Cellule staminali ematopoietiche, Tecnologie per terapia genica e cellulare

ORGANI EMATOPOIETICI

Gli organi ematopoietici forniscono il microambiente necessario alla proliferazione e al differenzia-

mento verso varie linee cellulari.

 midollo (è l’organo

Organi mieloidi: ematopoietico per eccellenza) osseo (rappresenta il microam-

biente per le ematopoietiche)

 Organi linfoidi: timo e midollo osseo

 Organi linfoidi secondari o periferici: linfonodi, tonsille, placche di Peyer tessuto linfoide diffuso,

milza

MICROAMBIENTE EMATOPOIETICO

Il microambiente fornisce:

 Fattori fisici come tempo, spazio, superficie e viscosità del mezzo

 Fattori nutritivi come amminoacidi, zuccheri, lipidi, elettroliti, oligominerali, vitamine

 Microambiente biologico ossia cellule circostanti che secernono fattori che regolano ematopoiesi

 Fattori specifici come inibitori, stimolatori, anticorpi

PROPRIETA HSCs

Le proprietà principali delle ematopoietiche staminali sono:

 Self-renewal

 Differenziazione

 Migrazione

 Apoptosi

C’è un raffinato equilibrio tra queste quattro funzioni e questo equilibrio determina il numero di cellule

staminali presenti nell’organismo.

HSC Self-renewal associata all’espressione della telomerasi, l’assenza

La capacità di self-renewal è strettamente infatti di que-

L’interazione tra l’Angiopoietina-1

sto enzima riduce la capacità di self-renewal in HSC murine. con i

recettori Tie-2 sembra regolare lo stato quiescente di queste staminali.

HSC differenziazione

Il processo di differenziazione è strettamente regolato da un intricato numero di fattori di crescita e cito-

chine. Le citochine vengono prodotte attraverso meccanismi autocrini e paracrini da cellule non ematopoieti-

che quali stromali ed endoteliali (sono quindi prodotte nel microambiente).

 L’IL-3 ed il GM-CSF (granulocyte/macrophage colony simulating factor) inducono la proliferazione

cellulare dei progenitori iniziali.

 L’eritropoietina, IL-5, e il M-CSF (macrophage colony simulating factor) inducono la proliferazione

e/o differenziazione dei progenitori più avanzati e sull’attivazione delle cellule terminali mature

 proteggono la cellula dall’apoptosi

Flt-3 ligand e Kit-ligand

Le chemochine invece inibiscono la crescita dei progenitori, regolano la migrazione dei progenitori emato-

poietici e mediano lo sviluppo delle cellule T nel timo. media il processo dell’homing di ematopoietiche e

Cellule nello stroma producono chemochine come SDF-1

progenitori nel midollo dopo il trapianto.

Altri regolatori sono i componenti della matrice extracellulare (ECM) che fa da scaffold permettendo l’anco-

raggio delle staminali, integrine e selectine che mediano l’interazione tra le HSC e progenitori con i compo-

nenti della ECM.

HSC migrazione

La migrazione avviene in momenti specifici dello sviluppo e sotto stimolo di determinate condizioni. La mo-

bilizzazione è citochina-indotta ed incrementa il numero di HSC circolanti che raggiungendo i siti ema-

l’ematopoiesi.

topoietici (come milza, fegato e midollo) sostengono il self-renewal e

HSC apoptosi In topi transgenici dove è stato indotto l’aumento di

Esiste un meccanismo che regola il numero di cellule.

apoptosi si nota l’incremento di HSC.

HSC Plasticità

Le HSC sono sufficientemente plastiche difatti sono in grado di generare cellule non ematopoietiche inclusi

epatociti, cellule muscolari, cellule epiteliali, neuroni, cellule miocardiche ecc.

