Appunti Biologia Molecolare

Il complesso di giunzione esonica (exon junction complex)

Quando avviene lo splicing, nel punto in cui avviene la giunzione tra due esoni, rimangono legate queste proteine e restano legate anche nel momento in cui il messaggero esce dal nucleo attraverso il poro nucleare ed entra nel citoplasma. Queste proteine vengono staccate soltanto dai ribosomi. Le EJC, nel citoplasma, sono dei reclutatori di nucleasi. Se il messaggero è corretto e ha il codone di stop nell'ultimo esone, verrà attraversato dai ribosomi e queste proteine verranno tutte staccate. Se c'è un codone di stop prematuro, il ribosoma si stacca quando lo raggiunge e alcune EJC restano legate e provocheranno la degradazione del messaggero. Una proteina tronca si sarà formata ma non è la singola proteina tronca che porta a dei problemi, i problemi si hanno quando si formano tante proteine tronche. Se il codone di stop fosse prematuro ma comunque presente nell'ultimo esone non

verrebbericonosciuto da questo sistema ma essendo nell'ultimo esone la proteina è comunque finita.
Regolazione della stabilità dei messaggeri e degradazione
Ci sono dei regolatori della stabilità dei messaggeri e della loro disponibilità alla traduzione che miRNA (micro-RNA).
vengono chiamati Sono dei piccoli RNA che hanno attività sulla stabilità dei messaggeri. Vengono prodotti da geni nucleari che ne possono contenere più di uno. Viene pri-miRNA, prodotto un precursore che viene chiamato si possono trovare alla fine di alcuni messaggeri poli adenilati, in oggetti che contengono solo pri-miR o all'interno di un introne.
Normalmente vengono prodotti da RNA polimerasi II e spesso vengono prodotti in cluster cioè in gruppi. Acquisiscono una struttura a forcina che viene riconosciuta da un certo numero di enzimi che fanno si che essi vengano utilizzati come guida delle endonucleasi programmabili.
I miRNA vengono prodotti a partireda trascritti di Pol II (pri-miRNA) che si strutturano a forcina Drosha vengono riconosciuti da una nucleasi specifica chiamata Drosha. La nucleasi si lega al pri-miRNA, che è il trascritto primario, e lo taglia in punti specifici generando un intermedio a Pre-miRNA chiamato Pre-miRNA. Il Pre-miRNA viene esportato dal nucleo attraverso un carrier Exportin 5. A questo punto, i Pre-miRNA si trovano nel citoplasma e vengono processati da un'altra nucleasi chiamata Dicer che taglia il doppio filamento. Resta un tratto a doppio filamento detto miRNA duplex che viene catturato da un complesso di caricamento RISC del sistema, un complesso proteico che è in grado di separare i due filamenti e di catturarne uno solo dei due a seconda della struttura e della stabilità delle estremità. Il RISC funziona come una sorta di endonucleasi per RNA programmabile, cioè è in grado di tagliare altri RNA in posti che si appaiano al filamento di miRNA che

Regolazione della traduzione e degradazione dei messaggeri

Il processo di regolazione della traduzione e degradazione dei messaggeri avviene attraverso l'azione di complessi chiamati RISC (RNA-induced silencing complex). Esistono due tipi di RISC: RISC1 e RISC2.

Il RISC1 funziona come descritto in precedenza: il frammento di miRNA catturato agisce come guida per il RISC sull'RNA bersaglio, che viene quindi tagliato e degradato.

Il RISC2, invece, inibisce la traduzione del messaggero invece di tagliarlo. Questo complesso può agire anche su messaggeri che presentano solo una parziale complementarietà tra la sequenza dell'RNA e il miRNA.

I RISC1 tagliano l'RNA solo se c'è una complementarietà perfetta tra le sequenze. Questo meccanismo permette di regolare in modo preciso la traduzione o la degradazione dei messaggeri.

La regolazione tramite RISC è un processo molto veloce, ed è utilizzato in situazioni che richiedono una risposta rapida. Si ritiene che questo meccanismo sia derivato da un sistema di controllo dei virus, come una sorta di sistema immunitario delle cellule contro i virus a RNA.

Nei messaggeri possono essere presenti regioni chiamate AB, che contengono più sequenze riconoscibili dai complessi RISC.

più miRNA quindi più miRNA possono controllare lo stesso messaggero.

Traduzione

La subunità ribosomiale minore si lega al messaggero insieme al tRNA iniziatore, successivamente si lega la subunità maggiore e da li in poi inizia la sintesi: entreranno amminoacil-tRNA all’interno del sito A del ribosoma e questo effettua la trans-peptidazione che consiste nel passare la catena legata al tRNA nel sito P all’amminoacido legato al tRNA nel sito A, questo tRNA trasloca dal sito A al sito P in modo che questo meccanismo si ripeta fino al codone di stop.

Il ribosoma è una macchina molecolare molto complicata, è costituito da una quantità notevoledi RNA. Il ribosoma procariotico è il 70S, quello eucariotico è l’80S. Il ribosoma procariotico è costituito da due subunità dette 50S e 30S che sono formate da un rRNA 5S di 120 nucleotidi, un 23S di 2900 nucleotidi e da un 16S di 1540 nucleotidi. A questi rRNA sono

Associate delle proteine: 34 per la subunità maggiore e 21 per quella minore. Negli eucarioti abbiamo una subunità 60S composta da rRNA 5S di 120 nucleotidi, 28S di 47000 nucleotidi e 5.8S di 160 nucleotidi ed una subunità 40S costituita da rRNA 18S di 1900 nucleotidi. Negli eucarioti, al ribosoma sono associate 49 proteine per la subunità maggiore e 33 proteine per la subunità minore. Le differenze di costruzione di questi ribosomi ci permettono di utilizzare dei farmaci antibiotici che interagiscono selettivamente con il ribosoma batterico.

