Laboratorio di cellule staminali

Laboratorio di cellule staminali

Le cellule staminali sono utilizzate nella ricerca di base per comprendere i meccanismi molecolari che caratterizzano la nicchia e che governano la staminalità, la proliferazione, il differenziamento, il mantenimento della quiescenza (evita la manifestazione di errori durante la fase di duplicazione del DNA) e lo sviluppo. Inoltre, sono utilizzate nella terapia cellulare che prevede la somministrazione diretta di cellule staminali, il trapianto di cellule differenziate derivate dalle cellule staminali o co-trapianti di cellule staminali e differenziate, nella terapia genica per curare patologie ereditarie e negli studi di tossicità come modello per capire i meccanismi di azione dei farmaci nello stadio pre-clinico di sperimentazione.

[La commercializzazione dei prodotti terapeutici a base di cellule staminali e la ricerca sulle cellule staminali è fortemente incrementata nell’ultimo decennio con una grande nascita di aziende produttrici come l’Osiris Therapeutics e la Pluristem]

Medicina rigenerativa

Le principali necessità della medicina odierna sono rappresentate dalla mancanza di organi per effettuare i trapianti, dal rigetto dell’organo in seguito al trapianto e dalle malattie degenerative per cui non è possibile pensare a una terapia sostitutiva. Quindi sta nascendo una medicina rigenerativa volta alla ricostruzione dei tessuti che permetterebbe di rendere curabili alcune condizioni patologiche fino ad oggi destinate a trattamenti medici di lunga durata e di limitata efficacia oppure al trapianto d’organo. In particolare, la medicina moderna si prefigge di sostituire le cellule geneticamente deboli o degenerate con cellule sane oppure di utilizzare le cellule sane come supporto trofico per le cellule malate.

Per l’applicazione della terapia cellulare è necessario trovare una fonte abbondante di cellule che siano in grado di integrarsi nel tessuto destinatario, di differenziarsi in cellule funzionali e di essere compatibili con il sistema HLA del paziente. In particolare, le cellule più studiate sono le cellule staminali embrionali, le cellule staminali pluripotenti indotte e le cellule staminali adulte che presentano uno stato di staminalità caratterizzato dal self-renewal e da un alto potenziale proliferativo e che possono essere commissionate secondo varie lineage cellulari per maturare e formare una progenie differenziata.

N.B. Per un approccio di terapia cellulare sono necessarie centinaia di milioni di cellule.

Criteri di definizione della staminalità

• Automantenimento (self-renewal) che è la capacità delle cellule di effettuare molteplici e sequenziali divisioni cellulari simmetriche ed asimmetriche comportando una lunga persistenza nell’organismo.
• Differenziamento che è la capacità secondo cui le cellule figlie possono differenziare in determinati tipi cellulari stabili e capaci di integrarsi funzionalmente nel tessuto possibilmente senza determinare la formazione di tumori.
• Ripopolamento di un tessuto danneggiato secondo il processo dell’homing in seguito a un trapianto.
• Popolamento o contributo al popolamento di un tessuto anche se esso non è danneggiato (questa caratteristica è meno condivisa nel mondo scientifico).

Classificazione delle cellule staminali

Le cellule staminali possono essere classificate sulla base della sorgente in:

• Cellule staminali adulte presenti nell’organismo umano adulto per il rinnovamento dei tessuti durante la vita.
• Cellule staminali embrionali quando derivano dalla massa cellulare interna della blastocisti.
• Cellule staminali degli annessi embrionali derivanti dalla placenta, dalle membrane fetali e dal cordone ombelicale.

Le cellule staminali possono essere classificate sulla base della loro capacità di differenziamento in:

• Cellule totipotenti che sono in grado di generare tutte le cellule di un organismo includendo i tessuti extraembrionali; questa tipologia di cellule è rappresentata dallo zigote e dai blastomeri fino allo stadio a 8 cellule.
• Cellule pluripotenti che sono in grado di generare tutte le cellule di un organismo ad eccezione dei tessuti extraembrionali; questa tipologia di cellule è rappresentata dalle cellule embrionali della massa cellulare interna (ICM, Inner Cellular Mass).
• Cellule multipotenti che sono in grado di dare origine alle cellule di un determinato foglietto embrionale; questa tipologia di cellule è stata identificata nei feti e nell’uomo adulto, il loro numero diminuisce progressivamente con l’avanzare dell’età e sono rappresentate dalle cellule staminali mesenchimali (MSC, Mesenchymal Stem Cell) e dalle cellule staminali emopoietiche (HSC, Hematopoietic Stem Cell).
• Cellule oligopotenti che sono in grado di generare le cellule di un ristretto sottogruppo di linee cellulari; ne sono esempio i precursori emopoietici come le CFU-GM (Colony Forming Unit Granulocyte-Monocyte) che danno origine ai monoblasti e ai mieloblasti e le cellule staminali neuronali (NSC, Neural Stem Cell) che possono differenziare in neuroni e cellule della glia.
• Cellule unipotenti che sono in grado di differenziarsi in un unico tipo cellulare; ne sono esempio gli spermatogoni e le cellule staminali dei cheratinociti (KSC, Keratinocyte Stem Cell).

Il grado di staminalità delle cellule è finemente controllato dall’accessibilità del genoma che comprende lo stato di metilazione del DNA, le modificazioni covalenti degli istoni, lo spegnimento progressivo di grandi programmi genici e l’accensione dei programmi di specificazione differenziativa e dai fattori di trascrizione che permettono la funzione dei geni accessibili per l’avvio del programma di orientamento al differenziamento (il contenuto informazionale è lo stesso per tutte le tipologie di cellule).

Studi storici sulla potenzialità differenziativa

La potenzialità differenziativa dei blastomeri è stata scoperta nel 1892 da Driesch che condusse degli studi sullo zigote del riccio di mare verificando la totipotenza fino allo stadio di 4 blastomeri ed è stata confermata nel 1952 da Seidel che condusse degli studi sullo zigote di mammifero in cui negli embrioni di coniglio erano uccisi tutti i blastomeri ad eccezione di uno e poi erano trasferiti in madri nutrici in modo da verificare la presenza della totipotenza fino allo stadio di 8 blastomeri. Successivamente, nel 1962 Tarkowski e Mintz crearono le prime chimere dalla fusione di morule di topi geneticamente diverse verificando che la morula è capace di compensare gli eccessi e di ricostruire il tutto a partire da una parte grazie alle sostanze contenute nel microambiente embrionale.

La potenzialità differenziativa della blastocisti è stata verificata nel 1979 dagli studi di Gardner e Rossant, i quali separarono con tecniche di microchirurgia il trofoblasto dalla massa cellulare interna degli zigoti di alcuni topi per poi impiantarli in madri surrogate e verificare che il trofoblasto e la massa cellulare interna da soli non erano in grado di indurre lo sviluppo di un nuovo organismo e che il trofoblasto perde irreversibilmente la capacità di formare l’embrione dopo lo stadio a 8 blastomeri. Mentre la massa cellulare interna, quando associata a un trofoblasto geneticamente diverso, è capace di dare origine alle strutture dell’embrione ma non agli annessi extraembrionali.

La potenzialità differenziativa della massa cellulare interna è stata verificata mediante gli studi sui gemelli monozigotici che si formano dalla fusione di un singolo spermatozoo con un singolo ovulo, in particolare a seconda del momento della separazione dei blastomeri è possibile che si verifichi la formazione di gemelli bicoriali che presentano due distinti sacchi amniotici e due distinte placente quando la separazione avviene entro il 3^o giorno, la formazione di gemelli monocoriali biamniotici che presentano un’unica placenta ma due sacchi amniotici distinti quando la separazione avviene fra il 3^o e l’8^o giorno, la formazione di gemelli monocoriali monoamniotici che presentano un unico sacco amniotico ed un’unica placenta quando la separazione avviene fra l’8^o ed il 12^o giorno oppure la formazione di gemelli siamesi che sono uniti per una parte del loro corpo quando la separazione avviene fra il 12^o ed il 14^o giorno; grazie a questi studi, è stato possibile verificare che la massa cellulare interna è capace di dare origine a due embrioni completi all’interno di un solo amnios e di conservare una totipotenza a un alto grado durante la prima settimana ed in alcuni casi anche durante la seconda settimana.

Le cellule staminali adulte

Le cellule staminali adulte (ASC, Adult Stem Cell) sono presenti nei tessuti dell’organismo adulto e sono coinvolte nel mantenimento dell’integrità strutturale e funzionale dei tessuti, nel ricambio fisiologico dei tessuti e nella rigenerazione e nella riparazione in seguito a un danno.

