Chimica analitica clinica

Processo analitico

Inizia sempre con il prelievo del campione (prelievo di sangue venoso dall’avambraccio). Questa fase, unita alla conservazione del campione, definisce la fase pre-analitica. Il 45% e il 70% degli errori si verificano in fase pre-analitica perché è la fase più difficile da standardizzare. La preparazione del paziente è fondamentale per garantire che i valori misurati nei campioni rispecchino l'effettivo stato di salute del soggetto. Per analiti soggetti a ritmi cronobiologici, è di fondamentale importanza stabilire il momento corretto del prelievo.

Finalità e tecniche degli esami chimico-clinici

Gli esami chimico-clinici hanno diverse finalità (es. screening, diagnosi o monitoraggio terapeutico), sulla base delle quali possono variare le caratteristiche specifiche richieste alle tecniche di analisi. Una tecnica, affinché possa fornire dei risultati dal valore legale, deve seguire un iter. Per inserire una nuova metodica di routine, questa deve essere prima validata. Poi può essere implementata, ma la stessa metodica deve essere sottoposta a dei controlli per verificare che le prestazioni analitiche si mantengano costanti. Solo metodi già approvati da enti e istituzioni possono essere implementati.

Determinazione di imprecisione e inaccuratezza

In tutte le tecniche analitiche si parte dal determinare l’imprecisione (dispersione della misura attorno alla media, la sua causa è l’errore casuale) e l’inaccuratezza (concordanza delle misure con il valore reale; se si osservano variazioni, è dovuto a errori sistematici). La precisione è valutata attraverso analisi ripetute. Per l’accuratezza si parla di studi di recovery/recupero, interferenza e comparazione.

Tipi di errori

• Errore casuale (o indeterminato): Questo errore è presente in ogni misura poiché deriva dalle limitazioni intrinseche della misura stessa. Il suo valore varia in modo casuale e il suo effetto sui replicati può essere studiato solo con un approccio statistico. È ineliminabile, l'obiettivo è ridurlo. L'errore casuale determina la dispersione dei risultati dei replicati attorno al loro valore medio.
• Errore sistematico (o determinato): Se presente, ha un'origine definita che può essere individuata. L’errore sistematico ha valore costante per ogni replicato se le misure vengono effettuate nelle stesse condizioni sperimentali. L'errore sistematico determina lo scostamento dei risultati delle misure dei replicati (più esattamente del loro valore medio) dal valore vero della grandezza misurata.
• Errore grossolano: L'errore grossolano si presenta occasionalmente in una serie di replicati. Può essere identificato ma non analizzato in modo dettagliato. L’errore grossolano agisce tipicamente su di un solo replicato. Spesso è molto elevato e causa la presenza di un outlier (un risultato che si discosta molto dagli altri).

Precisione

La valutazione della precisione viene effettuata su campioni clinici o campioni di controllo, selezionati a differenti livelli di concentrazione in modo da coprire l'intervallo di valori fisiologici. Risultati di uno studio per la valutazione della precisione di una tecnica per l'analisi della vitamina B12 condotto nel formato 1 × 2 × 2 × 10 (un campione analizzato due volte al giorno in duplicato per 10 giorni consecutivi). Si osserva la deviazione standard oppure CV%: coefficiente di variazione % = deviazione standard / media per 100. Usato per confrontare valori molto diversi tra loro (una sorta di normalizzazione in funzione del valore medio).

Accuratezza

La valutazione dell'accuratezza può essere effettuata su campioni clinici attraverso test di recupero eseguiti su campioni fortificati. Si va ad aggiungere ad un campione che già contiene una concentrazione di analita una concentrazione nota dello stesso analita. La valutazione dell'accuratezza può essere effettuata anche con test di interferenza. Nei test di interferenza viene valutato l'effetto sull'accuratezza di sostanze che si possono trovare nel campione. Il risultato del test è in genere espresso come la massima concentrazione di interferente che può essere presente nel campione senza inficiare il risultato dell'analisi.

