Chimica analitica

L;

se in forma liquida. L’iniezione viene fatta con microsiringhe, ovvero siringhe tarate a volumi di qualche a valori

di V così bassi, però, gli errori sull’effettivo V iniettato aumentano. Si possono perciò utilizzare standard interni per

compensare l’errore analitico. Esistono anche campionatori automatici che permettono di effettuare analisi in

replicato e in automatico; si ha maggiore riproducibilità ma l’uso dello standard interno è sempre consigliato;

• Colonna cromatografica: può essere:

o Impaccata: tubo di materiale inerte riempito di fase stazionaria

porosa. La fase stazionaria può essere solida o liquida. Hanno

il vantaggio di poter sopportare quantità di campioni

abbastanza grandi, ma non sono molto efficienti e vengono

perciò usate per separazioni semplici o con campioni con pochi

analiti;

o Tubulare aperta: tubo con la fase stazionaria spalmata

sulle pareti interne. Non essendoci l’impaccamento, sono

sufficienti pressioni minori e quindi è possibile utilizzare

colonne più lunghe. La fase stazionaria può essere o un

supporto poroso imbevuto di fase stazionaria o

direttamente un film poroso. Per queste colonne sparisce

il termine A, essendo che il percorso percorribile dalla fase

mobile è unico; m

o Capillare: diametro interno di 100-200 e lunghezza fino a 100 m.

Aumentano notevolmente i piatti teorici e quindi l’efficienza. La fase

stazionaria è spalmata sulla superficie interna. Sono colonne molto utili in caso

di miscele molto complesse. Più è piccola la colonna, meno campione sarò in

grado di iniettare poiché sarà presente meno fase stazionaria.

• Rivelatore: detto detector, deve essere aspecifico e con alta sensibilità:

o A conducibilità termica: rileva le variazioni di conducibilità termica della fase mobile in funzione del PM

della stessa, poiché la presenza di un qualsiasi analita diminuirà la conducibilità termica del gas (principio

generale); inoltre, essendo che il rivelatore è costituito da un filo conduttore riscaldato, al passaggio della

fase mobile si raffredderà in maniera proporzionale alla massa del flusso (fase mobile + analita). È

totalmente aspecifico, dato che si basa solo sulla massa, ma non è abbastanza sensibile per quantità di

campione troppo basse. È abbastanza in disuso;

o A ionizzazione di fiamma FID: rileva ioni formatisi a seguito della combustione degli analiti (principalmente

sostanze organiche). Gli ioni prodotti vengono raccolti e rilevati da un elettrodo collettore posto sopra la

fiamma, il quale misurerà le variazioni di corrente prodotte dal loro passaggio. La fiamma è alimentata ad

H . È abbastanza sensibile anche per le colonne capillari, ma ha come limitazione quella di non essere in

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grado di vedere idrocarburi alogenati poiché poco combustibili;

o A cattura di elettroni: complementare al FID, poiché riesce a rilevare composti come gli idrocarburi

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alogenati. È costituito da un elettrodo rivestito da un elemento radioattivo, il Ni, che, ionizzando la fase

mobile, permette la produzione di una costante corrente elettrica; il passaggio di un analita contenente

elementi elettronegativi causerà la cattura da parte di quest’ultimi degli elettroni e quindi una diminuzione

di corrente elettrica.

Iniettore e colonna dovranno essere termostatati alla stessa T per permettere la volatilizzazione del campione e, di

conseguenza, anche il suo mantenimento in tale forma; eventualmente, l’iniettore può essere termostatato a T

maggiori rispetto alla camera per facilitare la volatilizzazione. Tra i vari parametri che influenzano la separazione

cromatografica in GC, il più importante e influente è la T: diminuendola, infatti, la dissoluzione in fase stazionaria e

quindi i tempi di ritenzione aumentano; vale il contrario. La termostatazione può essere fatta in due modi:

• Isoterma: si termostata tutto il sistema alla stessa T; ciò potrebbe non essere

sufficiente in caso di campioni con analiti con proprietà molto diverse tra di loro: alcuni

di essi, infatti, potrebbero avere caratteristiche tali per cui i tempi di ritenzione sono

troppo lunghi o troppo corti;

• A T programmata: a diversi tempi di analisi il sistema varia la T; in questo modo, ogni

analita uscirà dalla colonna solo in presenza della T adeguata. La programmazione può

essere fatta per rampe o a gradini.

20/05/21

Cromatografia liquida LG

Permette l’analisi di campioni e miscele liquide non volatilizzabili (es. ad alto PM, proteine, specie ioniche). A differenza

della GC, sia la fase mobile che quella stazionaria interagiscono con il campione; di conseguenza, la ritenzione sarà

data dalla competizione delle interazioni che si formano tra l’analita e le due fasi. Anche in questo caso, la tecnica

dipende dalle caratteristiche della fase stazionaria e dai principi chimico-fisici su cui si basa:

• Adsorbimento: processo molto simile alla GC, con la differenza che le fasi stazionarie possono essere gel di silice

o allumina (composti polari in generale); eventualmente si usa anche MgSO . Il solvente utilizzato non può essere

