Appunti Biologia Molecolare

Biologia molecolare

Introduzione alle biomolecole

Quando si parla di biomolecole in realtà non si parla solo di DNA, RNA e proteine. Le biomolecole comprendono anche i vari cofattori, le vitamine, gli zuccheri (la maggior parte del carbonio organicato si trova sotto forma di zuccheri), lipidi (sono fondamentali per definire il confine delle cellule, la membrana cellulare è costituita da fosfolipidi). C'è una serie di biomolecole molto importanti ma solitamente, nella biologia molecolare, ci si concentra su proteine, DNA e RNA.

Importanza di geni e DNA

Perché tutta questa enfasi sui geni e sul DNA anche se le biomolecole sono molte di più? La ragione è racchiusa nello schema delle vie metaboliche di una cellula. I punti rappresentano i metaboliti, sono connessi tra loro da delle reazioni. Ciascuna di queste reazioni è catalizzata da un enzima, ogni trasformazione di un metabolita in un altro è catalizzata da un enzima proteico. Quindi le proteine riescono a controllare tutte le altre componenti presenti all'interno della cellula. Le proteine vengono codificate a partire da un RNA, che a sua volta è trascritto da un gene del DNA. Tutto ciò spiega la ragione per cui ci occupiamo principalmente di queste biomolecole cioè DNA, RNA e proteine. Queste biomolecole permettono di organizzare anche tutte le altre molecole presenti nella cellula.

Ruolo della catalisi

Catalizzare una reazione vuol dire aumentarne la velocità. All'interno della cellula sono molti i composti che si trovano ad uno stato energetico abbastanza elevato e che possono trasformarsi in composti con energia più bassa quindi avremo molte possibili strade differenti che si possono prendere. La catalisi permette di aumentare un ramo specifico di una possibile via metabolica facendo in modo che un composto si trasformi in un altro piuttosto che in un altro ancora. La catalisi controlla il modo e i composti che si formano di volta in volta. In nessun modo, la catalisi fa cambiare il verso della reazione, non influenza la termodinamica della reazione.

Ad esempio, in una cellula abbiamo una chinasi che fosforila un determinato substrato ma abbiamo anche una fosfatasi che defosforila lo stesso substrato, quindi lo stato di fosforilazione dei vari substrati dipende dalla presenza di questi enzimi. Possiamo dire che la fosfatasi catalizza la reazione inversa che viene catalizzata dalla chinasi? Se una reazione è all'equilibrio, la reazione permane all'equilibrio quando si mette un catalizzatore, quindi, aumenta sia la velocità della reazione diretta che la velocità della reazione inversa. Da questo si deduce che la reazione catalizzata dalla fosfatasi non è l'inverso da quella catalizzata dalla chinasi. La chinasi prende una molecola di ATP che usa per fosforilare il substrato quindi alla fine della reazione otteniamo il substrato fosforilato e l'ADP oppure l'AMP, la fosfatasi non catalizza la reazione inversa.

La reazione inversa è catalizzata dalla chinasi stessa che non avviene per il ΔG positivo (non è favorita energeticamente, è favorita la fosforilazione), in questa reazione si riforma il substrato iniziale e ATP per la defosforilazione del substrato fosforilato. La reazione della fosfatasi è diversa, utilizza l'acqua per idrolizzare il legame tra il gruppo fosfato e il substrato, alla fine della reazione abbiamo il substrato defosforilato e un gruppo fosfato inorganico rilasciato nell'acqua (non otteniamo l'ATP quindi la reazione è diversa). Il prodotto di questa reazione si trova ad un livello energetico inferiore rispetto a quello ottenuto dalla reazione della chinasi. Le due reazioni si possono mettere in una cascata in cui abbiamo 3 livelli: al livello superiore abbiamo ATP e substrato iniziale, al livello intermedio abbiamo il substrato fosforilato e infine abbiamo il substrato defosforilato (che è lo stesso di quello iniziale) e fosfato inorganico.

Le catalisi sono molto importanti, hanno un ruolo fondamentale nella scelta dei metaboliti che si formeranno tra tutti quelli possibili. Gli enzimi che catalizzano le varie reazioni sceglieranno la strada che seguirà il metabolita. Gli enzimi sono una delle chiavi fondamentali della vita. Quasi tutti i catalizzatori presenti nelle cellule sono catalizzatori proteici. Questo è il modo in cui il DNA, attraverso l'RNA e le proteine, va ad influenzare tutte le biomolecole presenti nella cellula. Un catalizzatore agisce abbassando l'energia di attivazione della reazione, sia dell'andata che del ritorno. I catalizzatori catalizzano una reazione e la loro inversa, moltiplicando dello stesso fattore la velocità di andata e la velocità di ritorno. La reazione andrà in un certo verso perché la velocità di andata e di ritorno hanno un rapporto che dipende dalla termodinamica della reazione, alcune reazioni sono spostate completamente in un verso.

