Cellule staminali

Cellule Staminali

Si deve a Haeckel il merito per avere coniato nel 1868 il termine “staminale” per

indicare una cellula capostipite. Per essere definite staminali le cellule devono

rispondere a due criteri fondamentali: possedere potenza differenziativa e capacità

di auto-rinnovamento (self-renoval). La cellula staminale, infatti, è una cellula che è

in grado di dividersi per un tempo illimitato dando luogo ad una divisione

asimmetrica. La divisione asimmetrica implica che le due cellule figlie vadano

incontro a destini differenti: una delle due sarà una cellula progenitrice, l’altra,

esattamente come la madre, sarà una cellula staminale. Tutta via se consideriamo

una determinata popolazione staminale, può accadere che una cellula dia luogo

anche a una divisone simmetrica originando quindi o due progenitori o due

staminali, a seconda delle necessità di quella determinata nicchia staminale. Per

esempio, in seguito ad un danno si può manifestare la necessità di sostituire molte

cellule differenziate ed allora sarà preferibile l’attuazione di una divisione

simmetrica dove la staminale origina due progenitori proliferanti che dividendosi

per un tempo definito genereranno due progenitori che dividendosi a loro volta,

porteranno a cellule terminalmente differenziate. Si può verificare anche la

situazione opposta in cui un depauperamento della nicchia terminale rende

necessaria una divisone simmetrica che porti alla formazione di due cellule staminali

le quali sosterranno la generazione di un elevato numero di progenitori.

Determinare la staminalità

Una cellula staminale deve avere la capacità di mantenere il self-renoval e la

potenza differenziativa; tutta via determinare la staminalità di una cellula non è

semplice perché richiede uno studio approfondito e pertanto comporta un alto

rischio di danneggiare la cellula e di alterarne il comportamento.

Saggio retrospettivo funzionale

Un animale viene letalmente irradiato: lo si sottopone ad una dose di radiazioni tale

da uccidere tutte le sue staminali multipotenti ematopoietiche. È possibile

trapiantare da un topo sano il midollo osseo e di fatto permettere la vita del topo

letalmente irradiato. Il saggio retrospettivo funzionale può essere inquadrato in

questi termini: il topo letalmente irradiato vivrà se sono state trapiantate delle

staminali che generano un pull di cellule che rimarrà attivo per tutta la vita del topo.

Al contrario, se ad essere trapiantati soni dei progenitori proliferanti, osserverò che

il topo per un breve tempo sta bene ma dopo non molto muore perché queste

cellule trapiantate non hanno capacità di self- renoval. È possibile sfruttare la

fluorescenza delle GFP (proteine fluorescenti verdi che i topi transgenici esprimono

sulle loro cellule) per marcare le cellule dell’organismo donatore.

Le cellule staminali possono essere classificate sulla base del quantitativo di tipi

cellulari a cui sono in grado di differenziare

Cellula totipotente: è in grado, dividendosi, di sostenere la generazione di

 tutti i tipi cellulari che caratterizzano l’organismo compresi i tessuti extra-

embrionali. L’unica cellula totipotente è rappresentata dallo zigote.

Cellula pluripotente: cellule ESC presenti nella massa cellulare interna

 (embrioblasto) della blastocisti, poco prima dell’impianto nella mucosa

uterina, stadio molto precoce nello sviluppo embrionale. Si tratta di cellule

che sono in grado di dare origine a progenitori che possono differenziarsi in

uno qualsiasi dei tessuti che derivano dai tre foglietti embrionali; endoderma,

mesoderma, ectoderma.

Cellula multipotente/oligopotente: cellule che hanno la capacità di

 differenziarsi in diversi tipi cellulari di solito residenti in quel tessuto.

Cellula bipotente/unipotente: in grado di dare luogo solo a uno o due tipi

 cellulari.

Cellule ESC

Le cellule ESC presenti nella massa cellulare interna (embrioblasto) della blastocisti,

poco prima dell’impianto nella mucosa uterina, stadio molto precoce nello sviluppo

embrionale. Si tratta di cellule che sono in grado di dare origine a progenitori che

possono differenziarsi in uno qualsiasi dei tessuti che derivano dai tre foglietti

embrionali; endoderma, mesoderma, ectoderma. Le staminali embrionali sono state

isolate per la prima volta da Evans e Kauffman i quali sono riusciti partendo da una

blastocisti, a rimuovere il trofoblasto ed a isolare queste cellule. Una volta messe in

coltura esse dimostrarono capacità di self-renoval per un tempo illimitato.

