Biologia molecolare - catena respiratoria

Processo di riduzione e ossidazione nel ciclo del citocromo b

L'H3+ lega un elettrone al proprio atomo di ferro, trasformando il ferro in Fe3+. Successivamente, b prende un protone H dalla matrice mitocondriale (probabilmente utilizzando un residuo di istidina nella sua catena proteica che si protona) e lo cede insieme all'elettrone a una molecola di ubichinone ossidato del pool Q, formando così QH·, un radicale. Nel frattempo, un'altra molecola di QH dal pool Q viene trasformata in QH·, liberando un protone sul lato citoplasmatico e un elettrone che passa attraverso il centro di Rieske e cit c per ridurre Fe a Fe2+ sul cit c. Il processo continua con la formazione di Q ossidato che ritorna al pool Q e un protone che si accumula sul lato citoplasmatico della membrana. L'elettrone su b, insieme a un protone dalla matrice mitocondriale, passa ora al QH· radicale formato in precedenza per formare una molecola di QH2 che ritorna al pool Q.

Il ciclo si ripete. Nell'essenza, da una molecola di QH, formatosi nella ossidazione del NAD ridotto, si liberano in successione sul lato citosolico della membrana due protoni ed un elettrone in forma di cit c ridotto, mentre il secondo elettrone circola all'interno dell'emo b e solo successivamente sarà liberato e ceduto al cit c. È così possibile spiegare come l'ossidazione di QH, che comporta la liberazione di due elettroni, coinvolga solo una molecola di cit c alla volta ed in particolare un solo atomo di ferro, in quanto gli elettroni sono trasferiti sequenzialmente. Il complesso III, come il complesso I, si comporta come pompa protonica; inoltre nel suo insieme la reazione di riduzione del cit c è fortemente esoergonica; l'energia liberata in parte si associa qui pure con modificazioni conformazionali di proteine della membrana mitocondriale seguite da un accumulo di protoni sul lato citoplasmatico della membrana.

Importante il citocromo c interagisce con il cit b durante il processo catalitico mediante legami elettrostatici che si stabiliscono fra le catene laterali basiche di residui di lys ed arg largamente distribuiti sul cit c e catene laterali acide di residui di asp e glu di cui il cit b è ricco. Il complesso IV Questo complesso detto anche citocromo ossidasi (COX) è una proteina di massa molecolare complessiva pari a 200 kDa formata nella sua totalità da 13 differenti subunità di cui le tre con massa molecolare maggiore (subunità I, II, III) sono codificate dal DNA mitocondriale. Il complesso si dispone a cavallo della membrana mitocondriale con la quale interagisce profondamente a mezzo della componente fofolipidica. Contiene due molecole di emo di tipo a, una definita emo a presente sulla subunità II, ed una seconda definita emo a, presente sulla subunità I, con caratteristiche diverse non per differenze strutturali dell'emo, ma per

proprietà fisiche (spettro di assorbanza) impartite dalla parte proteica che lo circonda; fra di loro i due centri emo sono estremamente vicini.. È da ricordare che gli spettri che permettono di differenziare l'emo dei diversi citocromi sono quelli delle loro forme ridotte (Fe in forma ferrosa 2). Tutti gli anelli emo, sia in forma ridotta od ossidata, hanno una banda di assorbanza comune intorno a 400 nm, detta banda di Soret che è propria dell'anello porfinico e quindi condivisa anche dall'emo della emoglobina, mentre si differenziano solo se in forma ridotta per le bande di assorbanza intorno ai 500-600 nm. L'emo a è in contatto con uno ione o più probabilmente due ioni Cu (valenza variabile fra 1 e 2) detto centro Cu A; l'emo a è invece legato ad un solo ione rame detto Cu B. L'emo a e Cu A3 hanno bassa capacità di trasferire l'elettrone a differenza dell'emo a e del Cu B che hanno potenziale alto.

Studi spettroscopici hanno rivelato che nel centro Cu A uno ione Cu è legato, all'azoto ad un residuo di His, a sua volta legato al solfo di un residuo di Cys, al carbossile indissociato di un residuo di Asp; ed inoltre al solfo di un altro residuo di Cys; questo atomo di solfo è condiviso con il secondo ione Cu, a sua volta coordinato all'azoto di un residuo di His ed il solfo di un residuo di Met. La quarta valenza coordinativa del primo ione Cu è impegnata con l'azoto di un residuo di His del cit c con il quale la subunità II di COX è strettamente in contatto a mezzo di ponti salini tra residui aminoacidici acidi (Asp e Glu) di cui la subunità II è ricca, e residui aminoacidici basici (Lys, Arg) presenti in elevato numero sul cit c (vedi sopra). Gli elettroni verrebbero quindi trasferiti dal ferro del cit c, che passa da valenza 2 a valenza 3 e quindi si riossida, al centro Cu A e successivamente all'emo a. Da questol’elettrone passerebbe sull’emo a il cui Fe si riduce da valenza 3 a valenza 2. Nell’emo a il ferro è legato coordinativamente, in aggiunta ai quattro legami con l’azoto degli anelli pirrolici della porfina, ad un atomo di azoto di un residuo di His ed al solfo di un residuo di Cys, solfo che lega del pari il Cu B a sua volta legato all’azoto di tre istidine della subunità I. Il complesso IV riceve uno alla volta gli elettroni dal cit c che in primis verrebbero accettati dal centro Cu A e quindi dal Fe dell’emo a; da questo un elettrone andrebbe al Fe dell’emo a che conseguentemente passa da Fe3+ a Fe2+, ed un secondo al Cu B che a sua volta passa da Cu1+ a Cu2+. A questo punto Fe e Cu coordinano una molecola di O2 a guisa di ponte perossidico (Fe-O-O-Cu) a cui cedono entrambi un elettrone ritornando Fe2+ e Cu2+, originando uno ione perossido (O2-) non tossico perché legato ai due atomi Fe e Cu. In un temposuccessivo due H⁺ prelevati dal lato citosolico della membrana mitocondriale si legano all'atomo di ossigeno impegnato con Cu formando un intermedio Cu-OH con rottura del ponte perossidico e 2+ formazione sull'atomo di ossigeno legato ad Fe di un ossigeno radicalico; su questo tramite cit c viene ora trasferito un elettrone ed un secondo elettrone viene ceduto da Fe che 4+ temporaneamente si trasforma in Fe³⁺ o ione ferrile con formazione dell'intermedio Fe-O; a 4+ 3+ questo viene ora trasferito da cit c un elettrone che riporta Fe ad Fe²⁺; il successivo prelievo di 3+ due protoni dal lato citoplasmatico ed il loro trasferimento al complesso Fe-O determinerà il distacco dell'ossigeno dal complesso e la formazione di una molecola di acqua. Nel processo un residuo di Tyr con l'ossidrile fenolico è parte attiva. La reazione di riduzione dell'ossigeno per formare H₂O è fortemente esoergonica e si associa ad un flusso protonico dalla

