1 0

Inoltre, in corrispondenza dei punti si può calcolare l’errore rispetto alla concentrazione: = 1

Questo approccio può essere impiegato se sono presenti quattro condizioni fondamentali:

• Le incertezze degli standard sono trascurabili rispetto alle deviazioni standard sulle misurazioni. Cioè gli errori sulle concentrazioni degli standard devono essere trascurabili.
• Le misure devono essere statisticamente indipendenti. Quindi il comportamento dello strumento deve essere costante nel tempo.
• Le misure devono avere la stessa deviazione standard indipendentemente dal misurando (condizione di omoscedasticità). In caso contrario si “spezza” la retta, analizzando un range alla volta.
• Le misure devono essere distribuite normalmente.

Il metodo dei minimi quadrati mette a disposizione anche il concetto di “coefficiente di correlazione”, indicato con R, che è un indice di qualità della retta di taratura:

∑ ( − ċ)( − ẏ) =1= 2 ∑√∑ ( − ċ) ( − ẏ) =1 =1

Il valore di R varia da -1 a +1: agli estremi, cioè a ± 1, la relazione tra le grandezze è lineare (nel caso della chimica analitica strumentale c’è linearità solo se R è maggiore di 0,99). Per avere un’idea invece della bontà della retta si può calcolare la banda di confidenza su y e su c:

′ 21 ( − ċ) = ∗ √ + , −2⁄ ′ 2 ∑ ( − ċ)2 =1 ′ 2 1 1 ( − ċ)′ = ∗ √ + + , −2⁄ ′ 2 ∑ ( − ċ)2 1 =1

Dove c’ è la concentrazione del campione, ċ è la concentrazione media, S è la deviazione sulla regressione e yt è il t di Student riferito all’andamento della gaussiana per un numero finito di misurazioni. Per la α/2 distribuzione di Student avremo: − ẋ= ⁄√

La calibrazione con il metodo descritto può essere comunque affetta da diversi errori; con questa tecnica, infatti, si assume che, quando la stessa concentrazione di analita è presenta sia nello standard che nel campione, si otterrà la stessa risposta. Uno degli errori tipici potrebbe essere quello di prendere la risposta dello strumento tal quale, senza alcuna correzione. La prima correzione da applicare, infatti, consiste nel sottrarre a questa misurazione il valore corrispondente al bianco della soluzione, dove per bianco ideale si intende una soluzione identica al campione ma priva dell’analita. Altra fonte di errori potrebbe essere l’effetto matrice, la contaminazione del campione in fase di preparazione o la diversa forma chimica dello standard rispetto all’analita. Infatti, per avere una calibrazione di buona fattura, è importante che lo standard esterno si trovi nello stesso stato di ossidazione, di isomerizzazione e di complessazione dell’analita.

Il metodo dell’aggiunta standard può essere impiegato nei casi in cui la matrice sia talmente complessa da non permettere l’uso di uno standard esterno, quando i processi di preparazione del campione sono complessi e quando il metodo analitico dipende da condizioni strumentali difficili da controllare. L’aggiunta di standard consiste nel dividere un parte del campione incognito in un certo numero di aliquote (almeno 4); la prima soluzione si analizza tal quale, alle rimanenti si aggiunge invece un volume noto di una soluzione standard dell’analita (spiking del campione). Se la correlazione tra le grandezze è lineare, lo strumento fornirà dei dati che, se corretti con il bianco e posti in un grafico, risponderebbero ad una funzione dalla forma di una retta. In corrispondenza del primo punto, ammesso che sia presente l’analita nel campione, si otterrà un segnale un po’ più alto dello zero, che tenderà ad aumentare per le altre soluzioni.

La tecnica descritta presenta lo svantaggio di imporre un grandissimo numero di analisi per campioni diversi (almeno 4 per ognuna). Inoltre, nel caso di scarse quantità di campione, il metodo non è applicabile. Di contro permette di correggere gli effetti assai complessi legati alla chimica del campione.

Il metodo dello standard interno consiste nell’aggiungere al campione, ai bianchi e agli standard di calibrazione, una sostanza che non sia già presente nella matrice del campione. Lo standard deve avere un comportamento simile ma non uguale all’analita, in modo che lo strumento possa distinguere i due segnali. Il rapporto del segnale dell’analita e dello standard viene quindi riportato in un grafico ottenendo la forma della curva di taratura, la quale permette di ricavare la concentrazione di analita nei campioni. La tecnica può essere impiegata quando non è possibile ottenere un bianco e quando si intende ottenere un’elevata precisione della misura. Lo svantaggio principale consiste nella difficoltà di reperire una sostanza che si comporti in modo simile all’analita; di contro, un buon standard interno può compensare diversi tipi di errori casuali e sistematici (fluttuazioni strumentali, abbassamento dell’effetto matrice, compensazione di errori dovuti alla preparazione delle soluzioni).

Caratteristiche degli strumenti

Gli strumenti possiedono diversi parametri per poter essere confrontati e per misurare le prestazioni. Tra questi troviamo la precisione, l’accuratezza, la sensibilità, il limite di rivelabilità, l’intervallo dinamico, la selettività e il rapporto segnale/rumore.

La precisione di uno strumento è la riproducibilità dei risultati e fornisce una misura dell’errore casuale di un’analisi. Essa viene definita da cinque grandezze: la deviazione standard assoluta, la deviazione standard relativa, la deviazione standard della media, il coefficiente di variazione e la varianza. L’accuratezza è invece la correttezza di un risultato sperimentale espressa come vicinanza della misura al valore vero.

