Cellule staminali

Il ruolo di H nella via di segnalazione

Arriva H che si lega al proprio recettore Patched che recluterà iHog. Questo Patched successivamente alla formazione del complesso ligando-recettore, verrà internalizzato.

Nel momento in cui Patched viene internalizzato, non tiene più inibito Smoothened all'interno delle vescicole. Smoothened è libero di muoversi sulla membrana plasmatica e qui recluta parte del complesso multiproteico responsabile dell'organizzazione delle chinasi che fosforilavano la CI.

Quindi in presenza di H la CI non viene degradata e non si formerà il frammento che terrà spenti i geni bersaglio per H i quali adesso verranno espressi.

Il gene che codifica per Patched è spesso mutato nei carcinomi della pelle. Nel tentativo di trovare un approccio terapeutico per questi tumori chiaramente associati ad un'alterazione della via di segnalazione di H, sono stati condotti studi sfruttando un particolare farmaco: la ciclopamina che è un...

inibitore della via disegnalazione di H. La via di segnalazione di H è infatti alterata portando alla formazione di questi carcinomi, quindi, trovare un inibitore di questa via disegnalazione potrebbe prefigurarsi come un efficace trattamento. La ciclopamina viene isolata dal giglio selvatico che cresce in USA ed è un inibitore della via di H perché si lega a Smoothened e lo inibisce. Nella progenie di pecore che pascolavano dove crescevano questi gigli, è stato osservato l’insorgere di una grave malformazione: la ciclopia, per cui le pecore sviluppavano un solo occhio. Questo accadeva proprio perché H è un importante morfogeno e se viene inattivato porta a uno sviluppo anomalo.

Ciclo Cellulare

Prima che una cellula si divida, deve necessariamente replicare il proprio DNA. Quindi la duplicazione del DNA e la ripartizione in copie equamente segregate sono eventi che devono sempre avvenire insieme. Indipendentemente da quale ciclo cellulare si consideri,

la fase S (sintesi del DNA), e la fase M (mitosi) sono due fasi assolutamente indispensabili. La fase S è lunga (anche 10 ore) quindi ricopre circa metà del ciclo, mentre la fase M è molto più breve e si conclude in meno di un'ora nei mammiferi. Queste fasi devono avvenire ovviamente in maniera corretta per assicurare la corretta progressione tra i vari step del ciclo cellulare. L'interfase oltre alla fase S prevede anche 2 fasi di intervallo GAP: GAP1 che precede la fase S e GAP 2 che segue la fase S e precede la fase M. Dal punto di vista biosintetico sia G1 che G2 costituiscono fasi molto attive, la cellula cresce e sintetizza i suoi organuli ecc. Non si tratta di semplici fasi di passaggio ma di step biosinteticamente attivi fondamentali per la crescita e la regolazione. È proprio alla fine della G1 che troviamo uno dei principali centri di controllo, il punto di restrizione: un vero e proprio check-point che controlla il passaggio dalla

G2 alla M, l'uscita dall'interfase. In questi check-point la cellula controlla che tutto quello doveva avvenire sia avvenuto in maniera corretta. Alterazioni dei punti di controllo possono avere gravi conseguenze come una proliferazione cellulare incontrollata. Dalla G1 si può transitare in una peculiare sottofase: la G0, una specie di fase di quiescenza in cui la cellula entra dietro particolari stimoli. Il superamento del primo check-point alla fine della G2 promuove l'uscita dall'interfase e l'ingresso in fase M la quale è a sua volta suddivisa in 5 sottofasi: profase, prometafase, metafase, anafase, telofase. Fra metafase e telofase si colloca un altro importante punto di controllo che è il SAC Spinal Assembly Complex. La cellula a questo punto sta per passare in anafase dove grazie al fuso mitotico o meiotico il materiale genetico viene ripartito; prima quindi si rende necessario un controllo per assicurare che questo fuso sia in grado di funzionare.

Se i microtubuli sono danneggiati il ciclo cellulare si blocca in corrispondenza del check-point poiché la cellula non potrà garantire la ripartizione equa del DNA tra le cellule figlie. Durante l'interfase il centrosoma, il centro organizzatore dei microtubuli che contiene la coppia di centrioli, è andato incontro a duplicazione ed è qui a livello di questo centrosoma che, nella profase della fase M, inizia l'organizzazione del fuso meiotico o mitotico. Una cellula che va incontro alla fase M sarà soggetta ad una grande riorganizzazione del citoscheletro: la coppia di centrioli si allontana e si polimerizzano i microtubuli. La cromatina di un nucleo interfasico prevede zone eucromatiche ed eterocromatiche, quando la cellula entra in fase M si raggiunge la massima condensazione della cromatina. Durante la profase si ha la scomparsa del nucleolo (una sotto regione del nucleo dove sono condensati tratti dei DNA che codificano per RNA ribosomiali).

sicondensa la cromatina ed i cromosomi appaiono visibili, comincia ad organizzarsi il fuso e si dissolve l'involucro nucleare. I meccanismi del ciclo cellulare sono stati scoperti in:

• Cellule di mammifero in coltura
• Embrioni soprattutto di anfibi
• Cellule di lievito

