Laboratorio di cellule staminali

IL TRASFERIMENTO NUCLEARE SOMATICO CELLULARE

Il ricercatore Sir John Gurdon (Cambridge) ha introdotto la tecnica del trasferimento nucleare somatico cellulare (SCNT, Somatic Cell Nuclear Transfer) che prevede l'eliminazione del nucleo in una cellula uovo per sostituirlo con il nucleo di una cellula somatica matura, in particolare egli ha eliminato il nucleo di un ovulo di rana e lo ha sostituito con il nucleo di una cellula specializzata presa da un girino verificando che era possibile permettere lo sviluppo di un girino normale e, successivamente, il medesimo esperimento di trasferimento nucleare è stato condotto sui mammiferi, in particolare nel 1996 è stato clonato il primo mammifero in assoluto, la pecora Dolly (studi di Wilmut); negli anni successivi, nel 1998 la tecnica del trasferimento nucleare somatico cellulare ha permesso di derivare 22 linee cellulari di ESC da alcuni nuclei di fibroblasti bovini trasferiti in ovociti bovini enucleati per poi passare agli studi.

condotti sui topi, sulle scimmie e, infine, nel 2008, nell'uomo. N.B. La cellula uovo contiene dei fattori che permettono la riprogrammazione del nucleo di una cellula somatica conferendole la pluripotenza. A seconda dell'uso che viene fatto della tecnica di trasferimento nucleare somatico cellulare è possibile riconoscere una: Clonazione riproduttiva che prevede di trasferire il nucleo di una cellula somatica adulta diploide in un ovocita enucleato per formare un embrione diploide che darà origine ad una blastocisti che, impiantata nell'utero di una madre surrogata, permette di ottenere un individuo clonato uguale al donatore della cellula somatica. Clonazione terapeutica che prevede di trasferire il nucleo di una cellula somatica adulta diploide in un ovocita enucleato per formare un embrione diploide che darà origine ad una blastocisti da cui sono prelevate le cellule della massa cellulare interna per ottenere delle cellule staminali embrionali con il

genoma del pazienteche possono essere indotte al differenziamento in numerosi tessuti diversi.21[La derivazione di cellule staminali embrionali con la tecnica del trasferimento nuclearesomatico cellulare è permessa in Belgio, Cina, Israele, Giappone, Corea del Sud, Singapore,Svezia, Gran Bretagna ed India]

La clonazione presenta alcune importantiproblematiche che riguardano l'elevatissima mortalitàper i feti e la frequente comparsa della Large OffspringSyndrome che causa un fenotipo neonatalecaratterizzato da difetti metabolici e respiratori e dauna placenta più grande della norma in quanto ilnucleo della cellula somatica non è soggetto allariprogrammazione del genoma che avviene durante lagametogenesi che porta alla completa demetilazionedel genoma paterno e materno, infatti l'embrioneclonato non subisce la riprogrammazione epigeneticache è responsabile della decondensazione della cromatina e delle diverse modificazioniepigenetiche

esistente fra gli ovociti e gli spermatozoi. Affinché un embrione clonato possa completare lo sviluppo, è necessario che i geni espressi durante l'embriogenesi siano riattivati nell'embrione ma non nelle cellule somatiche (sono conosciuti circa 70 geni Oct-4-like) ed è stato possibile affermare che gli embrioni che muoiono poco dopo la fase di reimpianto non sono riusciti a riprogrammare correttamente tali geni, che i cloni che nascono presentano dei geni Oct-4-like attivi con un'espressione genica alterata e con un imprinting errato che si riflettono in un fenotipo anormale e che i cloni apparentemente sani (come la pecora Dolly) muoiono precocemente a causa dell'immunodeficienza, delle alterazioni multiple agli organi e di disturbi metabolici. N.B. Per superare la barriera biologica delle differenze epigenetiche fra il nucleo somatico ed i gameti sarebbe necessario trattare i due genomi parentali fisicamente separati ed in manieraseguente:

“oocyte-appropriate” e “sperm-appropriate”. Alcuni studi successivi hanno messo in evidenza che il donatore di nucleo determina il fenotipo dell’embrione, in particolare le blastocisti derivate da un uovo fertilizzato permettono uno sviluppo ad alta efficienza di una progenie normale, le blastocisti derivate con la tecnica del trasferimento nucleare da cellule staminali embrionali permettono uno sviluppo ad alta efficienza di una progenie anormale e che le blastocisti derivate con la tecnica del trasferimento nucleare da cellule somatiche (fibroblasti, linfociti e neuroni) permettono uno sviluppo a bassa o bassissima efficienza di una progenie anormale.

Per quanto riguarda la clonazione riproduttiva, lo stato di maggiore differenziamento della cellula donatrice di nucleo determina una riduzione dell’efficienza di sviluppare una progenie, mentre per quanto riguarda la clonazione terapeutica, il potenziale delle cellule pluripotenti derivate è il seguente:

medesimo ed è indipendente dallo stato di differenziamento dellacellula donatrice di nucleo perché la pressione selettiva sulle cellule della blastocisticoltivate in piastra determina la sopravvivenza solo delle cellule che riescono ad attivare ilprogramma di staminalità, infatti molte cellule della massa cellulare interna dellablastocisti vanno incontro allo spegnimento del gene Oct-4 determinando un blocco dellaproliferazione cosicché solo le cellule che continuano ad esprimerlo possano dare vita ad22una linea cellulare embrionale. Quindi, il processo di riattivazione genica che avvienedurante la selezione in piastra annulla le differenze esistenti e dovute allo stato didifferenziamento diverso fra le cellule donatrici di nucleo e permette di affermare che le ESCsnormali e le ESCs ottenute con trasferimento nucleare sono funzionalmente indistinguibiliper quanto riguarda le caratteristiche del fenotipo e del differenziamento in vivo ed in vitro,madel DNA durante la formazione dei recettori delle cellule T e B. Attraverso il trasferimento nucleare somatico cellulare, è stato possibile ottenere cellule pluripotenti da topi mutanti per il gene RAG2 e successivamente differenziarle in cellule del sistema immunitario. Questo ha permesso di studiare i meccanismi alla base della Sindrome di OMENN e di testare nuove terapie per questa patologia. Un'altra applicazione terapeutica delle cellule pluripotenti ottenute con il trasferimento nucleare somatico cellulare è la ricerca di una cura per la malattia di Parkinson. Questa patologia neurodegenerativa è caratterizzata dalla perdita di neuroni dopaminergici nella sostanza nigra del cervello. Utilizzando il trasferimento nucleare somatico cellulare, è stato possibile ottenere cellule pluripotenti da pazienti affetti da malattia di Parkinson e differenziarle in neuroni dopaminergici. Questo ha aperto nuove prospettive per lo sviluppo di terapie mirate alla sostituzione dei neuroni perduti e al miglioramento dei sintomi della malattia. In conclusione, il trasferimento nucleare somatico cellulare è una tecnica che permette di ottenere cellule pluripotenti da cellule differenziate, aprendo nuove possibilità per la ricerca e la terapia di diverse patologie. Tuttavia, è importante considerare l'instabilità epigenetica che può verificarsi durante il processo di clonazione riproduttiva, al fine di evitare la formazione di individui con fenotipo alterato.

V(D)J dei linfociti. Il protocollo terapeutico prevede il prelievo di cellule dalla coda del topo da cui derivare il nucleo che è trasferito in un ovocita enucleato che è coltivato in medium per favorire l'attivazione e lo sviluppo della blastocisti clonata, dalla quale sono isolate le cellule della massa cellulare interna; successivamente, tali cellule sono modificate con tecniche di genome editing per permettere la correzione del gene mutante mediante ricombinazione omologa e poi fatte differenziare, attraverso il passaggio intermedio a corpi embrioidi, in cellule staminali ematopietiche che sono trapiantate nel topo malato per correggere il difetto genetico e permettere il ripristino della funzionalità del sistema immunitario.

