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Biologia molecolare - catena respiratoria

Appunti di Biologia molecolare per l'esame del professor Campo sulla catena respiratoria. Gli argomenti trattati sono i seguenti: il gruppo prostetico dei citocromi, la sintesi di ATP, l'ossidazione dei cofattori piridinici e flavinici e la catena respiratoria (divisa in quattro complessi).

Esame di Biologia molecolare docente Prof. S. Campo

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Il complesso IV riceve uno alla volta gli elettroni dal cit c che in primis verrebbero accettati dal

centro Cu A e quindi dal Fe dell’emo a; da questo un elettrone andrebbe al Fe dell’emo a che

3

3+ 2+ 2+

conseguentemente passa da Fe a Fe , ed un secondo al Cu B che a sua volta passa da Cu a

1+ 2+

Cu . A questo punto Fe e Cu coordinano una molecola di O a guisa di ponte perossidico (Fe -

2

1+ 3+ 2+

O=O-Cu ) a cui cedono entrambi un elettrone ritornando Fe e Cu , originando uno ione

2- - +

perossido (O ) non tossico perché legato ai due atomi Fe e Cu. In un tempo successivo due H

prelevati dal lato citosolico della membrana mitocondriale si legano all’atomo di ossigeno

impegnato con Cu formando un intermedio Cu OH con rottura del ponte perossidico e

2

3+

formazione sull’atomo di ossigeno legato ad Fe di un ossigeno radicalico; su questo tramire cit

3+

c viene ora trasferito un elettrone ed un secondo elettrone viene ceduto da Fe che

4+ 4+ 2-

temporaneamente si trasforma in Fe o ione ferrile con formazione dell’intermedio Fe -O ; a

4+ 3+

questo viene ora trasferito da cit c un elettrone che riporta Fe ad Fe ; il successivo prelievo di

3+ 2-

due protoni dal lato citoplasmatico ed il loro trasferimento al complesso Fe -O determinerà il

distacco dell’ossigeno dal complesso e la formazione di una molecola di acqua. Nel processo un

residuo di Tyr con l’ossidrile fenolico è parte attiva. La reazione di riduzione dell’ossigeno per

formare H O è fortemente esoergonica e si associa ad un flusso protonico dalla matrice

2

mitocondriale al lato citosolico della membrana mitocondriale. Pertanto anche il complesso IV,

del pari con i complessi I e II, funge da pompa protonica.

INIBITORI DELLA CATENA RESPIRATORIA

La comprensione delle modalità con cui i vari complessi della catena respiratoria funzionano e

l’ordine con cui intervengono nel processo è stata possibile in base alla scoperta di piccole

molecole che si comportano come inibitori specifici dei diversi complessi.

Inibitori del complesso I, e quindi accumulo di NADH riduttasi in forma ridotta (FMNH ) sono

2

alcuni barbiturici, tra cui l’amital, ed il rotenone una molecola presente nella linfa di alcune

piante tropicali utilizzata in guerra dagli indigeni di queste zone per ricoprire le frecce con esito

letale per soggetto colpito.

Inibitore del complesso III è l’antimicina, un antibiotico che blocca il trasferimento degli

elettroni al centro di Rieske, con accumulo in una catena respiratoria funzionante di QH .

2

Inibitori del complesso IV sono monoossido di carbonio (CO), che si lega selettivamente al

ferro dell’emo a in forma ridotta e quindi impedisce il trasferimento degli elettroni all’ossigeno,

3 -

ed il cianuro (CN ) che si lega selettivamente ad Fe trivalente dell’emo a impedendone la

3

riduzione, con conseguente accumulo di cit c ridotto.

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA (COMPLESSO V)

E’ il processo che accoppia l’energia liberata nell’ossidazione del NAD e FAD ridotti con la

sintesi di ATP a livello della membrana mitocondriale. Questa sintesi è catalizzata da un

complesso proteico presente sulla membrana mitocondriale definito complesso V o ATP sintasi

mitocondriale o erroneamente ATP asi mitocondriale, che si accentra in prossimità delle tre

pompe protoniche (i complessi I, III, IV) della catena respiratoria.

Quando i mitocondri vengono sottoposti a colorazione negativa con acido fosfotungstico, il

microscopio elettronico mette in evidenza sulle creste mitocondriali (ripiegamenti della

membrana mitocondriale all’interno della matrice) la presenza sul lato matrice di un elevato

numero di protuberanze a forma di bottone o corolla di un fiore attaccate alla membrana interna

del mitocondrio a mezzo di corti peduncoli o steli, che a loro volta si affondano nello spessore

della membrana. A seguito di frammentazione dei mitocondri mediante sonicazione, i

frammenti della membrana interna si richiudono su stessi a formare delle vescicole nelle quali la

membrana risulta rovesciata per cui il lato della membrana, che se intatta era rivolto verso la

matrice mitocondriale, ora si trova all’esterno della membrana delle vescicole (inside out), e

viceversa; ne consegue che i bottoni sono ora sul lato esterno della vescicola. Le vescicole

conservano la capacità di consumare ossigeno in presenza di substrati ossidabili e di sintetizzare