Esempio di interferenza è l’emolisi; si osservano livelli accettabili di emolisi oltre i quali non è più possibile condurre analisi. Altri esempi sono campioni torbidi. In presenza di interferenti, il campione deve essere sottoposto a opportuni trattamenti preanalitici per la loro eliminazione, quali diluizione, deproteinizazione (per interferenze dovute a proteine), estrazione dell'analita, ecc.

Test di comparazione

Nei test di comparazione, l'accuratezza viene valutata mediante il confronto dei risultati con quelli ricavati con un metodo di riferimento già validato (gold standard). Un tipico test di comparazione richiede 40 - 100 campioni che coprono l'intervallo fisiologico di concentrazioni e differenti condizioni patologiche (CLIA). Ogni campione dovrebbe essere analizzato con le due tecniche nello stesso giorno e nel complesso il test dovrebbe essere effettuato in un tempo compreso fra 8 (per 40 campioni) e 20 (per 100 campioni) giorni.

Considerazioni sulla variabilità e intervalli di riferimento

Nella diagnostica clinica vanno considerate anche altre variabili oltre quelle relative al metodo clinico ma del paziente. Come secondo passaggio, dopo aver validato, bisogna sapere i livelli fisiologici e patologici dell’analita. Si stanno trattando dei campioni biologici dotati di una variabilità intrinseca che non si può eliminare. Questa variabilità è presente sia all’interno della popolazione che intra-individuo. I valori di riferimento sono necessari per definire il cut-off al di sopra del quale il valore di analita è relativo di patologia.

In genere, il parametro in esame dipende anche da fattori non legati alla presenza di patologie, pertanto non esiste un valore di riferimento valido per tutta la popolazione. Valori di riferimento utili ai fini diagnostici possono però essere definiti in particolari settori di popolazione (popolazioni di riferimento) composti da individui sani con caratteristiche relativamente omogenee. I valori misurati nella popolazione di riferimento presentano comunque una dispersione dovuta alla variabilità intra- ed interindividuale. Si stabiliscono pertanto degli intervalli di riferimento, per convenzione corrispondenti all’intervallo di valori dove ricade il 95% centrale della popolazione di riferimento.

L'intervallo di riferimento dipende anche dalla variabilità preanalitica (legata a modalità di prelievo e trattamento dei campioni) ed analitica (legata a precisione e accuratezza della misura). La scelta di un intervallo di riferimento contenente il 95% della popolazione di riferimento è comunque arbitraria. Altre percentuali darebbero un numero diverso di risultati considerati sospetti o patologici.

L'intervallo di riferimento può dipendere anche da fattori non biologici, quali natura del campione analizzato (es. plasma o siero) e tecnica di analisi. Gli intervalli di riferimento vengono impiegati in chimica clinica per diagnostica, monitoraggio terapeutico e per seguire l'evolversi di situazioni fisio-patologiche. La popolazione di riferimento viene individuata nella popolazione generale mediante criteri di inclusione/esclusione. La corretta selezione di questi criteri in funzione della patologia in oggetto è fondamentale per garantire l'affidabilità degli intervalli di riferimento.

Fattori che influenzano i valori di riferimento

• Fattori genetici: Anomalie nel metabolismo legate a fattori genetici, prive di manifestazioni fisiologiche chiaramente apprezzabili.
• Fattori fisiologici: Età (es. ormoni, azotemia, colesterolo), sesso (es. sideremia, acido urico, ormoni, azotemia, gonadotropine), eccesso di peso (es. colesterolo, trigliceridi). Momento del prelievo (parametri soggetti a variazioni cronobiologiche, es. cortisolo, catecolamine, sideremia), postura e modalità di prelievo (es. calcio, proteine, bicarbonato, colesterolo).
• Fattori esogeni: Alimentazione (es. colesterolo), attività fisica.

I valori di riferimento possono essere identificati con una selezione a priori o a posteriori che dipende dalle risorse a disposizione. Bisogna conoscere i criteri di inclusione da applicare. La selezione a posteriori è più costosa ma permette di rivedere se necessario i criteri di inclusione/esclusione perché si parte da una popolazione iniziale numerosa. Può essere applicata a banche di campioni clinici preesistenti, a condizione che siano abbastanza grandi e soddisfino il criterio iniziale di selezione casuale.

