Biotrasformazioni alimentari - modulo 1

Biotrasformazioni alimentari

Modulo 1: chimica dei bioprocessi alimentari

Esame: 2 orali (1 per modulo) e sapere scrivere formule, reazioni; su appuntamento, no iscrizione su SIFA (iscrizione dopo aver avuto i due voti); fine di questo modulo il 29 ottobre e dopo due settimane si può già dare l’esame di questo modulo.

Introduzione ai bioprocessi

Quando si parla di bioprocessi si parla di: fermentazioni industriali (tradizionali food) o con microrganismi modificati; biotrasformazioni con cellule intere o enzimi isolati; produzione di metaboliti di cellule vegetali. Una biotrasformazione o bioconversione è una reazione chimica accelerata da catalizzatori biologici (biocatalizzatori). I biocatalizzatori sono nella maggior parte dei casi enzimi isolati e i microrganismi che li producono (cellule intere) o anche anticorpi catalitici: da una molecola e l’enzima si ottengono molecole che derivano dalla catalisi.

Il substrato e il prodotto sono chimicamente simili in quanto si cambia solo un gruppo chimico (proteasi e lipasi), mentre la fermentazione è una cascata di biotrasformazioni in quanto si ha un metabolismo con n-trasformazioni e si ottiene un prodotto diverso. Un enzima è un catalizzatore biologico e funziona perché abbassa l’energia di attivazione del substrato e favorisce la produzione del prodotto.

La fermentazione è un bioprocesso ma ci sono anche le fermentazioni come i processi metabolici dove la catena di trasporto di elettroni ha come accettore di ossigeno una molecola organica (bioetanolo, acido lattico). Quando si ha un fermentatore e si fa una fermentazione si ha un bioreattore con il substrato, il microrganismo cresce e si ferma in base al fatto che il prodotto sia del metabolismo primario o secondario.

Nel caso della biocatalisi si hanno due step: prima si ha la fase di produzione del catalizzatore che è una fermentazione e dopo di che l’enzima puro o la cellula intera viene separato dal brodo colturale e viene utilizzato in un altro sistema per fare la biotrasformazione. Con la fermentazione si hanno più geni codificati, mentre con la biotrasformazione solo uno.

Il catalizzatore biologico

Il catalizzatore biologico può essere una cellula microbica o un enzima isolato; la differenza è che con la cellula microbica viva (in grado di duplicarsi) o resting (non si duplicano ma gli enzimi sono ancora attivi) non si ha un solo enzima che funziona perché si hanno diversi metabolismi ed enzimi e quindi quando si usa una cellula microbica intera bisogna accertarsi che venga effettuata solo la bioconversione e che non ci sia competizione tra gli enzimi che lavorano sullo stesso substrato.

È comodo perché non bisogna purificare gli enzimi e quindi economicamente è più vantaggioso. Molti enzimi associati a cellule come ossido-reduttasi lavorano meglio quando sono dentro le cellule; quando si purifica l’enzima dalla cellula microbica e lo si usa con un optimum di crescita si ha la massima espressione dell’attività enzimatica. Se si ha un solo enzima, inoltre, si ha il sistema di massima selettività, si ha un’attività specifica (unità enzimatica = micromoli di substrato utilizzato/unità di tempo) e inoltre non si hanno problemi di diffusione (solido in liquido) attraverso le membrane di substrati, di prodotti e di calore.

Cellule microbiche per la biocatalisi

Con un enzima isolato dal punto di vista del set up industriale non richiede particolari attrezzature, mentre un impianto di fermentazione è più complicato e costoso. Si parla di cellule microbiche e non vegetali o animali in quanto hanno il vantaggio di avere tempi di crescita molto brevi (E. coli in 15 minuti duplica in fase esponenziale, lieviti qualche ora, muffe di più). La biodiversità microbica è molto elevata e quindi si hanno tanti enzimi disponibili e tante specie e generi che si possono selezionare.

Il database BRENDA contiene tutti gli enzimi prodotti come isolati, quindi il microrganismo di provenienza, l’optimum di pH e temperatura, gli inibitori, Km, Ka. Nell’alimentare si usano molto idrolasi, glicosidasi, lipasi, proteasi, esterasi, liasi ecc. Si ha un’estrema variabilità degli enzimi microbici a disposizione.

Enzyme evolution

Questa variabilità può essere incrementata artificialmente e nell’alimentare non trova tanta applicazione; questo si può fare con l’enzyme evolution prendendo i geni e migliorandoli dal punto di vista operativo, ovvero le prestazioni. Per fare questo si modifica la sequenza per generare dei mutanti della proteina che vengono verificati con test per vedere quale è migliorato per il parametro di interesse.

