Cellule staminali embrionali, Tecnologie per terapia genica e cellulare

DERIVAZIONE ES EMBRIONALI

La cellula staminale embrionale deriva quindi dalla blastocisti fatta da inner cell mass ed ectoderma

esterno, oppure deriva sempre dalla blastocisti ma formata tramite zigote fecondato (formando SCNT). Dalle

ES embrionali si sviluppano i 3 foglietti embrionali e si possono eseguire i seguenti tipi di studio:

 Biologia dello sviluppo (dallo sviluppo dei tre foglietti embrionali)

 Test di farmaci in vitro

 Terapia cellulare

Esistono 3 specifiche fonti di pluripotenti:

 Da zigote fecondato (che dà blastocisti)

 Dal trapianto del nucleo di una cellula somatica in un ovocita per far sviluppare una blastocisti

(nuclear transfer)

 Tramite reprogramming

…dallo sviluppo embrionale giorni si forma la blastocisti e dall’inner cell mass si formano i 3 foglietti

Lo zigote viene fecondato, dopo 3-5

embrionali (ectoderma, mesoderma, endoderma).

…dal nuclear transfer

Il nuclear transfer prevede l’estrazione del nucleo da una cellula uovo non ancora fecondata e l’iniezione in

nucleo di una cellula adulta differenziata. Si mette ad esempio il nucleo del fibroblasto nell’oo-

tale cellula del

cita. L’oocita di per sé è totipotente in quanto può dare sia tessuti embrionali che extra-embrionali. La cellula

uovo ingegnerizzata con il nucleo della cellula somatica (che di per sé non è staminale) viene attivata con il

litio e inizierà a produrre una blastocisti dal quale si potranno estrarre cellule embrionali. Le cellule staminali

così create altro non sono che copie o cloni della cellula somatica di partenza.

…dal reprogramming

Il reprogramming consiste nel riprogrammare una cellula somatica affinché torni allo stato pluripotente, ossia

torni ad essere staminale dallo stato differenziato. Questo processo forma quelle che sono le cellule iPS o

cellule pluripotenti indotte. Per arrivare ad ottenere le iPS si parte da una procedura ex vivo. Le cellule iPS

sono ottenute introducendo 4 particolari geni (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc) nelle cellule somatiche estratte

dal paziente tramite retrovirus. Dopo qualche settimana di coltura si è visto che queste cellule potevano

essere riprogrammate fino ad arrivare ad uno stadio simile a quelle embrionali. Per alcuni tipi cellulari il

reprogramming funziona meglio che per altri, la percentuale di reprogramming è bassissima e per aumen-

tare la percentuale si cambia il cocktail o aggiungendo molecole che possono aiutare.

Verificare il potenziale di pluripotenza

Per verificare che una cellula staminale è realmente pluripotente si possono utilizzare due metodi: nel primo

c’è l’uso di un topo chimerico, ossia quando nella blastocisti della topina pseudogravida vengono iniettate

cellule derivate da nuclear transfer o reprogramming, con conseguente formazione di un topo chimerico. Nel

secondo caso si iniettano le cellule potenzialmente pluripotenti nel topo nudo, se c’è la formazione di un

teratoma allora le cellule sono pluripotenti. blastocisti l’embrione va

Le ES differenziano riproducendo quello che avviene in vivo. Dalla avanti nello

sviluppo, le ES ripercorrono le stesse tappe e ci permettono di capire un gene di nostro interesse che ruolo ha

nel processo differenziativo.

BIOLOGIA DELLO SVILUPPO A PARTIRE DAI FOGLIETTI EMBRIONALI, IL DIFFERENZIA-

MENTO

Fattori che influenzano il differenziamento delle ES

I fattori che possono influenzare il differenziamento delle ES:

 Mezzo di coltura opportuno spinge verso un tipo di differenziamento o un altro

 Presenza o assenza di siero (derivati del mesoderma richiedono alte percentuali di siero, derivati

dell’ectoderma no perché il siero inibisce il differenziamento neuronale)

 Colture 2D (bidimensionale, standard) o 3D (tridimensionale, molto usata per le pluripotenti, si

fanno aggregati di cellule in sospensione, si riproduce la struttura embrionale, si formano i 3 fo-

glietti embrionali)

 Aggiunta di molecole (fattori induttivi o stimoli)

 Inserzione di un gene specifico

ES si usano per la ricombinazione analoga per fare transgeni. Si può inserire nella cellula un gene che potenzia

il differenziamento verso un destino differenziativo e possiamo capire cosa succede se overesprimiamo un

gene.