Metodi statistici per ottenere intervalli di riferimento

L'ottenimento dell'intervallo di riferimento presuppone l'analisi del tipo di distribuzione del parametro in esame nella popolazione di riferimento mediante metodi di tipo statistico.

• Metodi parametrici: Richiedono che la distribuzione del parametro in esame sia approssimabile con un'equazione matematica (es. una Gaussiana). L’intervallo di riferimento viene definito sulla base di questa equazione.
• Metodi non parametrici: Sono di applicabilità più generale in quanto non richiedono una specifica distribuzione del parametro in esame.

La distribuzione Gaussiana è la più comune distribuzione analizzabile mediante un trattamento statistico di tipo parametrico. In maniera arbitraria, si definisce un intervallo di riferimento che può essere compreso da Media ± DS. Alcune distribuzioni possono comunque essere ricondotte a una Gaussiana. Spesso le distribuzioni a campana asimmetriche possono essere trasformate in distribuzioni Gaussiane riportando le frequenze nella popolazione in funzione del logaritmo del parametro in esame (distribuzioni log-del parametro).

Distribuzioni non riconducibili a un'equazione matematica vengono analizzate con trattamenti non parametrici, identificando sull’istogramma della frequenza nella popolazione dei valori del parametro l’intervallo compreso fra i percentili 2,5% e 97,5% (ovvero che include il 95% centrale dei valori). I metodi non parametrici sono di applicabilità generale, quindi sono utilizzabili per qualunque tipo di distribuzione. L'obiettivo è sempre lo stesso di tenere conto del 95 % della popolazione.

Idealmente, l’impiego degli intervalli di riferimento dovrebbe permettere l’identificazione corretta di soggetti sani e patologici. In realtà, questo non è in genere possibile perché esiste una parziale sovrapposizione tra i valori misurati nei due gruppi. Una diagnosi certa è possibile solo in assenza di sovrapposizione fra gli intervalli di valori nei soggetti sani e in quelli patologici. Da qui l'esigenza di identificare un cut-off che permette di fornire al test chimico-clinico un’efficienza diagnostica definibile come la capacità del test di discriminare tra individui sani e malati. Questa è definita attraverso un insieme di parametri che quantificano l’effettiva utilità del test.

Sensibilità e specificità diagnostica

Sensibilità diagnostica: Capacità del test di identificare correttamente un soggetto malato (o in una data condizione fisiologica).

Specificità diagnostica: Capacità del test di identificare correttamente un soggetto sano (o in una data condizione fisiologica). Nel caso del test di gravidanza, indica la capacità di classificare una donna come non in stato di gravidanza.

Valore predittivo positivo: Probabilità che un test positivo indichi effettivamente un soggetto malato (o in una data condizione fisiologica).

Valore predittivo negativo: Probabilità che un test negativo indichi effettivamente un soggetto sano (o in una data condizione fisiologica).

La sensibilità analitica è correlata al limite di rilevazione mentre quella clinica è la capacità del test di individuare individui malati. La specificità analitica è la capacità del test di riconoscere solo l’analita, nel caso di quella clinica è la capacità del test di classificare individui sani. Generalmente, per classificare un soggetto come sano o patologico sulla base del risultato di un test, viene individuato un valore (valore discriminante o cutoff) che separa nel miglior modo possibile i risultati ottenuti nei due gruppi di soggetti.

Falsi positivi e negativi, scelta del cutoff

Nella zona dei positivi si osserva anche la coda della popolazione dei soggetti sani. Con il test, questi sono classificati come patologici ma non lo sono. Si parla di falsi positivi: soggetti sani che appartengono alla coda della popolazione sana ma che hanno un alto valore dell’analita per cui classificati come patologici. Al di sotto del cut-off, vi sono soggetti della popolazione patologica ma che hanno il valore dell’analita più basso del cut-off: sono falsi negativi. Il test li classifica come sani ma non lo sono. Poi ci sono quelli che il test classifica correttamente come sani.