La sensibilità è definita come la capacità da parte di uno strumento di discriminare fra piccole differenze di concentrazione di analita o, più rigorosamente, è la pendenza della curva di calibrazione in corrispondenza della concentrazione a cui si sta lavorando. La sensibilità dipende da due fattori: dalla pendenza della curva di calibrazione e dalla precisione dello strumento.

Il limite di rivelabilità è definito come la più importante cifra di merito (un numero ottenibile attraverso misurazioni sperimentali) che permette la valutazione di una tecnica analitica o di uno strumento. All’atto pratico lo si intende come la concentrazione o il peso minimo di analita che può essere rivelato ad un livello di fiducia noto. Questa definizione può essere soggetta a differenti interpretazioni in base al metodo utilizzato per calcolare il valore del limite di rivelabilità. Secondo la metodologia comunemente accettata, al limite di rivelabilità non è possibile effettuare misurazioni quantitative senza un errore compreso tra il 30%-50%; la misurazione quantitativa deve essere infatti effettuata a range di concentrazione di 5-10 volte maggiori del limite di rivelabilità.

L’intervallo dinamico è l’intervallo compreso tra la concentrazione più bassa alla quale si possono effettuare misure quantitative e la concentrazione alla quale la curva di calibrazione devia dalla linearità. Uno strumento analitico, per essere accettabile, deve possedere un intervallo dinamico di almeno alcuni ordini di grandezza.

Si definisce selettività di un metodo analitico un parametro che indica quanto il metodo stesso sia libero da interferenze causate dalle altre specie presenti nella matrice del campione.

Il rumore è una proprietà imprescindibile delle misurazioni strumentali e deriva da una moltitudine di effetti (termodinamici e quantistici) che non possono essere eliminati completamente. L’intensità media di questo fenomeno, N, è generalmente costante e non dipende dall’intensità del segnale totale S. Per questo motivo, se l’intensità del segnale di una grandezza è molto piccolo, il rumore presente può inficiare la validità della misurazione. Il rapporto tra il rumore e l’intensità del segnale, il cosiddetto rapporto segnale/rumore, descrive adeguatamente la qualità e le prestazioni dello strumento.

Le sorgenti di rumore nell’analisi strumentale riguardano il rumore chimico e il rumore strumentale. Il rumore chimico consiste nell’insieme di tutte le variabili incontrollabili che condizionano la chimica del sistema analizzato. Ne sono un esempio le fluttuazioni di umidità che causano cambiamenti all’interno dei campioni, vibrazioni che provocano la stratificazione di solidi in polvere e variazioni dell’intensità luminosa che altera i materiali fotosensibili. Il rumore strumentale è il tipo di rumore più importante ed è definito come l’insieme di tutti i tipi di fluttuazioni associate alla sorgente, al trasduttore del segnale in ingresso, agli elementi predisposti all’elaborazione del segnale ed al trasduttore del segnale in uscita di uno strumento. Può essere diviso in rumore termico, rumore istantaneo o granulare, rumore di sfarfallamento e rumore ambientale.

Sezione 2 – Metodi spettrometrici

Introduzione ai metodi spettrometrici

I metodi spettrometrici sono un insieme di tecniche strumentali, qualitative e quantitative, che si basano sulla misurazione dell’intensità di una radiazione elettromagnetica entrante o uscente dal campione in esame. Spesso ci si riferisce ai singoli metodi come “metodi spettroscopici”, ovvero metodi in cui si ha l’interazione di una radiazione con la materia. Di questa categoria fanno parte essenzialmente tre tecniche: la spettrometria ottica (ad es.: spettroscopia di assorbimento e di emissione atomica, spettroscopia di assorbimento molecolare), la spettrometria di massa (separazione in base al rapporto massa/carica) e la spettrometria a raggi X.

Spettri e aspetti quantitativi delle misure

Una prima ed importante suddivisione delle tecniche spettrometriche nasce dalle modalità di registrazione della radiazione. La radiazione misurata, infatti, può essere entrante o uscente dall’analita e avremo pertanto spettri in assorbimento o in emissione. Entrambe queste tipologie si riferiscono sia all’analisi atomica (o elementare) che a quella molecolare e si basano su presupposti completamente diversi. L’emissione consiste infatti nell’eccitazione di atomi, ioni o piccole molecole che in fase di rilassamento generano uno spettro, ovvero un grafico in cui vengono relazionati i parametri di potenza della radiazione (P) e di lunghezza d’onda o frequenza. La fase di eccitazione può avvenire via bombardamento elettronico (emissione di raggi X), esposizione a correnti elettriche alternate o a intense fonti di calore (emissione UV, visibile o infrarosso), irraggiamento elettromagnetico o grazie a reazioni chimiche esotermiche. L’assorbimento invece prevede la rimozione selettiva di alcune frequenze di una radiazione incidente sul campione da parte degli atomi, delle molecole o degli ioni che lo compongono. La radiazione assorbita viene impiegata per promuovere il salto della particella ad uno stato energetico superiore ben definito, dal momento che si avrà assorbimento solo se l’energia trasportata dalla radiazione è pari al ΔE tra il livello di partenza e di arrivo. Questo fattore permette di caratterizzare esattamente la specie che assorbe poiché i ΔE sono tipici di ogni sostanza. Lo spettro ricavato in questo caso viene generato dal grafico dell’assorbanza in funzione sempre di lunghezza d’onda o frequenza.

Gli spettri generati da questi due tipi di analisi possono presentare tre tipi di andamenti: a righe, a bande e continuo. Uno spettro a righe consiste in una serie di picchi stretti e ben definiti...