All'interno del ribosoma ci sono 3 siti di legame che ospitano tRNA. Vengono denominati sito P, sito A e sito E per l'amminoacil, per peptidil e per exit. L'amminoacil-tRNA arriva nel sito A, se c'è complementarietà corretta tra codone e anticodone (sulla terza base ci può essere un appaiamento non perfetto, viene chiamata posizione tentennante) e grazie ad essa più

triplette codificano per lo stesso amminoacido) avviene la trans-peptidazione cioè la catena proteica posta sul tRNA nel sito P si lega, tramite un legame peptidico con l’amminoacido presente sul tRNA nel sito A. Dopo di che si ha la traslocazione del ribosoma e questo fa si che il tRNA scarico finisce sul sito E e quello con la catena peptidica sul sito P e la procedura continua.

Questa reazione viene catalizzata da un la componente a RNA del ribosoma che stabilizza l’intermedio a più alta energia. Le proteine però sono fondamentali per il ribosoma gli permettono di acquisire la sua struttura. Senza le proteine il ribosoma non funziona anche se il centro catalitico è a RNA.

Il ribosoma si occupa soltanto di verificare che l’accoppiamento codone-anticodone sia corretto. Non si occupa del tipo di amminoacido che è legato al tRNA. L’unica attività responsabile nella amminoacil-tRNA sintetasi stabilire il codice genetico.

è quella dell’ , una classe di enzimi chehanno il loro tRNA e legano l’amminoacido al loro tRNA. Hanno un sistema di controllo molto raffinato che impedisce di far legare al tRNA un amminoacido sbagliato. Utilizzano un sistema di controllo a doppio setaccio. L’amminoacil- tRNA sintetasi ha un sito di una certa dimensione in cui entra l’amminoacido giusto ma questo sito potrà contenere anche amminoacidi più piccoli di quello giusto. A questo punto effettua l’attivazione utilizzando energia. L’enzima ha sito di correzione un ulteriore sito detto che ha una dimensione più piccola dell’amminoacido giusto quindi se viene legato un amminoacido sbagliato al tRNA questo entrerà nel sito di controllo e il suo legame viene idrolizzato. L’amminoacido giusto non entra in questo sito di controllo e resta legato all’tRNA, l’amminoacido più piccolo entra nel sito di controllo e viene idrolizzato il legame con

Il tRNA. A livello del ribosoma viene controllato soltanto l'appaiamento codone-anticodone, non viene controllato il legame con l'amminoacido. Se muto gli amminoacidi che si legano al tRNA, questi vengono comunque legati alla catena peptidica dal ribosoma. Tutti questi processi di controllo hanno la stessa accuratezza. Se ci fosse un passaggio con un'accuratezza minore, l'accuratezza totale dipenderebbe da questo passaggio quindi per questo hanno tutti la stessa accuratezza. Se un processo fosse più accurato degli altri non influenzerebbe in positivo l'accuratezza perché questa dipenderebbe sempre dai processi meno accurati. L'accuratezza maggiore di un solo processo sarebbe inutile e dannosa perché sprecherei più energia. L'accuratezza totale è la minima indispensabile per essere compatibile per la vita in modo che venga sprecata meno energia. Si fa circa un errore ogni 10 eventi catalizzati. I 3 processi

caratterizzati da questa accuratezza sono attivazione dell'aminoacido, controllo codone-anticodone e trascrizione del messaggero. Il ribosoma controlla il giusto appaiamento codone-anticodone calcolando l'energia di legame, cioè la forza del legame. Tra codone e anticodone si formano dei legami deboli quindi per valutare la loro forza si guarda per quanto tempo restano legati insieme. Se codone e anticodone stanno insieme per un tempo maggiore saranno complementari. La trans-peptidazione avviene dopo un certo periodo di tempo. Sul sito A c'è un amminoacil-tRNA legato ET-Tu ad una proteina ulteriore che si chiama (negli eucarioti si chiama EF1) che a sua volta è legata ad una molecola di GTP. EF-Tu è una GTPasi. L'idrolisi del GTP serve per temporizzare le reazioni. L'EF-Tu per diventare funzionante deve incastrarsi nel sito A, quando si incastra nel posto giusto le interazioni tra il ribosoma e il GTP generano il sito catalitico che

idrolizza il GTP. Questo processo non è istantaneo, ci vuole un certo tempo. Per essere nella posizione perfetta, il tRNA deve essere legato correttamente con il messaggero. Se il tRNA non è giusto resta legato al messaggero per poco tempo e questo non è sufficiente per far avvenire l'idrolisi della GTP. Quando avviene l'idrolisi del GTP questo si stacca dal tRNA ed esso effettua una rotazione che serve per portare l'amminoacido in posizione corretta per far avvenire la trans-peptidazione. Quindi l'accoppiamento tra codone e anticodone è regolato attraverso un timer basato sull'idrolisi del GTP che avviene solo se la GTPasi è in posizione corretta. Se il legame codone anticodone non è buono, il legame resta per poco tempo che non è sufficiente per far avvenire l'idrolisi del GTP. Se il legame resta per un tempo più lungo avviene l'idrolisi del GTP che si stacca e avviene la trans-peptidazione.

per una mutazione EF-Tu idrolizza il GTP più velocemente, si avrebbe un aumento degli errori perché accett