VP+ FN= Positivi totali VV+ FP= Negativi totali Queste frazioni di popolazioni sono usate per calcolare sensibilità e specificità. Il Valore predittivo dipende dalla prevalenza della patologia. Sensibilità e specificità diagnostica esprimono la capacità del test di identificare correttamente soggetti sani e patologici, indicando quindi anche la probabilità di ottenere risultati sbagliati. Mantenendo il cutoff intermedio, si ottiene un'efficienza diagnostica intermedia e si perde una porzione che non si perde più abbassando il valore del cut-off. Significa che si riescono meglio a vedere tutti gli individui patologici e che quindi si aumenta la sensibilità. Un cut-off basso permetterà di identificare correttamente la maggior parte dei malati, conferendo al test un’elevata sensibilità (pochi FN), ma sottostimerà la proporzione dei sani, conferendo al test una bassa specificità (molti FP).

Un cut-off elevato permetterà di identificare correttamente la maggior parte dei sani, conferendo al test un’elevata specificità (quindi pochi FP), ma sottostimerà la proporzione dei malati, conferendo al test una bassa sensibilità (quindi molti FN). La scelta del cutoff dipende dalla scelta dell’utilizzo del metodo. Valore predittivo positivo e negativo sono maggiormente correlati al rapporto costi/benefici del test (es. il valore predittivo positivo indica quale percentuale di test positivi porta effettivamente a identificare un soggetto patologico). (Probabilità che la persona che ha svolto il test è veramente incinta o no). Il valore predittivo dipende dalla percentuale della popolazione presa in considerazione.

A parità di sensibilità e specificità, valutando diverse popolazioni femminili, si osservano valori predittivi diversi. Quindi il valore predittivo dà un’informazione utilizzabile nella scelta del test per definire il cutoff a seconda dell’utilizzo. Ci sono diverse metodologie che possono essere usate a diversi livelli (screening di conferma, ecc.). Con lo stesso test, si può andare a variare il cutoff per aumentare la sensibilità o diminuire la specificità del test. La scelta dipende dal rapporto costi/benefici. Bisogna vedere le conseguenze di una diagnosi errata (falsa positività o negatività).

Test di primo livello e conferma

In genere nei test di primo livello = test di screening si prediligono test con un’elevata sensibilità (necessaria per individuare correttamente individui malati = pochi falsi negativi), scelta anche per test usati per escludere delle patologie e test per diagnosi di patologie comunque curabili. Valori elevati di specificità (→ pochi falsi positivi) vengono preferiti nel caso di:

• Test di conferma
• Test per diagnosi di patologie per le quali i falsi positivi comportano elevati rischi (fisici, psicologici o economici) per il paziente e/o la comunità.

In pratica spesso si effettuano test in sequenza, iniziando con test di screening sensibili e poco specifici in grado di identificare i soggetti a rischio e proseguendo con test più specifici (spesso più costosi).

Esempio di cut-off basso

Per la diagnosi di lesioni della cervice uterina, il Pap test, si comparano i risultati del Pap test con la diagnosi istologica dopo biopsia (il gold standard). Viene considerato anormale e quindi indicativo di rischio di cancro un Pap test ogni qualvolta sia non normale, definendo quindi positive tutte le lesioni. A seconda delle lesioni individuate, si può aumentare o diminuire la sensibilità del test. La selezione del valore discriminante viene effettuata usando tabelle o grafici che riportano sensibilità e specificità del test in funzione di tale parametro. A tale scopo viene spesso utilizzato il grafico ROC (Receiver Operating Characteristic), che permette di visualizzare in modo semplice la dipendenza di sensibilità e specificità dal valore discriminante.

100-Specificità = Falsi + I diversi risultati di specificità e sensibilità possono essere graficati nella curva in funzione del diverso cutoff. L’area sotto la curva ROC è proporzionale all’efficienza diagnostica complessiva del test (→ capacità di individuare correttamente soggetti positivi e negativi). Con il termine controllo di qualità si indica l’insieme delle procedure attuate in un laboratorio chimico-clinico per garantire l'attendibilità nel tempo dei risultati ottenuti.