Chemioterapia e farmaci biologici

CHEMIOTERAPIA e

FARMACI BIOLOGICI

Prof. Elisabetta Vegeto 29.09.2021

Chemioterapia antitumorale, antinfettiva o immunomodulante sono accumunate dal fatto che la

malattia è costituita da cellule che proliferano all’interno del nostro organismo e queste sono cellule

molto diverse dalle nostre.

lo scopo di queste tre classi di farmaci è di portare alla morte le specifiche cellule (batteriche, virali e

à

immunitarie anomale)

COVID-19: FISIOPATOLOGIA E

FARMACOLOGIA

Il covid-19 è una malattia infettiva causata dal virus SARS-Cov 2. L’evoluzione di questa malattia e la

diffusione delle informazioni relative alla malattia iniziano al 30 dicembre 2019 in cui vengono riportati

casi di polmoniti atipiche ad origine sconosciuta e il 12 gennaio venne sequenziato il genoma di questo

virus completamente nuovo e veniva così condiviso all’interno della Comunità scientifica Nazionale.

Questo si è tradotto in una rapidità impressionante nello sviluppo di farmaci (vaccino). In 5 giorni è

iniziata così la produzione di un vaccino e in pochissimi mesi è stato reso disponibile e ad oggi tutto il

mondo sta utilizzando il vaccino Pfizer, vaccino a mRNA.

Il Sars-Cov-2 è un coronavirus, virus presenti sulla Terra da migliaia di anni, ed è possibile dividerli in 4

b g,d)

sottofamiglie (a, dove le prime due sono virus specifici per mammiferi, mentre le altre due oltre

per i mammiferi infettano anche specie aviarie. All’interno delle varie sottofamiglie le specie che

interessano l’uomo sono 7 (2a e 5b) tra cui SARS-Cov-1 e MERS di cui il SARS-Cov-1 è stato individuato

nel 2009 mentre il MERS nel 2012. La SARS è una sindrome respiratoria acuta, mentre il MERS è una

sindrome respiratoria del Medio Oriente poiché è stato individuato il virus proprio nel Medio Oriente.

Queste hanno somiglianze e differenze con il Sars-Cov-2 soprattutto il fatto che i sintomi si sviluppano

immediatamente dopo l’infezione, mentre per il COVID-19 si possono avere infezioni asintomatiche o

sintomatiche con diversi giorni di latenza (fino a 14gg).

Sono stati fatti diversi studi che analizzano la sequenza genomica e la mettono a confronto con altri

coronavirus e quello di SARS-Cov-2 si nota essere molto simile ad alcuni virus che infettano ?

da dove derivi il virus e da quale virus ancestrale il virus deriva non si sa ancora

à

I CORONAVIRUS

Coronavirus perché hanno una struttura particolare,

comune a tutti i coronavirus. Infatti, hanno una

struttura a corona dove nella porzione esterna hanno 1

Gioia Chiara Belloni

proteine che emergono sulla superficie, cioè dall’envelope. Queste proteine sono le proteine S o Spike.

Quindi hanno un evelope lipidico in cui sono presenti anche alcune proteine come la proteina S e la

glicoproteina di membrana. Quest’ultima mantiene in una forma stabile quello che è contenuto nella

particella virale, cioè l’acido nucleico. Il genoma dei coronavirus è un genoma a RNA a singolo filamento

positivo piuttosto lungo. Solitamente i virus a RNA hanno un filamento piccolo, mentre quello dei

coronavirus è molto lungo (30KDa).

Tutti i coronavirus hanno la proteina S responsabile dell’attacco alle cellule bersaglio, cioè cellule che

esprime il recettore specifico per la proteina S

SARS-Cov-1 e COVID hanno lo stesso recettore perché la proteina S è simile in entrambi i virus, mentre

altri coronavirus hanno proteine S un po' diverse per cui riconoscono recettori diversi.

Conoscere queste cose può essere utile perché avere informazioni su virus simili, come il virus MERS e

SARS-Cov.1, queste informazioni possono essere utili per cercare di limitare l’infezione di SARS-Cov-2.

La proteina S è posta sulla membrana con 2 domini:

- Dominio S2: dominio ancorato alla membrana

- Dominio S1: dominio più esterno su cui sono

presenti domini più piccoli che sono i Receptor

binding domain, cioè quella parte di proteina S

all’interno del dominio S1 che fa contatto diretto

con il recettore sulle nostre cellule

La proteina S fa un trimero: la presenza delle 3 porzioni così vicine aumenta l’affinità di legame al

recettore.