Test per dimostrare la pluripotenza

Test del differenziamento in vitro: partendo da cellule che crescono su un

 feeder layer, si verifica che queste cellule siano effettivamente in grado di

generare progenitori proliferanti.

Formazione di chimere: iniezione di queste cellule nel blastocele di una

 blastocisti ospite. Queste cellule vanno a cooperare con le ESC della cellula

per sostenere lo sviluppo dell’embrione. Se le cellule iniettate sono

effettivamente pluripotenti, significa che dovranno andare a sostenere la

formazione di qualsiasi tessuto derivante da uno dei tre foglietti embrionali,

pertanto, mi aspetterò di trovare in tutti i tessuti dell’embrione una situazione

chimerica con due tipi cellulari con forma diversa. Se la situazione chimerica è

verificata solo in alcuni distretti tissutali, tali cellule non sono pluripotenti

perché non hanno contribuito alla formazione di tutti i tessuti.

Formazione di teratomi: i teratomi sono tumori dei tessuti embrionali, le

 cellule ESC portano con sé la caratteristica della tumorigenicità. Inietto le

cellule che voglio testare sottocute in un topo immunodepresso, che quindi

non reagisce identificando le cellule come not-self, se queste cellule portano

alla formazione di teratomi avrò la prova tangibile della loro effettiva

pluripotenza. La tumorigenicità non può essere ignorata per questo non è

ancora possibile utilizzare queste cellule in sicurezza sui pazienti.

Nel 1998 James Thompson pubblica su Science i dati di una ricerca: era riuscito ad

isolare le ESC da una blastocisti umana. L’utilizzo di blastocisti umane scatenò un

enorme polverone di natura etica. In certi casi di infertilità è possibile intraprendere

l’IVF, in pratica la fecondazione avviene in provetta dopodichè quando lo sviluppo

embrionale è iniziato, si procede con l’impianto. Prima che ciò avvenga, la donna

viene sottoposta a stimolazione embrionale attraverso estrogeni in modo che si

abbia la formazione di un numero di ovociti superiore a 1 i quali vengono poi

fecondati laboratorialmente ed impiantati dopo un paio di giorni. Se la stimolazione

ormonale porta alla formazione di molti ovociti, questi non vengono tutti impiantati

ma congelati in azoto liquido e conservati come scorta. In USA sono state usate

queste blastocisti per gli esperimenti sulle cellule ESC. È chiaro che rispetto alle

staminali adulte, le ESC lascino intravedere molti più utilizzi, ad oggi queste cellule

non sono utilizzate in medicina rigenerativa per il problema della sicurezza riguardo

alla formazione di teratomi inoltre sarebbero poi necessarie terapie con

immunosoppressori.

Cellule ASC

Virtualmente si ritrovano in tutti i distretti tissutali dato il loro ruolo nella

rigenerazione dei tessuti. Negli anni ’90 Weiss e Brent Reynold identificarono le

cellule staminali neurali e nel cervello maturo nella zona sottoventricolare e

nell’ippocampo. Queste cellule sono capaci di generare nuovi neuroni che sono

cellule post-mitotiche. Queste staminali sono poche nei tessuti e poco proliferanti.

Nella nicchia si automantengono e sono in grado di generare cellule differenziate.

Sono in grado di dividersi in modo asimmetrico ma può accadere che vadano

incontro a divisione simmetrica in caso di necessità. In condizioni di equilibrio la

divisione è asimmetrica con 50% di figlie staminali e 50% di progenitori proliferanti.

Sono stati ipotizzati due meccanismi per spiegare il mantenimento in condizioni di

equilibrio di queste percentuali: l’asimmetria ambientale e l’asimmetria divisionale.

secondo la teoria dell’asimmetria divisionale la divisione asimmetrica genera

un’asimmetria interna in base alla quale le cellule figlie sono dotate di determinanti

diversi già al momento della nascita. Secondo invece la teoria della divisione

ambientale, non c'è un'asimmetria interna ma è l'ambiente a influenzare i destini

delle due cellule figlie; infatti inizialmente le due figlie sono simili, indistinguibili, è

l'ambiente con le sue differenti influenze che, dopo la nascita, esercita una

fortissima influenza in queste cellule tale da indirizzarne una al destino staminale

una al destino da progenitore. I due modelli si integrano e cooperano nel tentativo

di spiegare la generazione di questa simmetria.