N.B. Con il termine “rigenerazione” si indica l’utilizzo delle cellule staminali tramite iniezione ex vivo per permettere la sostituzione delle cellule danneggiate del tessuto in cui si localizzano (generalmente gli eventi di rigenerazione non sono presenti nell’organismo adulto), mentre con il termine “riparazione” si indica la dinamica secondo cui si verifica la stimolazione delle cellule staminali endogene residenti con approcci ex vivo per mettere in atto un processo di sostituzione delle cellule del tessuto (in alcuni casi può verificarsi la deposizione di matrice fibrosa che determina una perdita della funzione del tessuto).

Caratteristiche delle cellule staminali adulte

• Stato altamente indifferenziato.
• Elevata capacità di automantenimento per l’intera vita dell’organismo (self-renewal).
• Ampio potenziale differenziativo.
• Mantenimento all’interno di nicchie che sono delle sedi anatomiche privilegiate, lontane dagli insulti esterni, che permettono il mantenimento delle caratteristiche di staminalità delle cellule grazie alle caratteristiche topo-funzionali e architetturali del microambiente ed alle interazioni con le componenti delle cellule stromali e della matrice (il microambiente filtra gli stimoli esterni e promuove mutualmente il mantenimento delle caratteristiche di staminalità oppure il differenziamento verso uno specifico citotipo).

Le cellule staminali mesenchimali

Le cellule staminali mesenchimali (MSC, Mesenchymal Stem Cell) sono una tipologia di cellule staminali adulte mononucleate, aderenti, con morfologia “fibroblast-like”, con scarso citoplasma, con pochi mitocondri e con un apparato di Golgi poco sviluppato che esprimono numerosi recettori importanti per l’adesione cellulare, per l’interazione con le cellule emopoietiche, per i fattori di crescita e per le citochine.

[Nel corso degli anni sono state chiamate con molti nomi diversi: CFU-F (Colony Forming Unit-Fibroblast), MSC (Mesenchymal Stromal Cell), MPC (Mesenchymal Progenitor Cell), BMSSC (Bone Marrow Stromal Stem Cell) e MSC (Medicinal Signalling Cell)]

La sorgente storica di MSCs è il midollo osseo nel cui microambiente le cellule staminali mesenchimali svolgono un’importante funzione di supporto all’emopoiesi e sono presenti con una frequenza di 1/10⁴ -10⁵ cellule mononucleate. In particolare, le prime evidenze sull’esistenza di questa popolazione staminale mesenchimale nel midollo osseo risalgono al 1970 con gli studi dell’ematologo sperimentale Friedenstein. Successivamente, negli Anni ’90 il ricercatore Arnold Caplan decise di dare un nome evocativo a questa tipologia di cellule per sostituire il nome funzionale dato da Friendenstein (CFU-F, Colony Forming Unit-Fibroblast) nominandole come cellule staminali mesenchimali per evidenziare il loro potenziale differenziativo verso i tessuti di origine mesenchimale.

[La scoperta delle MSCs è stata accidentale in quanto un operatore del laboratorio di Friedenstein aveva osservato al microscopio la presenza di cellule aderenti alla piastra in una coltura di precursori ematopoietici]

La nicchia staminale in cui risiedono le cellule staminali mesenchimali è caratterizzata da un’estrema eterogeneità del comparto mesenchimale per quanto riguarda il livello di potenziale differenziativo delle cellule in quanto in essa sono presenti le cellule staminali pure in percentuale molto bassa e varie cellule staminali stromali a diverso grado di potenzialità che danno origine ai diversi citotipi del tessuto. L’esempio più studiato è quello della nicchia midollare in cui è presente una piccola percentuale di cellule staminali mesenchimali quadripotenti capaci di differenziarsi in senso stromogenico, condrogenico, adipogenico ed osteogenico ed una percentuale via via maggiore di cellule staminali mesenchimali tripotenti, bipotenti o monopotenti.

N.B. Le MSCs sono state isolate anche dal tessuto adiposo, dalla polpa dentale, dalla placenta, dalle membrane fetali, dal sangue cordonale, dal liquido sinoviale, dal sangue periferico, dal muscolo scheletrico, dalla gelatina di Warton, dai polmoni, dalla parete vascolare delle arterie e delle vene, dal tessuto intestinale, dal pancreas, dal timo, dalla milza, dal rene, dal cervello e dal derma della pelle (possono essere isolate da qualsiasi organo che contenga del tessuto connettivo).