ATP. Sotto l’azione di agenti caotropici (urea) o di proteasi (tripsina) i bottoni vengono

dissociati dalle vescicole e le due componenti si possono separare mediante centrifugazione

frazionata. Le vescicole, private dei bottoni, in presenza di substrati ossidabili continuano a

ossidare questi ed a ridurre l’ossigeno ad H O, ma hanno perso la capacità di sintetizzare ATP,

2

mentre i bottoni in presenza di ATP scindono questo in ADP e Pi mettendo in evidenza una

apparente attività ATPasica, da cui il nome dato erroneo dato al complesso. Tuttavia le

vescicole riacquistano la capacità di sintetizzare ATP per aggiunta dei bottoni che tornano ad

inserirsi in modo corretto sulle vescicole. Ne consegue che la capacità di sintetizzare ATP è

propria dei bottoni che tuttavia necessitano delle vescicole perché questa loro capacità divenga

effettiva.

Le protuberanze vennero chiamate fattore di accoppiamento perché se aggiunte alle vescicole

rendevano possibile la sintesi di ATP accoppiata alla capacità delle vescicole di ossidare i

cofattori ridotti con formazione di H O. La loro purificazione rivelò come esse fossero in realtà

2

un complesso multiproteico di massa molecolare elevata costituito da oltre dodici catene

proteiche e formato in realtà da due componenti con diversa funzione, l’una formata dal bottone

o corolla definita fattore F e l’altra fattore F ; la prima costituisce della protuberanza la parte

1 0

che protrude verso la matrice mitocondriale al di fuori della membrana., la seconda la parte che

sta immersa nello spessore della membrana interna del mitocondrio strettamente associata alla

componente lipidica della membrana stessa. Le due componenti sono fra di loro connesse a

mezzo di un giunto detto stelo che emerge dalla membrana. L’insieme di queste diverse parti

costituisce il complesso F F che pertanto è composto da due fattori F ed F .

0 1 1 0

  

Il fattore F consta di 5 differenti catene peptidiche identificate come δ ε presenti nel

1   δε.  

fattore con la seguente stechiometria Le catene e sono unite a formare un dimero in

3 3

cui la subunità è responsabile dell’attività ATP sintasica; il fattore contiene tre di questi

dimeri che si dispongono come gli spicchi di una arancia per un totale di 6 spicchi che

appoggiano sulle subuntà ed ε, mentre la subunità δ sarebbe in contatto direttamente con il

fattore F del quale riconosce le due subunità b. Il fattore F è definito anche fattore statore in

0 0

quanto fa da base al fattore F e ne regola la capacità di sintetizzare ATP. Il fattore F è

1 0

anch’esso formato da almeno tre tipi di catene indicate come a, b, c, delle quali la catena a ha

massa molecolare più elevata, ed è presente nel fattore come unità singola, mentre la catena b è

presente in ragione di due subunità e la catena c di almeno 10 subunità. Nell’architettura del

complesso F F , la subunità a costituisce la base su cui si imperniano le due subunità b e le dieci

0 1

subunità c; a loro volta le due subunità b si legano con la subunità δ di F , mentre le diverse

1

ε

subunità c sono alternativamente in contatto con il dimero di F tramite lo stelo ed

1

impartiscono ad F un movimento rotatorio, capacità che il fattore F acquisisce in funzione del

1 0

sua affinità per i protoni. Lo stelo è formato da almeno due proteine, la proteina che conferisce

all’intero complesso sensibilità alla oligomicina (OSCP) ed il fattore di accoppiamento 6 o F .

6

L’oligomicina, antibiotico prodotto da un ceppo di streptomiceti, è in grado di legarsi ad una

delle subunità di F ed in questo modo inibisce la capacità di quest’ultimo di trasportare protoni,

0

essenziale per il manifestarsi dell’attività ATP sintasica di F . Per questo motivo F è definito

1 0

anche fattore Fo ossia sensibile all’oligomicina. La dicicloesilcarbodiimmide (DCCD), un

reagente liposolubile in grado di derivatizzare i gruppi carbossilici, inibisce del pari il passaggio

dei protoni attraverso il fattore F andando a bloccare il gruppo carbossilico di un residuo di

0

acido glutammico presente su sei delle subunità c del fattore; tale interazione altera la struttura

delle subunità impedendo loro di disporsi a formare un canale al cui interno scorrerebbero i

protoni. E’ probabile quindi che i protoni rimbalzino all’interno del canale formato dalle

subunità c andando a protonare radicali acidi dei residui aminoacidici di queste, che

alternativamente passerebbero dalla forma deprotonata a quella protonata. In questo modo è

possibile capire come la membrana interna, di per sé impermeabile al passaggio di protoni,

possa in effetti diventare tale e permettere ai protoni di raggiungere la matrice mitocondriale

attraverso la sintesi di ATP.

