Chimica analitica e inorganica - cromatografia

Cromatografia

La cromatografia è utilizzata per la separazione di singoli costituenti di un campione in base a differenze nelle loro caratteristiche fisiche e/o chimiche (ad es. dimensioni molecolari, forma, carica, volatilità, solubilità, adsorbibilità, ecc.). La versatilità delle tecniche cromatografiche, e la loro capacità discriminativa anche in presenza di matrici complesse, ne permettono un larghissimo uso nei campi più diversi.

Componenti essenziali di un sistema cromatografico

Le componenti essenziali di qualsiasi sistema cromatografico sono le seguenti:

• Fase stazionaria: solida, un gel o un liquido immobilizzato, trattenuto da una matrice di supporto.
• Letto cromatografico: la fase stazionaria può essere introdotta in una colonna di vetro o metallo, spalmata come strato sottile su un foglio di plastica o di vetro, o assorbito su fibre di cellulosa (carta).
• Fase mobile: un liquido o un gas, che agisce da solvente che trasporta il campione attraverso la fase stazionaria e lo eluisce dal letto cromatografico.
• Un sistema che fa passare la fase mobile attraverso il letto cromatografico.
• Un sistema di rivelazione per seguire le sostanze da separare.

In un sistema cromatografico, quelle sostanze che interagiscono con forza con la fase stazionaria saranno ritardate di più, mentre quelle che mostrano poca interazione lo attraversano con un ritardo minimo, portando a differenze nella distanza percorsa o nel tempo di eluizione. Ne consegue quindi che la separazione è dovuta all’affinità per la fase stazionaria.

Tipi di cromatografia

In funzione allo stato di aggregazione della fase mobile, si distingue la cromatografia liquida (LC) dalla cromatografia gassosa (GC). È possibile fare una classificazione delle tecniche cromatografiche in funzione alla forma del letto cromatografico, allo stato di aggregazione della fase mobile, e al meccanismo di separazione.

Le interazioni che vengono a stabilirsi tra le sostanze da separare e le due fasi (fase mobile e fase stazionaria) sono di tipo debole, e se così non fosse, non ci sarebbe trattenimento o, al contrario, eluizione.

Interazioni cromatografiche

Il tipo di interazioni usate a scopo cromatografico sono le seguenti:

• Legami idrogeno
• Interazioni dipolo-dipolo
• Interazioni dipolo-dipolo indotto
• Forze di van der Waals
• Formazione di composti di interazione
• Attrazione coulombiana
• Interazioni steriche

Si tenga presente che le interazioni citate possono presentarsi singolarmente o in maniera combinata. La polarità delle due fasi gioca spesso un ruolo preponderante.

Cromatografia di adsorbimento

In questa tipologia di cromatografia, la fase stazionaria è un solido in polvere disteso su un supporto. La polvere della fase stazionaria è in grado di stabilire legami deboli, quindi reversibili, con le molecole della sostanza che si vuole separare. L'adsorbimento superficiale è un processo chimico-fisico secondo il quale le molecole sulla superficie di interfase stabiliscono legami di tipo chimico o chimico-fisico.

L'interfase sarebbe la superficie di separazione tra due distinte fasi (solido-liquido, solido-gas, liquido-gas). L'adsorbimento può essere di natura fisica, dovuto a forze di Van der Waals, o chimico, con energie di legame tipicamente intorno ai 200 Kj/mol. La fase mobile è un gas o un liquido, quindi si parla di cromatografia di adsorbimento gas-solido o di cromatografia di adsorbimento solido-liquido.

Tramite la cromatografia di adsorbimento è possibile separare sostanze organiche e inorganiche, polari o non polari.

Cromatografia di ripartizione

Nella cromatografia di ripartizione la fase stazionaria è un liquido legato ad un supporto solido, mentre la fase mobile può essere un liquido o un gas. Il liquido della fase stazionaria impregna un solido granulare inerte, oppure è chimicamente legato ad esso, e le molecole della sostanza da separare sono solubili in esso.

È necessario però che la fase mobile e quella stazionaria siano immiscibili tra loro. Durante l’eluizione le molecole da separare si ripartiranno tra la fase mobile e quella stazionaria, in funzione alla differente solubilità in ognuna, e quindi quelle sostanze che “preferiranno” la fase mobile eluiranno più rapidamente, mentre quelle che “preferiranno” la fase stazionaria saranno più lente.

Nella cromatografia di ripartizione in fase normale, la fase stazionaria è un solvente polare, in genere acqua, supportato da una matrice solida (ad esempio fibre di cellulosa nella cromatografia su carta) e la fase mobile è un solvente organico immiscibile non polare.

Nella cromatografia di ripartizione in fase inversa, la fase stazionaria è un solvente non polare che è legato chimicamente ad una matrice di supporto porosa, mentre la fase mobile può essere scelta tra una vasta gamma di solventi polari, come l’acqua o soluzioni acquose tamponate.

La cromatografia di ripartizione è la tecnica maggiormente usata per la separazione di sostanze organiche.