Problemi della biologia molecolare

I problemi più importanti della biologia/genetica molecolare sono: "In che modo sono codificate le informazioni genetiche all'interno degli organismi? Quanti livelli di codifica esistono?" e "Com’è regolata l'espressione genica?". Questo problema è stato risolto solo in parte. Il codice genetico non è il genoma. Il genoma è l'insieme di tutti i nucleotidi, è chiamato anche patrimonio genetico. Il codice genetico è la tabella di conversione tra le triplette e gli amminoacidi, è un codice che fa corrispondere i vari codoni ai vari amminoacidi. Il codice genetico, all'interno della cellula, viene utilizzato per costruire le proteine.

Ruolo degli amminoacil-tRNA

Come fa la cellula a far corrispondere un amminoacido a un nucleotide specifico? Un ruolo determinante nell'accoppiare gli amminoacidi alle triplette è giocato dagli amminoacil-tRNA (i tRNA caricati con gli amminoacidi). L'adattamento del codice genetico è memorizzato all'interno dei tRNA. I tRNA da soli non riescono a trasportare l'informazione di quale amminoacido devono legarsi. Gli amminoacil-tRNA sintetasi enzimi svolgono davvero l'accoppiamento tra amminoacidi e tRNA con il codone corretto. Il numero di enzimi corrisponde al numero di amminoacidi. Ogni enzima lega il suo amminoacido e cattura il suo tRNA basandosi sull'anticodone che è trasportato dal tRNA.

Gli amminoacil-tRNA sintetasi sono una classe di enzimi costituita da membri che hanno una selettività per un amminoacido (quello che lega l'alanina sarà l'alanil-tRNA sintetasi), l'enzima lega l'amminoacido da una parte e interagisce solo con il tRNA che ha l'anticodone dell'amminoacido a cui sono legati. L'enzima attiva l'amminoacido e lo legano al tRNA. Stabiliscono l'accoppiamento tra l'amminoacido e il tRNA con l'anticodone specifico. Siccome l'anticodone poi viene utilizzato per legare il tRNA all'mRNA, questi enzimi sono responsabili dell'accoppiamento tra amminoacido e il gusto codone del messaggero. Questi enzimi memorizzano il codice genetico.

Il codice genetico non è memorizzato in un supporto fisico ma in un ciclo che è sempre attivo. Le amminoacil-tRNA sintetasi sono responsabili di memorizzare il codice genetico ma sono loro stesse delle proteine che vengono codificate dal codice genetico che loro stesse memorizzano. Se facessimo sparire tutte le amminoacil-tRNA sintetasi da una cellula, quella cellula avrebbe un'incapacità teorica di ripartire. Nel suo genoma ci sarà il gene di ciascuna amminoacil-tRNA sintetasi ma l'unico modo per leggere quel gene e per generare un'amminoacil-tRNA sintetasi è quello di avere già delle amminoacil-tRNA sintetasi funzionanti che accoppiano correttamente gli amminoacidi al tRNA.

Solo grazie a questo accoppiamento corretto, loro stesse vengono perpetuate attraverso le generazioni. La vita funziona perché è sempre attiva, non si può sospendere, togliere delle componenti e rigenerarle a partire dal solo genoma. È un errore immaginare che tutti i tipi di riproduzione coinvolgono solo la trasmissione di materiale genomico, la trasmissione deve sempre prevedere anche l'interpretazione del DNA cioè un pacchetto di amminoacil-tRNA sintetasi e di tRNA caricati con gli amminoacidi in modo che il ciclo vitale non si interrompa mai. Se si trasmette soltanto il DNA senza queste componenti che servono per interpretarlo, il sistema non può ripartire. La vita da quando si è fermata non ha mai interrotto il suo funzionamento, l'interruzione sarebbe fatale ed impossibile da recuperare.

Memorizzazione del codice genetico

La memorizzazione del codice genetico non è esattamente all'interno del genoma. Nel genoma è presente una parte cioè le istruzioni per montare le amminoacil-tRNA sintetasi ma queste istruzioni devono essere interpretate da amminoacil-tRNA sintetasi che esistono già e che devono essere passate insieme al patrimonio genetico alla cellula figlia.

