Chimica analitica strumentale applicata

Spettrometria di massa MS-MS

MS-MS non serve come analizzatore ma serve come cella di collisione (→ triplo quadrupolo). In un dispositivo semplice si ha una camera di ionizzazione (impatto elettronico, elettrochimica o elettrospray ma anche altro), e per effetto della ionizzazione si ha una molteplicità di ioni → essi vengono inviati verso l'analizzatore di massa che lavora in modalità SIM, particolarmente viene selezionato un solo ione (il primo analizzatore rimane con U e V costanti); questo unico ione viene mandato in una cella particolare (indicata come regione di reazione, è la cella di attivazione collisionale) dove viene eccitato (energia interna aumentata) in modo da favorire la frammentazione → questi frammenti vengono analizzati dal secondo quadruplo che opera in scansione continua.

Per gli strumenti MS-MS la struttura più di uso è quella dell'abbinamento di due quadrupoli, ma si...

stadi ondendo anche l'accoppiamento tra un quadrupolo e un sistema migliore → l'informazione è completa.
In ogni circostanza quello che si osserva nel primo analizzatore è lo (o gli) ioni. Può già essere un frammento, non deve per forza essere lo ione molecolare), mentre nel secondo si hanno i frammenti di questi.
Se lo ione base è radicalico (elettroni dispari) ci sono due metodi di frammentazione: generazione di un radicale e un catione oppure un radical catione e una specie neutra; mentre se si parte da un catione (ioni pari) si genera una specie cationica e una specie neutra (non si formano due radicali perché proibiti dalla TD).
Le famiglie di esperimenti che si possono fare con MS-MS sono 4: si parte da un precursore con numero pari di elettroni immettendo energia si generano cariche positive + molecole neutre: P → ∆E → F + N. I cammini frammentativi sono molteplici. Il sistemacomprende una camera di ionizzazione, un sistema di focalizzazione (un quadrupolo che seleziona un determinato rapporto m/z con U e V ssi) che trasporta gli ioni selezionati nella cella di collisione. La cella di collisione (che alla fine è un quadrupolo) è il luogo in cui avviene la deposizione di energia. La cella di collisione contiene un gas inerte. Il gas inerte non interagisce con il campo elettrico ma gli ioni (quelli che voglio frammentare) si dirigono verso di essa grazie alla differenza di potenziale tra la camera da dove derivano e questo quadrupolo, solitamente questa ∆V è circa 10/20/30 V, quindi l'energia cinetica di questi ioni è di circa 10/20/30 eV. L'urto tra gas inerte e ione trasferisce una quantità di energia cinetica allo ione, che viene trasformata in energia interna. Tutta l'energia che viene convertita può essere usata per la frammentazione perché la specie è già ionizzata (serve circa 1/2 eV, quindi non si deve

ionizzare la specie). L'urto di queste due (si può vedere come due palle che si urtano) trasforma parte di specie massiva energia cinetica in calore, che è energia interna di tipo rotovibrazionale. Questo urto trasferisce anche momento (p = mv) → il vettore velocità diventa due vettori velocità (momento) con direzioni divergenti, l'ione collidendo con il gas inerte viene, inoltre, deviato dal cammino iniziale. Per questo motivo si fanno avvenire questi urti in un quadrupolo (che lavora solo in radiofrequenza), che serve in questo caso come guida ionica: l'alternanza della polarità sulle quattro barre del quadrupolo rimporta il cammino dei frammenti carichi al centro del sistema quadrupolare (correzione effetto di scattering). Il gas inerte può essere Ar o N2, ma si preferisce Ar perché è più massivo ed essendo monoatomico non assorbe energia vibrazionale → l'urto è più ottimale. L'azoto

viene utilizzato perché già presente nel sistema per mandare la linea di controcorrente calda. La pressione del gas sarà attorno 10 mbar. La frammentazione non è standardizzata, le collisioni sono tipicamente multiple, ma aumentando la pressione del gas si aumenta il numero di collisioni (solitamente viene usata una pressione costante); il potenziale di questo quadrupolo può essere modificato rapidamente per rendere gli urti più energetici (se la ∆V è maggiore). Negli esperimenti più comuni si cerca di frammentare il 90% degli ioni che entrano: in base alla stabilità degli elettroni che entrano decido la differenza di potenziale di offset ottimale. I potenziali possono essere variati bruscamente → questo può essere utile per ottenere il passaggio o la frammentazione di un ione specifico. Dato che l'elettrospray produce solo lo ione molecolare, oggi viene abbinato ad un sistema massa-massa per generare tutti iframmenti di cui si vuole fare l'analisi. La frammentazione può essere anche indotta prima della cella di collisione: mettendo delle differenze di potenziale tra il primo e il secondo skimmer, oppure tra il secondo skimmer e l'orifizio di set della prima guida ionica si possono accelerare gli ioni e grazie all'interazione con l'azoto, indurre frammentazione. L'applicazione principale di questo primo esperimento è quello di fare un'analisi qualitativa (attraverso i frammenti riconosco le diverse parti che compongono la molecola originale). Spettrometria di massa → Precursor Ion Spectrum. Qui si prevede che il primo analizzatore di massa vieneEsperimento n.2‣ mantenuto in scannerizzazione continua mentre il secondo in modalità statica (contrario di quello di prima). Gli ioni formati nella camera di ionizzazione vengono trasmessi in istanti successivi (la scannerizzazione è continua) nella cella di