Cromatografia a scambio ionico (IEC)

In questa metodica cromatografica la separazione si esegue usando una colonna riempita con una matrice porosa che ha un elevato numero di gruppi ionizzati sulla sua superficie, ovvero la fase stazionaria è una resina a scambio ionico. I gruppi possono essere scambiatori di cationi o di anioni, secondo la loro affinità per ioni positivi o negativi. La carica netta di una particolare resina dipende ovviamente dalla pKa dei gruppi ionizzabili e dal pH della soluzione.

La fase mobile è un liquido, le cui molecole vengono attratte da gruppi funzionali come –SO₃^- oppure –NR₃⁺, legati covalentemente alla resina. La cromatografia a scambio ionico è utilizzata per la separazione di una ampia gamma di biomolecole ioniche, ivi compresi amminoacidi, peptidi e nucleotidi.

Cromatografia per esclusione dimensionale (SEC)

In questa tipologia di cromatografie la fase stazionaria è costituita da un gel poroso, mentre la fase mobile può essere sia liquida che gassosa. Le molecole che si vuole separare sono contenute nella fase mobile, che provvede a farle scorrere attraverso il gel poroso. Data appunto la presenza di questi pori, le molecole, in funzione alla loro dimensione, eluiranno con velocità differenti, e da qui la possibilità di separazione.

• Gel permeazione per la separazione di sostanze insolubili in acqua
• Gel filtrazione per la separazione di sostanze solubili in acqua

La selettività della cromatografia per esclusione dimensionale dipende solamente dalla fase stazionaria, e la fase mobile serve soltanto a trasportare il campione lungo la colonna. È quindi possibile stimare la massa molecolare di un componente del campione, calibrando una data colonna con molecole a massa molecolare nota e di forma simile. La cromatografia ad esclusione dimensionale è utilizzata per la separazione di molecole di grandi dimensioni.

Cromatografia di affinità (AFC)

Nella cromatografia di affinità c’è una interazione altamente specifica tra la fase stazionaria, costituita da molecole immobilizzate su supporto solido (tipicamente enzimi o anticorpi), e la fase mobile liquida. Si utilizzano quindi reazioni biochimiche reversibili per separare in maniera assai efficiente le sostanze presenti nella fase mobile. Il sistema evidenzia una straordinaria efficienza nell’isolare piccole quantità di materiale (quasi sempre biologico) da grandi quantità di sostanze contaminanti.

Quando si applica un campione biologico ad una colonna riempita con una matrice di affinità di supporto, la molecola che interessa si legherà specificamente al ligando, mentre le sostanze contaminanti verranno lavate via dal tampone. L’eluizione della molecola desiderata si può ottenere variando il pH o la forza ionica del tampone, al fine di indebolire le interazioni non covalenti tra la molecola e il ligando, o mediante l’aggiunta di altre sostanze che hanno una affinità maggiore per il ligando.

Principi teorici della cromatografia

Nel corso di qualsiasi tipo di cromatografia, sia essa di adsorbimento, di ripartizione, ad esclusione dimensionale, di scambio ionico, o di affinità, ogni componente del campione si disporrà variamente tra la fase stazionaria e quella mobile. Il coefficiente di ripartizione per ciascun componente viene definito come il rapporto tra la concentrazione relativo del medesimo componente tra le due fasi, quella mobile e quella stazionaria.

Andando ad eseguire misurazioni dell’eluato, tramite appositi sistemi di rivelazione, e registrando i dati, è possibile ricavare un grafico che prende il nome di cromatogramma. Un cromatogramma si mostra come un grafico dotato di picchi, e ogni picco, teoricamente, dovrebbe essere dato dalla presenza nell’eluato di un singolo componente. L’osservazione attenta di un cromatogramma permette la definizione di parametri critici, utili nel valutare l’efficienza di una qualsiasi analisi cromatografica.

• Tempo di ritenzione (t_R): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall’inizio alla fine della colonna cromatografica.
• Tempo morto (t_M): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto, e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui scorre la fase mobile nella medesima colonna.
• Volume di ritenzione (V_R): volume di fase mobile necessario ad eluire l’analita, dall’inizio alla fine della colonna.
• Volume morto (V_M): volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).

Fattore di capacità (f): questo termine definisce la facoltà della colonna cromatografica di trattenere uno specifico componente del campione. Più è elevato il fattore di capacità e migliore sarà la separazione, ma si allungheranno i tempi della stessa.

Per definire in maniera oggettiva l’efficienza di una cromatografia, e per darne un ordine quantitativo, si ricorre alla definizione di alcuni termini che possono essere trattati matematicamente. Sebbene la cromatografia sia un processo continuo, è possibile immaginare la colonna cromatografica come una successione molto grande di N segmenti, che chiameremo piatti teorici, in ognuno dei quali si realizza un equilibrio di ripartizione, reversibile, del componente in esame tra la fase stazionaria e quella mobile.