La proteina S deve essere leggermente modificata quando è in uno stato attivo.

se si vuole sfruttare la conoscenza della presenza della proteina bisogna conoscere forma e

à

struttura per bloccarla o mimarla in modo tale da usare farmaci he prevengono l’attacco della

particella virale con i nostri recettori

Se si vuole usare una proteina S come competitore della capacità del virus di entrare nelle nostre

cellule bisogna fare una proteina trimerica, che sia sufficientemente stabile in modo tale che in circolo

possa competere con la Spike endogena del virus. Se non è trimerica la Spike somministrata avrà

un’affinità molto più bassa per il recettore rispetto alla Spike virale per cui la competizione sarà vinta

dalla proteina virale e non dal farmaco.

Per riuscire ad ottenere una spike trimerica stabile è necessario fare delle mutazioni sulla Spike stessa.

Esperimenti fatti prima del COVID, ma con SARS 1

à Osservando il genoma del COVID si nota

che si ha una lunga sequenza di RNA; al

terminale 5’ ????

I primi spazi aperti alla lettura (ORF), cioè

quelli che sono poi tradotti in proteina, sono

comuni cioè molto molto simili tra le diverse

specie SARS e MERS. Invece, le sequenze

successive sono un po' più diverse.

La proteina S è piuttosto simile per

à

SARS-Cov-1 e SARS-Cov-2.

La SARS 1 e la MERS hanno una mortalità molto superiore, ma sono molto limitate dal punto di vista

geografico. COVID-19 ha invece una diffusione molto più ampia per la sua elevata trasmissibilità.

2

Gioia Chiara Belloni

Cosa scede quando inaliamo particelle virali? Queste particelle hanno la proteina S sulla superficie e questi

possono incontrare il loro recettore, cioè l’ACE-2 (enzima che

converte l’angiotensina II). Alcune cellule del tratto respiratorio

hanno questo recettore e questo è molto espresso a livello degli

alveoli polmonari, cioè sugli pneumoniti 2, ma è molto presente

anche a livello dei bronchi e della cavità nasale. Attraverso la

presenza di questo recettore e alla proteina Spike il virus riesce ad

attaccarsi alle cellule umane: dominio S1 della proteina Spike sulla

parte più esterna ha il dominio di legame al recettore ACE.

Non solo a livello polmonare, ma questa è la prima sede che

incontra il virus, infatti anche altre cellule esprimono il recettore ACE 2 come il tratto GI, a livello

endoteliale ecc.. da qui deriva la gravità dell’infezione perché tramite il torrente ematico il virus può

arrivare a molti tessuti.

Gli pneumociti di tipo 2 sono quelli che producono il surfactante a differenza di quelle di tipo 1 che

fanno scambi gassosi. La cellula infettata dal virus risulta così danneggiata per cui inizia a funzionare

male anche se può essere che un soggetto infettato non si accorga di essere affetto (situazione

asintomatica).

La particella virale una volta ancorata alla membrana può entrare tramite un processo di endocitosi

oppure a seguito del legame con ACE-2 interviene un’altra proteina che è una proteasi dell’ospite

presente su cellule che esprimono ACE-2. Questa proteasi altera la proteina S in modo tale che ACE-2

riesca a staccare S1 da S2 e la nuova conformazione di S2 si ancora alla membrana e permette l’ingresso

del materiale genetico. Quindi, o attraverso l’endosoma che poi rilascia il genoma nel citoplasma

oppure tramite il rilascio del genoma grazie all’azione di proteasi di membrana si ha l’entrata del virus

nella cellula umana.

Una volta all’interno delle cellule il genoma è pronto ad essere tradotto per cui una parte dell’RNA

virale dà origine a proteine e per una parte si ha una trascrizione discontinua da cui si generano

proteine strutturali come quella S, l’envelope ecc… Le proteine che sono trascritte subito fanno parte

di un complesso di replicazione in modo tale che queste proteine prodotte possano replicare il

materiale genetico del virus.

il genoma virale entrato nella cellula viene immediatamente tradotto in RNA polimerasi RNA

à

dipendente in modo tale che questa possa duplicare l’RNA virale.

Questo enzima è sufficientemente diverso della polimerasi dell’ospite, che duplica DNA da uno stampo

di DNA, per cui si possono individuare punti di attacco selettivi per colpire esclusivamente la

duplicazione del genoma virale.

Una volta che il genoma virale è stato duplicato viene assemblato in una nuova particella virale insieme

alle proteine strutturali prodotte in modo tale che il virione maturo possa essere liberato per esocitosi

andando ad infettare altre cellule.