A partire dagli anni '70 del secolo scorso sono andate avanti queste tre linee di ricerca che hanno portato ad importanti scoperte. Negli anni '70 Rao e Johnson portarono avanti esperimenti di fusione cellulare e si iniziò a capire che parlando di regolazione del ciclo cellulare devono esistere segnali chimici che diffondano dal citoplasma al nucleo e siano in grado di regolare le varie fasi del ciclo cellulare. Grazie a virus Sendai inattivati ottennero un eterocarion: in laboratorio prendono due cellule una bloccata in fase S o M ed una bloccata in G1. Grazie all'utilizzo di virus Sendai inattivati, virus che promuovono la fusione delle membrane, queste cellule sono fuse insieme dando origine

ad un eterocarion, una cellula, cioè, costituita da una solo membrana ma contenente due nuclei ognuno derivante da ciascuna delle due cellule di partenza. Il nucleo che era in G1 dopo la fusione con il nucleo in fase M subisce la segnalazione della cellula in fase M e, anche senza aver duplicato il genoma, ha una forte spinta ad entrare in M, inizia quindi a condensare cromatina formando un cromosoma costituito ovviamente da un solo cromatide perché non è avvenuta duplicazione. Questo dimostra il ruolo dei segnali chimici citoplasmatici importantissimi nella regolazione cellulare.

Quando il nucleo in fase G1 si fonde con un nucleo in S, il nucleo in G1 comincia a subire la segnalazione della cellula in G1 e inizia a duplicare il DNA.

L'eterocarion composto invece a G1 e G2 non entrava invece in S poiché evidentemente mancava l'attivatore presente nel nucleo della cellula in fase S.

Quando la cellula che si trovava in una qualsiasi sottofase dell'interfase,

veniva fusacon una cellula in fase M, veniva spinta ad entrare a sua volta in M. doveva quindiesistere un fattore che spingesse le cellule ad entrare in M.Grazie ad esperimenti condotti su embrioni di animali è stata ipotizzata l'esistenza diun fattore promotore della mitosi: MPF.Le cellule uovo fecondate di molti animali in virtù dell'accumulo di tutta una serie disostanze di riserva per lo sviluppo embrionale, hanno grandi dimensioni. La cellulauovo subito dopo la fecondazione va incontro a divisioni successive molto rapide,passa attraverso la fase S e poi attraverso la M e nel giro di poco tempo si arriva dauna cellula allo sviluppo di un embrione costituito da un ragguardevole numero dicellule. Cellule che tuttavia, essendo mancate le fase GAP tra S ed M che fornisconoalla cellula il tempo di accrescersi, soni sempre più piccole. Queste rapide divisioni acui la cellula uovo va incontro subito dopo la fecondazione, prendono il nome didivisioni di

clivaggio e rappresentano una sorta di ciclo semplificato che infatti non comprende le fasi GAP. La cellula uovo in questa fase rappresenta un ottimo modello sperimentale perché è grande e più facilmente manipolabile, è anche possibile mediante blanda centrifugazione ottenere notevoli quantità di citoplasma praticamente puro utilizzabile in laboratorio per studi cell-free, acellulari. In virtù delle loro grandi dimensioni le cellule uovo sono anche facilmente microiniettabili.

La cellula uovo è ferma in G2, attraverso la stimolazione mediata da progesterone questa cellula entra in meiosi, compie la prima divisione meiotica e poi la seconda ma non la completa: si ferma in metafase 2 e concluderà la seconda divisione meiotica solo se fecondata. Questi modelli hanno permesso di ottenere cruciali informazioni sui meccanismi di regolazione del ciclo cellulare.

Nel 1971 Masui e Market dimostrarono l'esistenza sperimentale del MPF

maturationpromoting factor. Dovettero passare altri 17 anni perché la natura chimica di MPFfosse chiarita.Come è stato dimostrato MPF?Partono da oociti di anfibio sottoposti a stimolazione con progesterone chepromuove la maturazione e l'entrata in meiosi 1 e poi in M2 dove si ferma in attesadella fecondazione. Masui e Market dimostrano che il citoplasma prelevatodall'oocita maturo in M2 e microiniettato in un oocita immaturo in G2, induce lamaturazione dell'oocita che fa la prima divisione meiotica e si ferma in M2.Capiscono quindi che in questo citoplasma doveva essere presente un fattore chepromuovesse la maturazione in assenza di progesterone. Ci sono voluti 17 anni peridentificare il fattore e comprenderne la struttura formata da due sub unità:catalitica e regolatrice. Inoltre era evidente che tale fattore entrasse in gioco in faseM mentre scompariva in s, doveva quindi essere responsabile di eventi che siverificano in mitosi.Hartwell e Nursescoprirono come è regolato il ciclo cellulare grazie ad esperimenti condotti sui lieviti; in particolare Hartwell studiò Saccaromyces Cerevisiae mentre Nuerse studiò Pombe. Gli esperimenti sui lieviti hanno permesso la scoperta dei geni CDC (Ciclo Divisione Cellulare) che codificano per prodotti che hanno un ruolo fondamentale nella regolazione del ciclo cellulare. Tali scoperte sono state realizzate grazie alla scoperta di ceppi mutanti. Saccaromyces Cerevisiae: organismo unicellulare eucariote che offre molti vantaggi come modello sperimentale: economico da crescere in laboratorio e con un ciclo cellulare breve (90 minuti). Cerevisiae è un organismo aplodiplonte, questo significa che esiste sia in forma aploide che diploide. Può riprodursi asessualmente attraverso la gemmazione ma anche sessualmente attraverso il mating type di due tipi sessuali distinti: A ed alpha. Lo zigote può riprodursi per mitosi quando i terreni sono ricchi di nutrienti; la carenza di nutrienti induce invece la formazione di aschi, contenenti spore che possono essere disperse nell'ambiente.