Sperimentalmente si è dimostrato che i 4 complessi della catena respiratoria isolati mediante

sonicazione della membrana mitocondriale e come tali inattivi possono essere riattivati se

inglobati in membrane artificiali ricche di fosfolipidi (liposomi) arricchite di substrati ossidabili

e di NAD ed acquistare la capacità di formare ATP se addizionati con il complesso F F . Questa

0 1

capacità era evidente solo per i complessi I, III, IV, mentre non era tale per il complesso II.

Infatti per i complessi I, III, IV il rapporto O consumato a formare H O e Pi utilizzato per

2 2

formare ATP (P/O) era pari ad 1, ad es.per il complesso III per due elettroni trasferiti dal

coenzima Q al citocromo, cioè per coppia di equivalenti riducenti, si formava da ADP e Pi una

molecola di ATP, mentre per il complesso II il trasferimento di due equivalenti riducenti al

coenzima Q non si associava a consumo di Pi. Era questa la dimostrazione sperimentale che la

funzione di pompa protonica dei complessi I, III, IV era connessa a sintesi di ATP e allo stesso

tempo che solo questi tre complessi fungevano da pompa protonica. E’ quindi possibile capire

perché in mitocondri perfettamente funzionanti l’ossidazione dei substrati che coinvolgono

ossidoriduttasi NAD dipendenti comporti la sintesi di tre molecole di ATP mentre dai substrati

la cui ossidazione dipende da enzimi flavinici di due ATP.

Come è possibile raccordare la funzione di pompa protonica con la capacità di sintetizzare ATP,

in altre parole raccordare il flusso protonico sul lato citoplasmatico della membrana

mitocondriale con la sintesi di ATP sulla faccia della membrana mitocondriale prospiciente la

matrice mitocondriale? Fondamentalmente il meccanismo di sintesi di ATP dalla ATPsintasi

che trasloca protoni può essere articolato in tre momenti: 1) traslocazione dei protoni da parte di

F ; 2) formazione del legame di fosfoanidride fra ADP e Pi ad opera del fattore F ; 3)

0 1

accoppiamento della dissipazione del gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale

con la sintesi di ATP processi che richiedono la partecipazione dei due fattori F /F .

0 1

Si è dimostrato che il fattore F è in grado di legare protoni a mezzo delle subunità c, legame

0

che induce una modificazione conformazionale del fattore che si trasforma in un canale per i

ε )

protoni; questi, tramite il dimero (in particolare di di F , possono così giungere a contatto

1



con i dimeri di F inducendoli a modificare la loro forma. E’ probabile che questi dimeri

1

esistano in almeno tre stati conformazionali, detti L (loose o rilasciato) T (tight o teso) ed O

(open o libero) a seconda della capacità di legare ADP e Pi, ed ATP. Nello stato L il dimero

lega debolmente ADP e Pi, nella forma T lega ADP e Pi strettamente così da permetterne la

interazione a formare ATP e liberazione di una molecola di acqua; nello stato O perde affinità

per ATP con conseguente rilascio di ATP. I tre stati conformazionali sono acquisiti in

,

successione dai tre dimeri per cui al sopraggiungere del flusso protonico un primo dimero si

troverà a passare dallo stato O ad L, e quindi allo stato T per ritornare allo stato O; un secondo

dimero in successione seguirà lo stesso destino e così via fino al cessare del flusso protonico. Ne

consegue quindi che mentre ATP viene formato dallo su un dimero allo stato T, si dissocia in un

dimero vicino che ha acquisito lo stato O, mentre un terzo dimero in stato L lega debolmente su

di sé ADP e Pi. Questa successione di trasformazioni sarebbe innescata da un movimento

rotatorio di F indotto dal flusso di protoni che attraversano F in modo che il flusso protonico

1 0



investirà i dimeri uno alla volta ed in successione.

L’accoppiamento del gradiente elettrochimico creato dalla pompa protonica, di fatto dai tre

complessi I, III, IV della catena respiratoria con la sintesi di ATP ad opera del complesso V

trova i suoi presupposti nell’ipotesi chemioosmotica o di Mitchell, una delle teorie formulate per

spiegare questo accoppiamento e ad oggi la più confortata dalle evidenze sperimentali. Le altre

due teorie, a) formazione di un legame labile ad alto contenuto energetico, b) modificazioni

conformazionali covalenti di fattori proteici facenti parte della membrana mitocondriale

interna, che per altro non sono in contrasto con la teoria di Mitchell o addirittura rappresentarne

i due momenti essenziali: creazione del gradiente protonico a livello della catena respiratoria e

modificazioni conformazionali a carico del fattore F F .

0 1


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cecilialll di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Campo Salvatore.

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