ACE:

RECETTORE molto importante nel controllo della pressione arteriosa e di tante altre funzioni

perché è espressa anche sull’epitelio polmonare.

L’angiotensinogeno è un peptide che viene accorciato grazie all’azione della renina ad angiotensina 1 e

grazie all’azione di un altro enzima si forma angiotensina 2 che lega il recettore AT1R (recettore

dell’angiotensina 2 di tipo 1) che è molto dannoso perché scatena: infiammazione, fibrosi, trombosi

ecc…Esistono quindi farmaci che possono inibire AT1R o farmaci che inibiscono l’enzima che converte

l’angiotensina 1 in angiotensina 2, cioè l’ACE 1.

Si hanno quindi inibitori ACE-1 o inibitori del recettore AT1R molto utili per il controllo della

à

pressione arteriosa

Invece, ACE 2 ha un’azione benefica per cui è sbagliato bloccare ACE 2 per spegnere l’infzione, infatti

ACE 2 ha un ruolo di protezione cellulare. ACE 2 diminuisce le dimensioni di angiotensina 2 a dare

angiotensina 1-7 oppure agisce su angiotensina 1 a dare angiotensina 1-9 e queste molecole agiscono su

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Gioia Chiara Belloni

recettore diversi che sono collegati con vie di segnali intracellulari per bloccare l’azione di AT1R mentre

inducono protezione cellulare

L’azione di ACE-2 è benefica

à

ACE-2 si trova anche in forma solubile e questo è importante;

ACE-2 di membrana può essere tagliato a dare solo una

porzione extracellulare solubile che è ancora in grado di legare

i suoi bersagli, ma anche altre molecole. Ci sono quindi diversi

studi che valutano le azioni di ACE-2 solubili, infatti si sta

studiando se somministrando ACE-2 solubile si riesce a

bloccare l’infezione di COVID.

Per produrre ACE-2 solubile bisogna usare tecniche

biotecnologiche quindi ad oggi siamo in grado di produrre

proteine ricombinanti che possono essere somministrate

all’uomo.

All’inizio del COVID non si sapeva se continuare o interrompere la terapia con inibitori di ACE-2 perché

questi farmaci aumentano l’espressione di ACE-2 per cui si temeva che si avesse un effetto negativo dei

farmaci che aumentassero la capacità del virus di penetrare le cellule. Tuttavia, sono stati fatti tanti

studi e si è affermato che si può continuare terapia con ACE inibitori in soggetti con COVID

• ATTACCO E INGRESSO DEL VIRUS

Se si vuole bloccare questo ingresso bene capire come avviene.

Sotto si vede la membrana epiteliale della cellula ospite dove è espresso il recettore ACE mentre quella

sopra è la membrana del virus dove è espressa la proteina spike.

Quando si forma l’interazione proteina S-ACE si ha modifica conformazionale di S1 che si stacca

fisicamente da S2 lasciando libero S2. Il dominio S2 in realtà ha una porzione, il peptide di fusione, che

si aggancia alla membrana dell’ospite permettendo la fusione della membrana virale con quella

dell’ospite e facendo sì che il genoma virale, a questo punto, sia a contatto diretto con il citoplasma

dell’ospite.

il peptide di fusione è presente a livello del dominio S2 che dopo distacco del dominio S1 viene

à

attivato

Per bloccare questa fase si possono progettare farmaci che agiscono su ACE-2 o che modificano la

proteina S. Ad oggi sono usati farmaci che bloccano proprio questi passaggi e questi sono anticorpi

monoclonali che attacco la proteina S, cioè il siero convalescente cioè siero di soggetti guariti dal

COVID che presentano anticorpi che interagiscono con Spike.

Il siero convalescente in alcuni pazienti blocca proprio la proteina S per cui si blocca la fusione del

à

virus

• TRADUZIONE del GENOMA VIRALE

L’RNA una volta entrato nella cellula ospite viene tradotto. Infatti, la prima porzione è

immediatamente tradotta dai nostri ribosomi, che non lo riconoscono come diverso. In realtà si forma

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un polipeptide che viene tagliato poi a dare molte diverse proteine e queste proteine codificate dal

segmento iniziale sono 16 aventi attività diversa.

inizialmente tutte le proteine sono unite in un unico polipeptide che successivamente è tagliato con

à

delle proteasi in 16 frammenti più piccoli

Tra queste proteine che si formano si hanno:

- RNA polimerasi RNA dipendente

- Proteasi

- Elicasi

- Altre

Sicuramente tra tutte, 2 sono le proteine più importanti

che sono codificate dai segmenti iniziali 3 e 5: proteasi

PLpro e proteasi Mpro. Queste proteasi continuano a

scindere i legami amminoacidi presenti nel polipeptide

dando origine ad altre proteine ciascuna con la propria

attività.

