Chimica analitica clinica

MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS

I MIP rappresentano un tentativo di costruire in laboratorio una molecola con le caratteristiche di avidità e selettività degli anticorpi naturali, ma più stabili in condizioni non fisiologiche e disponibili in quantità illimitata. Si tratta di polimeri con tasche di legame selettive per l'analita. Essi sono preparati mediante un processo di polimerizzazione, nel quale l'analita viene utilizzato come stampo. I MIP (o polimeri sartoriali) sono stati utilizzati per diverse applicazioni: metodi immunologici, fasi stazionarie per cromatografia di affinità ed estrazioni in fase solida, sensori, catalisi.

Al posto delle IgG si usano anche i Nanobodies: anticorpi isolati originariamente dalla lama e cammelli, hanno solo le catene pesanti (centrali) e contengono un singolo dominio variabile. Al posto della IgG si può isolare solo il frammento variabile della catena pesante che pesa 10 volte meno. Le dimensioni ridotte ne

tasca in cui l'analita è legato ad alta affinità. Si sfruttano acidi nucleici naturali ma la sequenza è ottimizzata in maniera sintetica. La procedura è detta Selex: si parte da una libreria di molecole di DNA o RNA ottenute casualmente che è poi incubata insieme al target. Dopo aver legato il target alcune sequenze legano il target mentre altre non sono in grado di riconoscerlo. Si fanno eluire queste sequenze per separare le sequenze che hanno riconosciuto il target da quelle che non lo hanno legato. Si vanno a amplificare solo queste sequenze e con diversi giri di questa amplificazione si ottengono sequenze con affinità elevata per il target. Si parla di una evoluzione in vitro che ripercorre quella naturale, perché ad ogni ciclo si ha una selezione delle sequenze che hanno affinità per il target che verranno non solo selezionate ma anche amplificate e rigenerate. Ad ogni ciclo aumenta l'affinità. Si tratta

Di seguito viene descritta una procedura standard per ottimizzare le molecole che riconoscono un determinato analita.

Nel tempo sono stati sviluppati diversi Aptameri che riconoscono un numero elevato di molecole o cellule. I metodi immunologici possono essere usati anche con altre molecole di bioriconoscimento che sostituiscono le IgG.

Gli anticorpi sono prodotti dai linfociti B, appartenenti alla categoria dei globuli bianchi. Un anticorpo specifico per l'analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l'analita stesso. L'analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). In questo caso viene chiamato antigene e funziona da immunogeno. Altrimenti non sarebbe sufficiente a stimolare il sistema immunitario. Spesso si va a coniugare l'analita con una molecola carrier più pesante in modo da funzionare da immunogeno (qualcosa che attiva il sistema immunitario).

ottiene un antisiero policlonale = una popolazione eterogenea di anticorpi. Sono tutti anticorpi che legano l'antigene ma in punti diversi. Spesso si usa direttamente l'antisiero. Per isolare questi singoli anticorpi e caratterizzarli (considerando che si tratta di anticorpi con diversa affinità nei confronti dei diversi epitopi, diverse proprietà chimico-fisiche). Spesso si preferisce ottenere anticorpi monoclonali che riconoscono uno specifico epitopo.

1. Si inietta l'antigene nel topo e si prelevano i linfociti B dalla milza. I linfociti B normalmente non crescono in coltura.
2. I linfociti B vengono messi a contatto con cellule di una linea cellulare di mieloma (cellule tumorali dell'organo linfatico), le quali si riproducono velocemente, sono resistenti e non producono anticorpi specifici.
3. In presenza di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole, una cellula tumorale si fonde con un linfocita dando origine a una nuova cellula.

Detta ibridoma che cresce in vitro (caratteristica della cellula tumorale) e produce anticorpi monoclonali per l'antigene inizialmente iniettato nel topo (caratteristica del linfocita B). Questi acquisiranno dai linfociti B la capacità di produrre anticorpi mentre dalle cellule di mieloma la capacità di crescere in coltura. Si ottengono così cellule in grado di produrre anticorpi. Si devono isolare le diverse popolazioni.

Selezione degli ibridomi: gli ibridomi vengono coltivati in piastre per coltura cellulare. Per selezionare gli ibridomi che producono anticorpi specifici per l'antigene si fa adsorbire l'antigene nei pozzetti di una piastra per immunoassay e a ciascun pozzetto si aggiunge il mezzo di coltura degli ibridomi (popolazione mista che contiene gli anticorpi). Se il mezzo di coltura contiene un anticorpo specifico per l'antigene, si forma un complesso antigene-anticorpo riconoscibile mediante un anticorpo anti-immunoglobulina (anti-Ig).

Specie perché riconosce la parte Fc comune a tutti gli anticorpi (marcato con un enzima). Questi anticorpi si vanno a legare all'anticorpo specifico e poiché sono legati con un enzima si riuscirà ad individuare i pozzetti positivi in cui si è formato l'immunocomplesso. Siamo ancora in presenza di popolazioni miste in quanto in ogni pozzetto è attaccato l'antigene che può essere stato riconosciuto da diversi anticorpi. Per risalire alle singole popolazioni si esegue una diluizione clonale delle cellule dei pozzetti positivi in una micropiastra per ottenere una singola cellula in ogni pozzetta. Poi le cellule sono fatte espandere per cui ogni cellula madre darà luogo a una popolazione clonale fatta di cellule identiche e poi si vanno a testare di nuovo queste popolazioni. Con questa estrema diluizione siamo sicuri che da ogni cellula che ha dato origine all'immunocomplesso si va a formare una popolazione omogenea.

più apteni con unamolecola carrier per ottenere così l’immunogeno che immunizza l’animale. Iniettando lamolecola che contiene sia il carrier che l’aptene si ottiene una popolazione eterogeneacostituita da anticorpi in grado di riconoscere l’aptene ma anche anticorpi chericonoscono il carrier e anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte dibraccio spaziatore (sono tutte popolazioni). E’importante che l’anticorpo abbia una affinità e una specificità elevate, non deve essere ingrado di riconoscere molecole simili all’analita ma diverse. Non sempre si ha bisogno dianticorpi altamente specifici. In alcune applicazioni come quelle ambientali e in alcunecliniche si vogliono vedere tutte le molecole simili che possono essere parte di contaminantio di derivati di ormoni. In un test antidoping in cui si vuole vedere se un soggetto ha abusatodi anabolizzanti prima si vuole vedere se ha preso qualsiasi di

queste sostanze .A priori si può decidere se progettare un anticorpo specifico per l'analita (si cambia posizionerendendo la parte disponibile con l'.