Questo approccio prevede delle tecniche di biologia molecolare che possono essere: approccio razionale, ovvero al posto di fare mutazioni random si fanno determinate modifiche in quanto sono già state fatte e grazie a kit si modificano gli amminoacidi nella sequenza; se questo funziona, la proteina è cambiata e può essere usata. Si possono fare più cicli di miglioramento. Nel caso della directed evolution si fanno mutazioni casuali in laboratorio e si vedono se ci sono proteine che sono migliorate per caratteristiche di interesse. Si fa con tecniche di error-prone PCR o DNA shuffling, quindi si usa una DNA-polimerasi che sbaglia e cambia la sequenza della proteina.

Biomasse e fermentazioni

Le biomasse sono un prodotto sempre più prevalente che derivano da fermentazioni ben messe a punto come la produzione di lievito da pane, starter dal settore latteo-caseario e probiotici facendo sì che l’industria della fermentazione si sia sviluppata. Poi si hanno le fermentazioni di sensu stricto come il metabolismo dell’etanolo, dell’acido lattico ecc, i prodotti dell’ossidazione incompleta come acido acetico e gluconico; proteine ricombinanti e cellulosa batterica, prodotti del metabolismo secondario e poi prodotti del metabolismo primario come gli amminoacidi.

Gli amminoacidi

In ambito alimentare gli amminoacidi sono molto importanti in quanto sono componenti essenziali della nutrizione, si usano come additivi alimentari come il glutammato monosodico (primo messo a punto); hanno importanza anche in altri ambiti come produzioni farmaceutiche e nella mangimistica (aa essenziali per gli animali), sono componenti per la sintesi di alcuni peptidi come l’aspartame o una serie di antibiotici di origine peptidica.

Come applicazione di nicchia si hanno moduli di partenza per la sintesi di prodotti della chimica fine anche come D-amminoacidi (in alimentare solo L-amminoacidi). Ad esempio, il catalizzatore di Corey viene sintetizzato a partire della prolina. In ambito industriale, si hanno tante tonnellate di produzione all’anno come l’acido glutammico, lisina, metionina (zootecnici) acido aspartico e fenilalanina. La metionina è usata nella forma racema.

Produzione di amminoacidi

Quando si parla di amminoacidi si parla di amminoacidi in configurazione L perché sono presenti nei peptidi di origine naturale, sono quindi una molecola chirale (definizione, enantiomero) con due enantiomeri che sono le stesse molecole con le stesse caratteristiche chimiche ma che possono avere diverse proprietà applicative proprio per la loro chiralità. In alcuni farmaci si usano gli enantiomeri S della penicillammina, mentre quello R è tossico; anche l’asparagina ha un enantiomero dolce e uno amaro ed è una proprietà che va conosciuta per poter fare un prodotto.

Gli amminoacidi industrialmente si ottengono con l’estrazione di peptidi da fonti proteiche di origine naturale (animale e vegetale) con un’idrolisi chimica totale ottenendo una soluzione di amminoacidi. Oppure si può usare la sintesi chimica da precursori dell’industria petrol-chimica come la sintesi della metionina. Gli enzimi sono molecole chirali e quindi le biotrasformazioni e le fermentazioni consentono di ottenere gli amminoacidi tramite una catalisi enzimatica o come prodotti del metabolismo primario partendo da una fonte di carbonio e con un microrganismo produttore. Lavorando sul microrganismo e sulle condizioni di processo si riesce a ottenere l’amminoacido di interesse.

Si può partire da un precursore chimico alfa-cheto-acido che viene trasformato con una biotrasformazione nell’amminoacido corrispondente. Gli amminoacidi prodotti per fermentazione sono composti che vengono posti sul mercato a costi bassissimi portando a conseguenze sul modo in cui si produce, quindi sulla matrice di partenza, sulla volumetria della fermentazione ecc.

Produzione fermentativa di amminoacidi

La produzione fermentativa di amminoacidi può avere come esempio la produzione di acido glutammico e di lisina; il punto comune è che per definizione quando si ha una cellula microbica fisiologicamente funzionante, non accumula metaboliti primari; tuttavia, nel fermentatore industriale si devono produrre circa 250 g/L e quindi le vie metaboliche devono smettere di funzionare per fare in modo che il metabolita venga accumulato in elevate concentrazioni e secreto nel brodo colturale.