Lpro ha solo alcuni siti di attacco, mentre la Mpro ha

à

molti più siti di attacco ed è quella che è in grado di

generare la RNA polimerasi RNA dipendente

Su queste proteasi si trovano bersagli farmacologici

essenziali, infatti se si hanno inibitori della proteasi, il

virus infetta le cellule ma non è in grado di replicare perché non si forma la RNA polimerasi. Quindi,

bloccando le proteasi si riesce a bloccare la generazione del complesso che duplicherebbe poi i

segmenti più a valle del virus.

Gene della replicasi è un gene unico che dà origine a tante proteine coinvolte nella replicazione. A valle

si hanno diversi geni che vengono tradotti tramite la trascrizione discontinua grazie all’enzima che si

forma per taglio delle proteasi.

Le Msp sono tutte vicine e sono proteine NON strutturali, cioè sono proteine che hanno attività di

replicasi.

ci sono siti di attacco interessanti per sviluppare farmaci che hanno azione selettiva su proteine

à

virali: farmaci che bloccano la replicazione virale ?

La problematica delle varianti di SARS-COV 2 è data dalla replicazione discontinua in cui il virus può

inserire degli errori/mutazioni molto facilmente. Tuttavia, una delle proteine dell’Msp sono

esonucleasi, cioè enzimi che riparano le mutazioni per cui se solo una mutazione riesce ad inserirsi, a

causa dell’enorme diffusione del virus si creano problemi.

le varianti sicuramente sono più trasmissibili sicuramente perché altrimenti sarebbe uno svantaggio

à

per il virus

Quella più importante è la mutazione all’interno di Spike perché è una mutazione che cambia la

conformazione di Spike e la rende più efficace nel legame con ACE. Quindi, questo fa si che il virus sia

meglio trasmesso e sicuramente si ha anche un cambiamento della risposta immunitaria che può

tradursi in una riduzione dell’efficacia dei vaccini.

PRESENTAZIONE CLINICA

- Primo stadio dell’infezione è la fase virale: tante particelle virali in cui l’infezione è nella fase

precoce per cui può essere asintomatica e può dare dai 5 giorni in poi. In questa fase si ha la

propagazione del virus perché il virus entra, il genoma viene tradotto, si forma la polimerasi e 5

Gioia Chiara Belloni

tutte le proteine necessarie alla formazione di virioni maturi che possono essere rilasciati per

poter infettare altre cellule.

in questa fase si può già creare un danno a cellule che hanno

à

- Secondo stadio: è la fase polmonare perché in questo stadio si ha lesioni parenchimali per cui si

ha collasso degli alveoli ed edema

- Terzo stadio: fase iper-infiammtoria scatenata dall’infezione virale ma anche dalla reazione che

il tessuto ha all’infezione. Il sistema immunitario risulta iper-attivo e questo aggrava il danno

dando insufficienza respiratoria dovuta NON dal virus ma dalla risposta immunitaria.

il virus in questa fase può anche essere completamente assente, ma si può avere risposta

à

iperinfiamamotria per iper-attiavzione del sistema immunitario

SINTOMI

Slide e parametri clinici/sierologici:

(RT-PCR: la PCR è una reazione a catena che amplifica il DNA, quindi con l’RNA dà risultato negativo.

Con la RT-PCR prima si utilizza un enzima che retro-trascrive RNA in DNA così RNA virale viene

riconosciuto con selettività. Questo metodo che serve per rilevare qualsiasi tipo di DNA, a patto che si

conosca la sequenza.

La trascrittasi inversa è un enzima che retrotrascrive RNA a DNA per cui se nel campione che si analizza

è presente RNA, l’enzima lo trascrive. Quindi, tutto l’RNA è trascritto a DNA grazie alla retrotrascittasi

ma in questa versione RT-PCR si usano strumenti che riconoscono unicamente il DNA virale, di cui si

conoscenza la sequenza poiché è diverso dal DNA umano

metodo che permette di capire se è presente l’infezione)

à

Si possono usare anche metodi sierologici che guarda la nostra reazione al virus, infatti permettono di

verificare se ci sono gli anticorpi oppure se è presente il virus nel siero.

La risposta iper-infiammatoria del terzo stadio si scatena perché ovviamente vengono richiamate le

cellule dell’in