È indubbio che la divisione asimmetrica porti alla generazione di una cellula che non

è più staminale appunto esistono nei vantaggi nel disporre di una cellula che è un

progenitore ancora in grado di proliferare; infatti tali progenitori proliferano per un

periodo limitato nel tempo e vengono indicati con il termine di TA progenitors.

Questi tipi cellulari transitano dal carattere staminale al carattere differenziato e

grazie alla loro capacità di proliferare amplificano il numero di progenie

differenziata. A sostegno dell’asimmetria divisionale va una formulata negli anni ’70

che va sotto il nome di Teoria dei Filamenti Immortali. Si tratta di un meccanismo

messo in campo dalle staminali per evitare di accumulare mutazioni mutazioni

potenzialmente rischiose per l’insorgenza di tumori. Si t si tratta di una teoria non

universalmente accettata ma tuttavia dimostrata in vari tipi di staminali: satelliti del

muscolo scheletrico, epiteliali. Le molecole di DNA delle staminali sarebbero in

qualche modo marcate un filamento è marcato, ha un tratto dell'immortalità. Nel

momento in cui la staminale duplica il proprio genoma (fase S) e va incontro (fase

M) a ripartizione del materiale genetico, un meccanismo molecolare non ancora

identificato fa sì che nella divisione asimmetrica la cellula figlia che rimarrà

staminale, e non quella destinata a divenire progenitore, erediti quella molecola di

DNA che contiene il filamento marcato. Secondo questa ipotesi si ammette che le

cellule staminali siano in grado di segregare in modo asimmetrico le loro molecole di

DNA in modo tale che il filamento immortalizzato venga mantenuto nella cellula

futura staminale e non nell’altra: si contribuisce al mantenimento della staminalità

di questo genoma.

Via di segnalazione di WNT beta-Catenina

Studi condotti su tumori del colon e del retto hanno permesso di fare numerose

scoperte. È stata osservata una predisposizione allo sviluppo di certi tumori del

colon come la poliposi ereditaria del colon che è riconducibile a mutazioni a carico

del gene codificante la proteina APC: adenomatose poliposis coli. L’adenoma si

origina in quelle cellule in cui entrambe le copie del gene codificante per APC sono

perse. Questa proteina APC è infatti coinvolta in un’importante via di segnalazione:

la via di segnalazione di WNT e quando il gene è mutato questa segnalazione subirà

un’aberrazione impropria e self-renoval e controllo della proliferazione saranno

compromessi.

WNT sono importantissime proteine secrete con funzione di mediatori locali.

Nell’uomo esistono 19 proteine WNT diverse. Queste proteine agiscono durante lo

sviluppo, sono infatti importanti morfogeni. La via di segnalazione di WNT è stata

osservata per la pria volta in drosophila melanogaster dove le WNT codificano per il

gene wing-less che se mutato porta allo sviluppo anomalo di mosche prive di ali e a

cui la stessa via di segnalazione deve il proprio nome. Lo stesso gene che in

drosophila prende il nome di WNT, nel topo è definito INT ed è coinvolto nello

sviluppo di tumori della mammella.

Queste proteine WNT sono appositamente modificate all’estremità ammino-

terminale per aggiunta di un acido grasso che facilita l’ancoraggio con la membrana

plasmatica dove WNT si legherà al suo recettore.

Quindi WNT non è altro che il ligando di un recettore che si trova sulla membrana

plasmatica, si forma così un complesso ligando-recettore che porta al reclutaento

intracellulare della proteina dishevelled che sarà importante per iniziare la cascata

segnalatoria intracellulare a valle. Esistono tre diverse vie di segnalazione attivate

dal legame di WNT con il proprio recettore qui analizziamo la prima.

Via canonica della Beta-Catenina

Troviamo la Beta-catenina nelle giunzioni aderenti delle cellule epiteliali dove di

fatto collega le caderine, che sono coinvolte nell’adesione cellula-cellula, col

versante intracellulare, in particolare con i microfilamenti actinici.

Sulla membrana plasmatica è presente il recettore Fizzled, un recettore specifico

per WNT, accoppiato a g-proteine eterodimeriche che attraversa 7 volte la

membrana. Fzl tutta via non è da solo perché sulla membrana plasmatica si trova

anche un altro recettore: LRP “proteina correlata al recettore lipoproteine”, questo

funziona da co-recettore.

Cosa succede IN ASSENZA DI WNT

Se WNT è assente non può legarsi al proprio recettore Fzl, di conseguenza a

 livello di Fzl non viene reclutata la proteina dishevelled.