Il processo mesengenico

Il processo mesengenico rappresenta l’insieme dei lineage differenziativi che le MSCs possono compiere ripercorrendo lo sviluppo embrionale del mesenchima, in particolare le cellule staminali mesenchimali possono andare incontro a un processo di osteogenesi per la formazione del tessuto osseo (attraverso il differenziamento in osteoblasti ed osteociti), di condrogenesi per la formazione della cartilagine (attraverso il differenziamento in condrociti e condrociti ipertrofici), di miogenesi per la formazione del tessuto muscolare (attraverso il differenziamento in mioblasti e miotubi), di stromogenesi (attraverso il differenziamento in cellule stromali), di tendogenesi e ligamentogenesi per la formazione dei tendini e dei legamenti (attraverso il differenziamento in fibroblasti), di adipogenesi per la formazione del tessuto adiposo (attraverso il differenziamento in preadipociti ed adipociti) ed in altri tessuti connettivi dell’organismo umano.

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BM-MSCs, Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells) sono prelevate mediante un agoaspirato midollare a livello della cresta iliaca ed isolate attraverso una separazione su Ficoll in gradiente di densità. In particolare, in seguito a una serie di centrifugazioni è possibile riconoscere nella provetta il plasma, un anello di cellule mononucleate contenente i linfociti, i monociti, i precursori emopoietici e le MSCs, il Ficoll ed un pellet contenente i globuli rossi ed i polimorfonucleati.

Immunofenotipo cellulare

L’immunofenotipo cellulare rappresenta il profilo antigenico superficiale, cioè la popolazione di recettori presenti su una determinata popolazione cellulare. In particolare, le MSCs sono caratterizzate dalla co-espressione di:

• CD105 è una glicoproteina che lega ad alta affinità il TGF-β₁ ed il TGF-β₃ e svolge un ruolo fondamentale nell’interazione tra le cellule endoteliali e nello sviluppo dei vasi, media le interazioni tra le cellule staminali mesenchimali e le cellule staminali ematopoietiche (HSC, Hematopoietic Stem Cell) nel midollo osseo e gioca un ruolo chiave nel differenziamento in senso condrogenico.
• CD73 è una glicoproteina ancorata alla membrana plasmatica con attività nucleosidasica in quanto permette la defosforilazione dei ribonucleotidi e dei deossiribonucleotidi, è importante nella trasduzione del segnale nel compartimento emopoietico (in quanto è presente nel tessuto linfoide e nelle cellule endoteliali) ed è coinvolto nel metabolismo dei nucleotidi extracellulari (in quanto è espresso dai linfociti T regolatori che hanno un’azione di modulazione negativa sulle cellule del compartimento immunitario tramite un accumulo di adenosina).
• CD90 o Thy-1 è una glicoproteina ancorata alla membrana plasmatica scoperta originariamente come antigene espresso dai timociti che è utilizzato per la caratterizzazione delle cellule staminali e svolge una possibile funzione nell’interazione tra le cellule e con la matrice extracellulare legata ai processi di apoptosi, metastasi, infiammazione e fibrosi, nei processi di immunomodulazione e nel processo della tolleranza immunologica.
• CD166 o ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) è una glicoproteina implicata nel differenziamento in senso osteogenico.
• CD29 o integrina β₁ è una glicoproteina coinvolta nell’adesione cellulare.
• CD44 è un recettore di superficie che lega l’acido ialuronico ed è importante per l’adesione alla matrice extracellulare, per la migrazione cellulare e per l’homing che è quel processo biologico che conduce le cellule staminali trapiantate verso la loro nicchia staminale.

Inoltre, non esistendo o non essendo ancora stato identificato un marcatore specifico ed univoco per le cellule staminali mesenchimali, esiste un pannello di marcatori che devono risultare negativi per la caratterizzazione delle MSCs come:

• CD14 è il recettore per il lipopolisaccaride LPS espresso tipicamente dai monociti-macrofagi.
• CD34 è espresso dalle cellule staminali ematopoietiche e dai progenitori emopoietici.
• CD45 o antigene leucocitario comune o antigene panleucocitario è una proteina di superficie ad attività tirosin-chinasica altamente espressa nelle cellule emopoietiche che è importante per l’attivazione dei linfociti.

N.B. La presenza o l’assenza dei marcatori deve essere confrontata con la nicchia staminale di riferimento, ad esempio nell’isolamento delle cellule staminali mesenchimali dalla nicchia.