Livelli di codifica dell'informazione genomica

Esistono vari livelli di codifica dell'informazione genomica. Non tutte le informazioni genetiche vengono codificate in maniera convenzionale. Per esempio, pensiamo alla sorgente delle diversità delle immunoglobuline (anticorpi). Il nostro sistema immunitario si basa su molecole specifiche che legano in maniera specifica gli antigeni. In passato si pensava che gli anticorpi venissero costruiti utilizzando come stampo l'antigene stesso, ora si sa che tutti gli anticorpi sono già codificati prima che l'anticorpo entri in contatto con l'antigene. L'ingresso dell'antigene nell'organismo si limita a fare amplificare quella porzione di cellule che hanno anticorpi che si legano a quell'antigene. L'interazione tra antigene e sistema immunitario provoca un'amplificazione delle componenti che lo riconoscono.

È necessario che il nostro organismo sia in grado di codificare per un numero molto elevato di anticorpi differenti in modo da poter riconoscere quasi tutto quello con cui entriamo in contatto. Abbiamo la capacità di sintetizzare almeno un milione di anticorpi differenti, sono tutti costituiti da due catene proteiche. Come facciamo a sintetizzare tutti questi anticorpi differenti avendo un genoma costituito da circa 23000 geni? Come viene codificata l'informazione in questo caso? A giocare un ruolo importante nella codifica entra un meccanismo che a che vedere con il caso, è un meccanismo che coinvolge una randomizzazione. La regione dell'immunoglobulina che lega l'antigene è costituita da due catene dette catena leggera e catena pesante, in questa regione che lega l'antigene queste due catene sono abbastanza simili indipendentemente dalla loro lunghezza.

La randomizzazione nella codifica degli anticorpi

Tutte le immunoglobuline sono simili tra loro ma hanno degli amminoacidi diversi nella zona che lega l'antigene che gli conferiscono una capacità di legame differente rispetto ad antigeni diversi. La catena leggera e la catena pesante vengono, in tutte le loro varianti, generate da due soli loci genici, un gene per la catena pesante e un gene per la catena leggera. Ovviamente, essendo organismi diploidi, ne avremo una copia che deriva dalla madre e una che deriva dal padre ma nonostante questo normalmente solo una delle due copie è in funzione. Il locus che codifica per la catena pesante ha una struttura peculiare in cui vi sono dei moduli simili uno all'altro e ripetuti, sono delle variazioni di un motivo comune che vanno da V1 a V51. Ci sono 51 moduli diversi ma simili tra loro, sono delle variazioni dello stesso tema.

Poi troviamo 27 moduli che sono tra di loro simili ma differenti, vanno da D1 a D27. C'è un'altra serie di 6 blocchetti che vanno da J1 a J6. Una struttura simile è presente anche nel locus genico che codifica per la catena leggera dove abbiamo i blocchi V che vanno da V1 a V40, non abbiamo i blocchi D e abbiamo 5 blocchi J che vano da J1 a J5. Durante la maturazione dei linfociti B, che sono la componente cellulare che produce anticorpi, questa porzione genica viene profondamente riarrangiata. Questo normalmente non succede nei genomi delle altre cellule. Si dice che tutte le cellule hanno lo stesso genoma ma ci sono delle eccezioni tra cui i globuli rossi che non hanno un nucleo, quindi, non hanno nessun genoma e lo stesso vale per le piastrine che sono pezzi di cellule. Ci sono delle eccezioni mono macroscopiche tra cui linfociti B che hanno un genoma simile alle altre cellule tranne per la zona che riguarda i locus per le immunoglobuline che sono riarrangiati cioè il DNA viene tagliato, spezzato e in parte viene perso in maniera casuale.

Alla fine del riarrangiamento viene conservato un solo elemento V, un solo elemento D e solo un elemento J per la catena pesante e un solo elemento V e un solo elemento J per la catena leggera. Questi elementi che rimangono vengono scelti a caso. Entrambi i locus vengono riarrangiati in maniera casuale e viene preso un solo elemento di ogni modulo. Il tutto viene riattaccato insieme. Questo riarrangiamento è definitivo, i frammenti che si sono persi sono persi per sempre sia in quella cellula che in tutta la sua progenie. In questo modo possiamo produrre tutte le varianti delle immunoglobuline necessarie (> di un milione). Questo meccanismo permette al nostro organismo di produrre un numero elevato di anticorpi nonostante siano presenti solo due loci genici che codificano per queste proteine.

