Cellule staminali mesenchimali, Tecnologie per terapia genica e cellulare

NICCHIA

Un’ipotesi putativa di nicchia per le MSC è una nicchia perivascolare dove interagiscono con: altre cellule

differenti grazie a molecole di adesione cellula-cellula come le caderine, matrice extracellulare grazie alle

integrine, altri recettori. Caratteristica della nicchia: è associata ad ipossia.

HOMING

L’homing è il reclutamento delle HSCs (cellule staminali ematopoietiche) circolanti nel midollo osseo.

Questo processo si verifica:

 Attraverso l’interazione cellula-cellula. Le HSC esprimono diversi recettori coinvolti nell’extravasa-

zione (appartengono alle integrine).

 Attraverso la produzione di fattori di crescita (come ad esempio lo stomal derived factor 1)

Con il termine homing si definisce quel processo biologico che conduce le cellule staminali ematopoietiche

trapiantate a raggiungere la loro cavità, ovvero nicchia nel midollo osseo.

Fasi di homing

Le varie fasi di homing di una staminale ematopoietica sono:

1. Rolling: sulle cellule endoteliali attraverso E e P-Selectine

2. Adesione: attraverso le VCAM-1 espresso dalle stesse cellule endoteliali

3. Migrazione trans-endoteliale: tramite VLA-4/VCAM-1 e VLA-4 e VLA-5/fibronectina

L’homing non ha sempre successo, difatti la % di progenitori CD-34 positivi che raggiunge la nicchia è circa

il 5%. Ciò che limita l’homing è la molecola CD-26 che ha la funzione di rimuovere dipeptidi dall’estremità

amminoterminale delle proteine.

PROCEDURA DI ISOLAMENTO DELLE CELLULE STAMINALI

Le MSC si ricavano dal sangue midollare che è scuro e viscoso, quindi si effettua una diluizione 1:5 in

DPBS (un buffer salino, il tutto sotto cappa) con 2% FBS (per nutrire le cellule in quanto sono cellule prima-

rie), e si centrifuga in gradiente di densità con aggiunta di Ficoll-Hypaque per 30 min a 240 x g. Si ottiene

quindi una stratificazione. Finita la centrifugazione sul fondo si ha il pellet rosso, successivamente uno strato

di cellule mononucleate ed infine un sopranatante acquoso. Viene aspirato il sopranatante e si preleva lo

strato di cellule mononucleate che viene lavato e quindi centrifugato. Il pellet è risospeso in un mezzo di

coltura chiamato DMEM con aggiunta di 20% FBS e 1% L-glutammina senza aggiunta di antibiotici ed anti-

micotici. Viene effettuata una conta cellulare per constatare il numero di cellule totali e viene effettuata una

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semina di 1x10 cells/cm e poste in coltura a 37°C con il 5% di CO .

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Il mezzo di coltura dovrà essere cambiato dopo circa una settimana dalla semina, le MSC crescono in ade-

Le cellule saranno espanse tramite l’al-

sione ed aderiranno alla piastra dopo circa 5-7 giorni dalla semina.

lontanamento delle cellule non aderenti nel corso dei vari cambi del mezzo, si preleverà quindi il mezzo

vecchio, lo si centrifugherà ed il pellet ripiastrato in un nuovo disco di coltura. Le cellule devono essere man-

tenute ad una confluenza del non più 70-80% per impedire la differenziazione. Le colture confluenti sa-

ranno staccate mediante l’uso di tripsina-EDTA. Per la conservazione le cellule saranno conservate in mezzo

di congelamento formato da 10% DMSO e 90% siero.

Dopo circa 5-7 settimane si ottiene una popolazione omogenea di cellule aderenti, con aspetto simil-fibrobla-

(c’è self-renewal)

stico, la quale continua a proliferare senza differenziare spontaneamente fino a 40 genera-

zioni.

Per dimostrare la staminalità vengono usate le CFU (unità formanti colonie). Le CFU possono essere visua-

L’efficienza

lizzate in modi diversi, ad esempio tramite saggi colorimetrici. di formare CFU varia da un

paziente all’altro, più si va avanti con le divisioni, più si perde staminalità, più diminuisce la capacità di

La tipologia varia con l’età.

formare CFU. Si può ad esempio usare la fosfatasi alcalina che colora le MSC