Saggi in vitro hanno permesso di identificare quasi tutti i

progenitori intermedi. Cellula che ha potenziale di stami-

nalità può formare colonie per clonogenicità. CFU è un

progenitore avanzato, subito dopo si forma la cellula ma-

tura. Sono stati fatti studi per identificare progenitori con

saggi in vitro ed in vivo.

SAGGI A COLONIE A BREVE TERMINE

I prototipi dei saggi funzionali a breve termine sono rappre-

sentati dai saggi a colonie.

La sospensione cellulare viene piastrata in terreni semisolidi rappresentato da metilcellulosa o agar. Si for-

mano quindi delle colonie che devono essere identificate in base a grandezza, morfologia, colore e sensibilità

a fattori di crescita da cui sono regolati ed immunofenotipo. Ogni colonia è un continuum di cellule. Proge-

nitori con diversi livelli di maturità sono riconosciuti mediante sensibilità di risposta a fattori di crescita, tempo

per differenziarsi (più tempo che ci vuole più la progenie è immatura), grandezza e morfologia. Questi saggi

hanno consentito di identificare i progenitori della linea eritroide. c’è

A monte, come cellula multipotente,

CFU-GEMM, progenitrice della linea

linfoide e mieloide. I progenitori della li-

nea eritroide sono BFU-E e più a valle

CFU-E ed infine EPO. Le cellule proge-

nitrici della linea granulo-macrofagica

sono: CFU-GM, CFU-G e CFU-M. I

progenitori piastrinici sono invece BFU-

MK e CFU-MK. In generale le cellule

BFU sono più a monte delle CFU.

Nei saggi funzionali vengono quindi valutati:

 La proliferazione cellulare misurata attraverso il numero di cellule prodotte

 Potenziale differenziativo stimato attraverso il numero di linee cellulari rappresentate nella progenie

prodotta.

In pratica questi saggi indicano la cellula a che grado di differenziazione si trova.

Limite dei saggi a colonia a breve termine

Questo tipo di saggio non è adeguato per identificare progenitori più a monte, inoltre agar e metilcellulosa

sono inadeguati in quanto l’efficienza del terreno semisolido non supera le tre settimane, mentre una cellula

staminale molto immatura impiega anche 3-5 settimane per differenziarsi.

COLTURE A LUNGO TERMINE

Le colture a lungo termine utilizzano il feeder-layer che è costituito da cellule che da un lato fungono da

substrato e dall’altro provvedono a secernere fattori di crescita nel tentativo di ricostruire il microam-

biente ematopoietico. È ad esempio stato utilizzato per identificare CFU-GEMM. Il feeder-layer è formato

da cellule midollari aderenti espanse per 4 settimane ed irradiate per inibire la divisione cellulare che

fungono da scaffold e linee cellulari continue murine derivate dallo stroma. Queste linee cellulari continue

murine (un esempio MS5) sono facilmente gestibili, possono essere ottenute in maniera illimitata e supportano

bene sia la differenziazione linfoide sia quella mieloide.

UNITÀ EMATONE E NICCHIA

È una struttura funzionale rappresentata da un ago aspirato midollare, indispensabile per la comprensione dei

meccanismi biologici che regolano in vivo la cavità della cellula staminale ovvero la sua nicchia.

Il microambiente ematopoietico è fatto da cellule stromali che nel loro insieme sono costituite da adipo-

citi, cellule endoteliali, macrofagi e fibroblasti.

La cellula endoteliale secerne GM-CSF e presenta molecole di adesione come ICAM e VCAM; il macrofago

invece espone i suoi fattori di crescita (come IL-6, GM-CSF ecc).

Concetto di nicchia

La nicchia è un microambiente stabile per la cellula staminale, è costituita da cellule e componenti della ma-

l’autorinnovamento nonché

trice extracellulare che può ospitare una o più cellule staminali e controllarne la

produzione di progenie, la matrice extracellulare insieme alle molecole di adesione definiscono i confini spa-

ziali della nicchia e modulano l’espressione di molecole di adesione nonché quelle deputate al signalling.