Ciascun piatto teorico ha una sua altezza, che definiamo altezza equivalente di piatto teorico (H.E.T.P.), e chiameremo H. Maggiore è il numero di piatti teorici, N, di una colonna, e migliore sarà la separazione. Se L è la lunghezza della colonna cromatografica, otteniamo: H = L/N. Confrontando l’altezza equivalente di piatto teorico di diverse colonne, otteniamo una misura dell’efficienza. Infatti minore sarà il valore di H e maggiore sarà l’efficienza di quella colonna, infatti a parità di L, risulta migliore la separazione in una colonna con più N, ovvero con un numero più elevato di piatti teorici.

La variabile che più di tutte influenza l’efficienza di una colonna cromatografica, è la velocità di flusso lineare della fase mobile, che si misura in cm/s. Infatti la velocità di flusso determina il tempo di contatto tra fase stazionaria e fase mobile, e quindi la possibilità dell’instaurarsi di interazioni determinanti al fine della separazione delle sostanze contenute nel campione. L’altezza equivalente H, il parametro in grado di definire quantitativamente l’efficienza di una colonna, dipende fortemente dal valore della velocità di flusso lineare della fase mobile, ed un suo aumento, fa “allargare” l’altezza del piatto teorico, diminuendo l’efficienza della colonna, e quindi la buona separazione degli analiti.

In generale la velocità di flusso lineare della fase mobile per la cromatografia liquida (LC) è più bassa di quella della gascromatografia (GS) ma al fine di velocizzare le operazioni, si opera quasi sempre a velocità superiori di quella ottimale.

Teoria della velocità cromatografica

Le molecole che compongono l’analita che vogliamo riconoscere grazie alla separazione cromatografica, non si muovono tutte con la medesima velocità lungo la colonna. Infatti dato il loro numero elevato, tipicamente la distribuzione delle velocità di tali molecole assume un profilo a campana, gaussiano. Il centro di tale profilo (banda di eluizione) rappresenta il valore medio delle velocità, e gli spostamenti da tale valore sono dovuti alle seguenti condizioni:

• Diffusione longitudinale: diffusione delle molecole dalle zone a maggiore concentrazione verso quelle a minore concentrazione, in una direzione parallela all’asse della colonna.
• Trasferimento di massa: tra fase mobile e stazionaria, dovuto alla necessità del soluto di entrare in equilibrio nelle due fasi.
• Percorsi multipli: se il soluto permane per un tempo non abbastanza breve all’interno della colonna, si verifica il fenomeno della diffusione longitudinale. L’entità del fenomeno sarà ovviamente inversamente proporzionale alla velocità di flusso, infatti ciò significherebbe un maggior tempo di permanenza nella colonna cromatografica.

L’estensione della banda può avvenire anche per via del fenomeno di trasferimento di massa tra fase mobile e stazionaria, dovuto alla necessità del soluto di entrare in equilibrio tra le due fasi. La velocità di equilibrazione (ovvero la velocità con la quale il soluto entra in equilibrio tra le due fasi) è espressa dal termine Cu.

Poiché la fase mobile comunque si muove più velocemente del soluto, che giustamente tende ad essere trattenuto dalla fase stazionaria, per via delle interazioni che possono instaurarsi, la zona di soluto nella fase mobile si sposta più avanti di quella nella fase stazionaria. Questo gap aumenta quanto più è alta la velocità di flusso.

Un altro fattore che può causare un allargamento della banda, ovvero uno spostamento dal valore medio delle velocità di eluizione lungo la colonna, è dovuto alla diffusione vorticosa. Infatti non tutte le molecole di analita seguono il medesimo percorso per andare dall’inizio alla fine della colonna. Ci saranno molecole che percorreranno distanze maggiori e molecole che percorreranno distanze minori. Si noti che la diffusione vorticosa è del tutto indipendente dalla velocità di flusso della fase mobile. Per cui lo slargamento della banda che si ottiene in seguito a questo fenomeno è da ritenersi casuale.

Equazione di Van Deemter

Tenuto conto della teoria della velocità cromatografica, l’equazione di Van Deemter mette in relazione l’altezza equivalente di piatto teorico con la velocità di flusso lineare della fase mobile. Nell’equazione di Van Deemter compaiono tre termini, ognuno dei quali ha uno specifico significato.

• Il termine A, esprime in maniera quantitativa l’entità della diffusione vorticosa.
• Il termine B/u esprime l’entità del fenomeno di diffusione longitudinale.
• Il termine Cu tiene conto del trasferimento di massa tra fase mobile e fase stazionaria.

Risulta più semplice determinare la velocità di flusso ottimale su curve con il ramo destro meno inclinato, perché consente di spingere il flusso a valori più elevati, senza compromettere far aumentare troppo il valore di HETP, con la conseguente perdita di efficienza.

Efficienza, selettività e risoluzione

Efficienza: è la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle della stessa specie, alla stessa velocità, in modo da formare in colonna bande strette, da cui picchi stretti.

Selettività: capacità di un sistema cromatografico di eluire specie diverse, a velocità differenti, permettendo una chiara separazione tra i componenti del campione analizzato.