matrice2mitocondriale al lato citosolico della membrana mitocondriale. Pertanto anche il complesso IV,del pari con i complessi I e II, funge da pompa protonica.

INIBITORI DELLA CATENA RESPIRATORIA

La comprensione delle modalità con cui i vari complessi della catena respiratoria funzionano e l'ordine con cui intervengono nel processo è stata possibile in base alla scoperta di piccole molecole che si comportano come inibitori specifici dei diversi complessi.

Inibitori del complesso I, e quindi accumulo di NADH riduttasi in forma ridotta (FMNH2), sono alcuni barbiturici, tra cui l'amital, ed il rotenone una molecola presente nella linfa di alcune piante tropicali utilizzata in guerra dagli indigeni di queste zone per ricoprire le frecce con esito letale per soggetto colpito.

Inibitore del complesso III è l'antimicina, un antibiotico che blocca il trasferimento degli elettroni al centro di Rieske, con accumulo in una catena respiratoria funzionante di QH.

Inibitori del complesso IV: sono monoossido di carbonio (CO), che si lega selettivamente al ferro dell'emo a in forma ridotta e quindi impedisce il trasferimento degli elettroni all'ossigeno, e il cianuro (CN) che si lega selettivamente al Fe trivalente dell'emo a impedendone la riduzione, con conseguente accumulo di cit c ridotto.

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA (COMPLESSO V): È il processo che accoppia l'energia liberata nell'ossidazione del NAD e FAD ridotti con la sintesi di ATP a livello della membrana mitocondriale. Questa sintesi è catalizzata da un complesso proteico presente sulla membrana mitocondriale definito complesso V o ATP sintasi mitocondriale o erroneamente ATP asi mitocondriale, che si accentra in prossimità delle tre pompe protoniche (i complessi I, III, IV) della catena respiratoria.

Quando i mitocondri vengono sottoposti a colorazione negativa con acido fosfotungstico, il microscopio elettronico mette in evidenza sulle

creste mitocondriali (ripiegamenti dellamembrana mitocondriale all'interno della matrice) la presenza sul lato matrice di un elevatonumero di protuberanze a forma di bottone o corolla di un fiore attaccate alla membrana internadel mitocondrio a mezzo di corti peduncoli o steli, che a loro volta si affondano nello spessoredella membrana. A seguito di frammentazione dei mitocondri mediante sonicazione, iframmenti della membrana interna si richiudono su stessi a formare delle vescicole nelle quali lamembrana risulta rovesciata per cui il lato della membrana, che se intatta era rivolto verso lamatrice mitocondriale, ora si trova all'esterno della membrana delle vescicole (inside out), eviceversa; ne consegue che i bottoni sono ora sul lato esterno della vescicola. Le vescicoleconservano la capacità di consumare ossigeno in presenza di substrati ossidabili e di sintetizzareATP. Sotto l'azione di agenti caotropici (urea) o di proteasi (tripsina) i bottoni

Vengono dissociati dalle vescicole e le due componenti si possono separare mediante centrifugazione frazionata. Le vescicole, private dei bottoni, in presenza di substrati ossidabili continuano a ossidare questi ed a ridurre l'ossigeno ad H2O, ma hanno perso la capacità di sintetizzare ATP, mentre i bottoni in presenza di ATP scindono questo in ADP e Pi mettendo in evidenza una apparente attività ATPasica, da cui il nome dato erroneo dato al complesso. Tuttavia le vescicole riacquistano la capacità di sintetizzare ATP per aggiunta dei bottoni che tornano ad inserirsi in modo corretto sulle vescicole. Ne consegue che la capacità di sintetizzare ATP è propria dei bottoni che tuttavia necessitano delle vescicole perché questa loro capacità diventa effettiva. Le protuberanze vennero chiamate fattore di accoppiamento perché se aggiunte alle vescicole rendevano possibile la sintesi di ATP accoppiata alla ca