Il codice genetico

Per codice genetico si intende la tabella che fa corrispondere ad ogni tripletta di nucleotidi un solo amminoacido. 3 triplette (UAA, UAG e UGA) non corrispondono a nessun amminoacido, segnalano lo stop del polipeptide in formazione. Da questa deriva che questa tabella è universale in tutto il mondo vivente, anche se ha un certo numero di eccezioni correlate al fatto che alcuni codoni non vengono utilizzati da alcuni organismi oppure un codone può essere interpretato in maniera diversa. Si può trasmettere un'informazione genetica ad individui differenti, ad esempio da un batterio a un eucariote e viceversa, e questa verrà tradotta nella stessa maniera. Il codice genetico non differisce da specie a specie ma nemmeno da regno a regno. È universale.

Riarrangiamenti nei geni

Non tutti i geni vanno incontro a riarrangiamenti, in realtà quasi nessuno, solo quelli per le immunoglobuline e quelli correlati ad essi. Inoltre, questi geni vanno incontro al riarrangiamento solo in alcune cellule (linfociti B). Il linfocita B, durante la maturazione, va incontro al suo personale riarrangiamento e da quel momento sarà in grado di fare solo quella catena leggera modificata e quella catena pesante modificata. Quindi i vari linfociti saranno differenti tra di loro. Ci sono più linfociti rispetto ai riarrangiamenti che esistono quindi magari ci sono due linfociti che hanno fatto lo stesso riarrangiamento e produrranno le stesse immunoglobuline.

I linfociti diversi vanno incontro a riarrangiamenti casuali diversi e ci saranno almeno tanti linfociti quanti sono gli anticorpi differenti. Per avere due anticorpi diversi devo avere due linfociti diversi che sono andati incontro ad un riarrangiamento diverso. Questo riarrangiamento è legato alla maturazione che un processo differenziativo dei linfociti (il differenziamento è il processo che porta una cellula ad incasellarsi verso la sua discendenza cellulare, la cellula avrà caratteristiche sempre più specifiche. Per quanto riguarda le cellule del sangue, ad un certo punto, si dividono in lineage mieloide e lineage linfoide. Il lineage linfoide va incontro ad una maturazione differenziativa nella quale è previsto anche il riarrangiamento).

Il punto chiave del sistema immunitario è che una cellula e tutta la sua progenie riconoscono lo stesso antigene. Se un linfocita particolare incontra la molecola per cui ha affinità è in grado di sapere che l'ha incontrata, questo incontro stimola la proliferazione. Più la molecola viene riconosciuta, più la progenie crescerà e avremo un esercito di cellule che riconoscono lo stesso antigene. Funziona in questo modo l'adattamento del sistema immunitario, proliferano le cellule che riconoscono l'antigene con cui siamo entrati in contatto.

Tutte le nostre cellule hanno un cromosoma che deriva dalla madre e uno che deriva dal padre (la linea germinale è intatta quindi i locus non sono riarrangiati). Quindi avremo una catena pesante che deriva dal padre e una che deriva dalla madre, e lo stesso per la catena leggera. Ogni linfocita dovrebbe produrre 4 tipi di linfocita differenti ma questo non avviene, ne viene prodotto uno solo. Il riarrangiamento non è molto facile da eseguire, i linfociti che non riescono a farlo muoiono. Durante il riarrangiamento spesso il locus si rovina in maniera permanente e i sistemi di controllo prevedono che se il linfocita rovina tutte e due i loci muore. Sopravvive solo il linfocita che riesce a riarrangiare con successo sia la catena leggera che la catena pesante. Riuscire a fare il riarrangiamento una volta è molto difficile, riuscire a farlo 2 volte contemporaneamente è praticamente impossibile. Per questo, la maggior parte dei linfociti è in grado di fare un solo anticorpo.

Varie codifiche del genoma

Esistono vari livelli di codifica del genoma tra cui la capacità delle sequenze di nucleotidi di codificare seguendo la tabella del codice genetico, la codifica delle informazioni di quando un gene si deve accendere e in quali cellule (parti regolatorie del DNA) e la randomizzazione (è relativa solo ad un numero piccolo di geni ma è fondamentale).

Genomi nel mondo vivente

Guardiamo le dimensioni dei genomi in funzione del numero di coppie di nucleotidi di vari organismi differenti. Il numero di nucleotidi nei vari organismi varia di 6/7 ordini di grandezza, si va da un po' meno di 10⁶ a 10¹². Non c'è una relazione così ovvia tra le dimensioni del genoma e quella che è la complessità dell'organismo. Tra i genomi più grandi ci sono organismi non particolarmente complessi come le amebe, organismi semplici ma hanno uno dei genomi più grandi che...