collisione → nella cella di collisione ciascuno di loro frammenta per urto con il gas inerte quindi al secondo analizzatore di massa arrivano molti più ioni precursori in un intervallo di tempo maggiore. Per ordinare il tutto si usa il secondo analizzatore di massa: esso fa passare un solo ione frammento. Se questo speci co frammento non viene generato al rivelatore non arriva nulla; il segnale è generato da un singolo ione frammento (ovviamente i segnali selezionati possono essere più di uno, con tempi di eluizione diversi). Il segnale di quel solo ione viene attribuito via software al precursore che lo ha generato → si costruisce lo spettro degli ioni precursori che hanno generato quel frammento. Questo esperimento serve per definire l'elemento strutturale comune a diverse molecole, ad una famiglia di molecole → analisi di tipo qualitativo che introduce un forte elemento di selettività legato al frammento comune che definisce una famiglia.

Constant Neutral Loss Spectrum. In questo esperimento entrambi gli analizzatori di massa vengono mantenuti in scansione continua, con in mezzo una frammentazione. L'idea è di farli muovere in maniera sincrona e parallela (anche se disgiunto): mentre la scansione avviene alla stessa velocità la focalizzazione cambia in modo parallelo in modo che la differenza tra il primo e il secondo analizzatore di massa rimanga costante, quindi P+ → F+ + N, in questo modo si possono vedere solo gli ioni precursori che frammentano perdendo quel particolare frammento N. Questo tipo di esperimento serve per mettere in dettaglio selettivamente quegli ioni precursori che hanno in comune questa sottostruttura che viene persa dopo la frammentazione. → Selected Reaction (= frammentazione) Monitoring, ma anche MRM (per indicare che i due quadrupoli non sono proprio mantenuti statici, ma possono essere mossi a salti → non si seleziona).

Un singolo ione, quindi si ottiene una frammentazione multipla). In questo esperimento entrambi gli analizzatori sono mantenuti statici → viene selezionato un solo ione precursore e un solo ione frammento generato. È il corrispondente della SIM in analisi MS-MS, infatti per fare analisi quantitative è il sistema migliore.

Questo tipo di esperimento è il più utilizzato perché riesce ad essere molto più selettivo della SIM, si abbatte il rumore (che solitamente è dovuto alle interferenze chimiche) → di conseguenza aumenta la sensibilità (aumenta il rapporto segnale rumore).

Il secondo motivo di applicazione di questo esperimento è che per la SIM si hanno bisogno di minimo 3 ioni per identificare una sostanza, per questo strumento sono sufficienti 2 punti identificativi (i 4 punti identificativi sono garantiti da 2 transizioni precursore-frammento per cui ciascuna contribuisce per 1.5 punti + tempo di ritenzione che è il

4º punto identi cativo), ma la nestra può essere cambiata; questosistema può essere usato anche a schema libero: si può far variare a salti sia il primo che il secondoprecursore tenendo ssa la coppia (scegliendo precursore e prodotto che si analizza). Nel cercare unamolteplicità di analiti la programmazione può essere complicata.

L'ultima regola è che l'abbondanza relativa dei due segnali di massa uguale a quella registrata nellestesse condizioni operative della miscela standard.

Il principio fondamentale dell'applicazione della MS-MS è che ogni volta che siintroduce un cancello (tutti i trattamenti che trattengono degli elementi - dueanalisi di massa sono due cancelli analitici) analitico il rapporto segnale rumoreaumenta → la sensibilità aumenta anche se l'intensità del segnale diminuisce (laresa non sarà mai del 100%).

Applicazioni della MS-MS sono l'attivazione della

frammentazione di ioni molecolari ottenuti da tecniche soft di ionizzazione (esperimento 1) al fine di identificare la struttura molecolare; altra applicazione è l'applicazione di un approccio più rapido all'analisi di una serie di campioni che sostituisca procedure GC-MS o HPLC-MS con procedure dirette MS-MS. 31 fi fi fi fi fi fi fi fi fiffi ff fi fi

Validazione tecniche analitiche

La validazione è un percorso intellettuale e serve per capire se il metodo scelto è adatto allo scopo. Un metodo analitico serve a determinare un certo analita in un preselezionato range di concentrazione, in uno specifico materiale e per un determinato scopo. Nello sviluppo del metodo il chimico deve selezionare la tecnica adatta e i parametri del metodo per aggiustare la performance del metodo sulla base delle necessità del cliente → la validazione della tecnica riguarda anche il fatto di soddisfare la richiesta del cliente, il risultato deve essere di qualità; inoltre

e verificare l'efficacia e l'accuratezza del metodo di analisi utilizzato. Valutare la precisione e la riproducibilità dei risultati ottenuti. Identificare eventuali errori o problemi nel processo di analisi. Assicurare la conformità del metodo di analisi alle normative e ai requisiti di qualità. Ottimizzare il metodo di analisi per migliorare la sua efficienza e affidabilità. Fornire una base solida per la validazione del metodo di analisi da parte di enti regolatori o di terze parti.