LE CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE

I ricercatori Shinya Yamanaka e Kazutoshi Takahashi (Kyoto) hanno scoperto che i solifattori trascrizionali Oct-4, Sox-2, c-Myc e Klf4 sono necessari per riprogrammare dei fibroblasti adulti derivanti

differenziamento delle cellule staminali pluripotenti in cellule di diversi tessuti. Esso agisce in sinergia con OCT-4 per mantenere lo stato di pluripotenza e regolare l'espressione di geni specifici. KLF4 (Kruppel-like factor 4) è un altro fattore trascrizionale coinvolto nella riprogrammazione delle cellule adulte in iPSC. Esso è responsabile della regolazione dell'espressione genica e del mantenimento dello stato di pluripotenza. c-MYC è un oncogene coinvolto nella riprogrammazione delle cellule adulte in iPSC. Esso agisce sinergicamente con gli altri fattori trascrizionali per indurre la pluripotenza e promuovere la crescita delle cellule. La riprogrammazione delle cellule adulte in iPSC avviene attraverso l'introduzione di questi fattori trascrizionali nelle cellule, solitamente mediante l'utilizzo di vettori virali. Una volta riprogrammate, le cellule possono essere differenziate in diversi tipi cellulari per scopi terapeutici o di ricerca. Le iPSC rappresentano una promettente fonte di cellule per la medicina rigenerativa, in quanto possono essere ottenute da pazienti stessi, evitando così problemi di rigetto. Inoltre, la loro capacità di differenziarsi in diversi tipi cellulari offre ampie possibilità di applicazione terapeutica. Tuttavia, è importante sottolineare che la tecnologia delle iPSC è ancora in fase di sviluppo e sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno le loro potenzialità e limitazioni.

sviluppo dell'epiblasto e dell'ectoderma extraembrionale e, conseguentemente, del sistema nervoso centrale e in associazione a Oct-4 permette la regolazione dell'espressione del gene FGF4 che è coinvolto nella stabilizzazione e nella proliferazione dell'ectoderma extraembrionale dal trofoectoderma (l'espressione ectopica di Sox-2 può essere associata ad una differenziazione anormale nelle cellule del cancro colo-rettale).

C-MYC è un fattore trascrizionale che potenzia la proliferazione e la trasformazione cellulare in quanto è associato ad un complesso istone-acetiltransferasi (HAT) capace di indurre una globale deacetilazione degli istoni permettendo il legame dei fattori Oct-3/4 e Sox-2 agli specifici target genici; tale gene rappresenta anche un oncogene perché la sua riattivazione nelle cellule causa un aumento della formazione dei tumori.

KLF-4 è un fattore trascrizionale appartenente alla famiglia KLF ed è

Coinvolto nella regolazione della proliferazione, del differenziamento, dell'apoptosi e della riprogrammazione cellulare in quanto reprime direttamente l'azione di p53, il quale a sua volta sopprime l'attività di Nanog durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali quindi è possibile affermare che Klf-4 contribuisce all'attivazione di Nanog e di altri geni specifici delle cellule staminali embrionali (permette di dispensare l'utilizzo di Nanog nel protocollo sperimentale) ed inibisce l'apoptosi indotta da c-Myc attraverso la repressione di p53.

N.B. Inaspettatamente, è stato scoperto che Nanog non è indispensabile per la riprogrammazione e la stabilizzazione delle cellule adulte in iPSC (tale proteina deve il suo nome alla leggenda di Tir nan Og che è il nome della Terra dell'Eterna Giovinezza in quanto permette di mantenere le cellule come immortalizzate) anche se l'aggiunta di Nanog

facilità l'espansione delle cellule pluripotenti in c