In queste condizioni è presente nel citoplasma un complesso che fosforila la

 beta-catenina.

La beta-catenina viene fosforilata e tale fosofrilazione costituisce un segnale

 che la destina alla poliubiquitinazione: un’etichetta per la degradazione a

livello proteosomale

Di conseguenza la beta-catenina non si accumula

 In assenza di WNT la fosforilazione della beta-catenina viene catalizzata da

 specifiche proteine con attività chinasica in particolare GSK3 e CK1; in assenza

di WNT queste chinasi fosforilano la beta-catenina che verrà poliubiquitinata

e degradata a livello del proteosoma.

Tuttavia queste due chinasi agiscono una di seguito all’altra e possono

 svolgere la loro funzione correttamente solo se formano un complesso ben

strutturato con altre due proteine scaffled che sono la axina e la APC.

Il ruolo delle scaffled è quello di mantenere in un complesso ben organizzato

 le due chinasi che dovranno fosforilare la beta-catenina.

WNT: assente

Non si lega a Fzl

 La beta-catenina viene fosforilata ad opera di CK1 e GSK3 unite in complesso

 con APC e axina

La beta catenina non si accumula



Cosa succede IN PRESENZA DI WNT

WNT si lega al suo recettore Fzl che coopera a sua volta con il co-recettore

 LRP.

Questo legame induce la formazione del complesso ligando-recettore-

 corecettore

A questo punto la proteina dishevelled, che prima era inattiva, viene attivata

 e reclutata a livello del recettore Fzl.

La formazione del complesso ligando-recettore-corecettore provoca un

 disasemblaggio del complesso responsabile della fosforilazione della beta-

catenina. Questo accade perché le due chinasi e l’axina vengono reclutate a

livello della coda citosolica di LRP

Quindi se WNT è presente, il complesso responsabile della fosforilazione della

 beta-catenina è distrutto in quanto le sue componenti vengono in parte

reclutate a livello della membrana plasmatica. Di conseguenza la beta-

catenina non potrà essere poliubiquitinata e degradata.

La beta-catenina diventa stabile, si accumula e trasloca dal citoplasma al

 nucleo.

Nel nucleo la beta-catenina si lega al promotore dei geni bersaglio per WNT.

 La beta-catenina, infatti, è un coattivatore trascrizionale che agisce con altre

proteine che sono LEF1/TCF; con queste beta-catenina forma un complesso

che promuove la trascrizione dei geni bersaglio per WNT che sono potenti

stimolatori della proliferazione cellulare. Normalmente l’espressione di questi

geni è silenziata dal repressore Groucho che viene spazzato via dalla beta-

catenina.

WNT: presente

Si lega a Fzl che coopera con LRP

 Viene attivata e reclutata dishevelled

 Si disassembla il complesso proteico responsabile della fosforilazione della

 beta catenina perché le chinasi sono reclutate a livello della coda citosolica

di LRP

La beta-catenina non viene fosforilata, diventa stabile

 La beta-catenina passa al nucleo dove funge da coattivatore trascrizionale.



Se APC non funziona in modo corretto nel formare il complesso responsabile

della fosforilazione della beta-catenina, si avrà una segnalazione aberrante per

cui anche in assenza di WNT la beta-catenina è stabile e si accumula provocando

la poliposi.

Apc mutato = beta-catenina sempre stabile= funge sempre da coattivatori di geni

stimolatori della proliferazione cellulare= proliferazione incontrollata.

La via di segnalazione di WNT non è fondamentale solo per il mantenimento

dello stato proliferativo ma anche per garantire competenza al differenziamento.

Quindi quando WNT è bloccato anche il differenziamento è anomalo, questo

perché WNT attiva anche l’espressione di geni coinvolti nella via di segnalazione

di Noch.

Via di segnalazione di Noch

La via di Noch controlla diversi destini differenziativi. Noch è un recettore che si

trova sulla membrana in forma eterodimerica e viene attivato per processazione

proteolitica. La via di segnalazione di Noch è stata osservata per la prima volta

durante lo sviluppo delle cellule nervose in drodophila dove media l’inibizione

laterale. L’inibizione laterale è un fenomeno per cui quando una cellula si differenzia

ad un certo tipo cellulare, le cellule circostanti vengono inibite dall’avere il

medesimo destino. Questa inibizione è mediata dall’interazione tra il recettore

Noch, gli