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acqua o un qualunque solvente troppo polare, poiché tra analiti e fase mobile si viene ad instaurare una forte

competizione e, in caso di interazioni maggiori tra fase mobile e fase stazionaria piuttosto che tra fase stazionaria

e analiti, la ritenzione sarebbe nulla poiché tutte le interazioni polari vengono fatte dalla fase mobile. Il solvente

dovrà perciò essere apolare; usare solventi troppo apolari provocherebbe, però, l’effetto opposto: la competizione

della fase mobile con il campione a livello della fase stazionaria sarebbe nulla, e di conseguenza gli analiti non

uscirebbero dalla colonna in tempi utili. In generale, in questo tipo di cromatografia, escono prima gli analiti apolari

e poi quelli polari (→ fase stazionaria polare). L’interazione analita – fase stazionaria, come già detto, avviene sui

gruppi funzionali polari della fase stazionaria; è possibile anche separare isomeri strutturali, composti che

contengono gli stessi gruppi funzionali ma distribuiti sulla molecola in modo diverso. Venendosi ad instaurare

interazioni di diverso tipo tra i gruppi funzionali e la fase stazionaria, sarà possibile separare anche isomeri molto

simili tra di loro:

In questo caso, l’isomero o esce prima dalla colonna poiché i due gruppi funzionali formeranno legame

intermolecolare con lo stesso gruppo della fase stazionaria e verrà quindi ritenuto di meno; gli isomeri m e p,

invece, usciranno rispettivamente uno dopo l’altro sempre per lo stesso motivo;

• Ripartizione: la fase stazionaria è un liquido immiscibile con la fase mobile (virtualmente impossibile) imbevuto su

un determinato supporto. Visto che la fase stazionaria tende ad essere lavata dalla fase mobile, si usano fasi

stazionarie legate covalentemente con la colonna; il supporto che viene legato alla colonna è solitamente silice, la

quale può essere modificata in polarità tramite derivatizzazione delle catene laterali R. Le separazioni mediante

cromatografia di ripartizione possono essere infatti classificate in base alla polarità delle due fasi:

o Ripartizione in fase diretta: la fase stazionaria è più polare della

fase mobile. Viene utilizzata abbastanza poco perché le fasi

stazionarie polari danno interazioni molto forti e che possono

portare alla contaminazione, anche irreversibile, della fase stessa,

con conseguente perdita di efficienza;

o Ripartizione in fase inversa: la fase stazionaria è più apolare della fase mobile. L’ordine di eluizione vedrà

in testa i composti polari, seguiti da quelli poco polari e infine da quelli apolari.

• Scambio ionico: non ha corrispondenti in GC poiché le specie ioniche non

hanno tensione di vapore tale da permettere la loro portata in fase gassosa.

La fase stazionaria, solitamente resine a scambio ionico, possiede gruppi

carichi in modo opposto rispetto agli analiti; anche qua, la ritenzione è data

dalla competizione fra gli ioni dell’analita e quelli contenuti nella fase mobile

(vengono aggiunti elettroliti alla soluzione acquosa per permettere la

competizione). Le resine a scambio ionico vengono classificate, in base al loro intervallo utile di pH, in resine

scambiatrici forti e resine scambiatrici deboli: quelle forti hanno un ampio intervallo di pH, mentre quelle deboli

possiedono un piccolo intervallo di lavoro di acidità. L’affinità degli ioni dell’analita per la fase stazionaria dipende

dalle interazioni elettrostatiche con i gruppi carichi della resina; in particolare:

o Carica: meno è carico più velocemente esce;

o Polarizzabilità: dipendente in maniera proporzionale dalle dimensioni, e più è polarizzabile più tempo

impiegherà ad uscire dalla colonna;

o Raggio di idratazione: più è piccolo più velocemente esce.

• Esclusione dimensionale: non ha corrispondenti in GC poiché, in questa tecnica, le molecole

analizzate sono di grandi dimensioni (poco volatili). La fase stazionaria è un materiale poroso

con pori paragonabili alle dimensioni degli analiti, in modo tale che possano entrare o meno

nei pori; se l’analita è troppo grande e non entra, allora avrà un tempo di ritenzione minore

rispetto a quegli analiti che invece, essendo più piccoli, rimarranno intrappolati nei pori per

un certo periodo di tempo. La dimensione degli analiti deve essere contenuta nell’intervallo

di ampiezza dei pori, per evitare che tutti vengano trattenuti o che, al contrario, non ne venga

trattenuto nessuno;

• Affinità: la fase stazionaria è un supporto solido sul quale sono immobilizzati ligandi, solitamente di natura

biologica (come anticorpi), specifici per gli analiti di interesse. Non sono proprio colonne cromatografiche ma

piuttosto di estrazione, poiché verrà trattenuto solo il composto di interesse mentre gli altri usciranno.

Cromatografia planare TLC

La fase stazionaria è un piano di vetro o alluminio su cui è fissata la fase stazionaria, solitamente silice o allumina. La

fase mobile risale per capillarità sul piano posto in verticale. Verso il fondo della lastrina viene seminata una piccola

quantità di prodotto in un punto; questa viene quindi immersa, poco sopra il punto di semina, nella fase mobile, la

quale inizierà a risalire la lastra, per capillarità, separando nel frattempo i vari

componenti del campione. Il tutto avviene in una camera cromatografica, ovvero un

contenitore con coperchio che ha lo scopo di evitare l’evaporazione della fase mobile

e permettere la saturazione del