Questo perché quando si produce una quantità elevata all’interno del citosol della cellula, la concentrazione fa esplodere la cellula; dopo la fermentazione c’è sempre un down-stream e per recuperare una molecola piccola come un amminoacido all’interno della cellula bisogna romperla ma è un costo elevato; quando si hanno produzioni di molecole del metabolismo primario si studia sempre la secrezione del composto in maniera efficiente nel terreno colturale perché si fa una filtrata e si lavora sul brodo per fare la purificazione.

Bisogna favorire l’accumulo e la produzione dell’amminoacidi che serve e quindi dato che si hanno vie metaboliche primarie bisogna agire sulla deregolazione della vita metabolica favorendo l’accumulo degli intermedi con diverse strategie. Una strategia è eliminare le reazioni secondarie, quindi qualsiasi reazione enzimatica che utilizzi come substrato un intermedio della via metabolica che serve o il prodotto finale.

Produzione industriale di amminoacidi

La produzione industriale di amminoacidi nasce in Giappone nel dopoguerra con la messa a punto della produzione di amminoacidi facendo uno screening per vedere se qualche isolato microbico da diversi ambienti era in grado di accumulare amminoacidi; si sono accorti che ci sono dei batteri come Corynebacterium che in terreni sintetici sono in grado di accumulare piccole quantità di amminoacidi e poi facendo uno studio approfondito del metabolismo di questi batteri si è scoperto Corynebacterium glutamicum di cui si conosce il metabolismo, le vie metaboliche, i plasmidi ed è un gram-positivo. Facendo lo screening si è visto che alcuni ceppi sono in grado di accumulare amminoacidi per deregolazioni date da mutazioni.

Per produrre un metabolita primario bisogna quindi avere un microrganismo mutante che può essere ricombinante, regolatore o auxotrofo. I mutanti ricombinanti sono microrganismi dove si hanno inserimenti e delezioni di geni per favorire una caratteristica particolare che serve nel processo come l’over-espressione delle proteine di membrana che sono i trasportatori attivi che favoriscono l’escrezione dell’amminoacido verso l’esterno.

I mutanti auxotrofi sono mutanti che per qualche motivo mancano di uno o più enzimi nella sintesi di amminoacido e quindi hanno bisogno che sia presente nel terreno colturale; quasi tutti gli amminoacidi sono connessi e quindi se una via biosintetica funziona si producono gli amminoacidi finali e non gli intermedi e per produrre un amminoacido intermedio sarà più facile se il ceppo ha la via metabolica interrotta dopo la produzione dell’amminoacido in quanto questo verrà accumulato e non utilizzato. Con ceppi auxotrofi per amminoacidi finali si ha l’accumulo di quello intermedio.

Al giorno d’oggi, per ottenere un ceppo auxotrofo si usano tecniche del DNA ricombinante facendo delezioni, mentre prima si procedeva partendo da una popolazione microbica mista o pura dove bisogna generare mutazioni sottoponendola ad agenti come raggi UV, composti chimici come bromuro di etidio; dopo di che si ottiene una popolazione mista di cellule mutate o non e quindi bisogna selezionare i mutanti auxotrofi per l’amminoacido di interesse e per fare questo si prende la coltura e la si piastra nel terreno senza l’amminoacido di interesse e se il microrganismo è auxotrofo va in quiescenza, quindi non si duplica e si possono selezionare gli auxotrofi sottoponendo la piastra a un agente che uccide le cellule che si stanno duplicando, ovvero la penicillina. Così si hanno solo le colonie in quiescenza e queste vengono messe in un terreno ricco ottenendo una linea cellulare auxotrofa.

Oggi si sequenzia il genoma della cellula e si guarda dove ci sono le mutazioni e per che amminoacidi il ceppo è auxotrofo. I mutanti regolatori hanno la via biosintetica dell’amminoacido deregolata, quindi non hanno feedback o repressione dovuto al prodotto della via; per selezionare un mutante deregolato si prende la popolazione sottoposta ad agente mutageno e la si mette a contatto con concentrazioni sempre crescenti della sostanza per cui si cerca la deregolazione.

La lisina ha un catabolismo successivo alla produzione e il sistema per ovviare a questo fenomeno è utilizzare gli analoghi strutturali, quindi si usa molecola SAEC che è strutturalmente uguale alla lisina tranne per un atomo di zolfo che viene sostituito da un atomo di carbonio e quindi tutta la parte di utilizzo successivo non c’è più ma dal punto di vista del riconoscimento allosterico l’enzima per cui si cerca la deregolazione funziona ancora e quindi può accadere che utilizzando concentrazioni elevate di SAEC si trovano i deregolati. In generale, i ceppi selezionati produttori industriali di amminoacidi sono insieme mutanti auxotrofi, ricombinanti e regolati perché in questo modo si ottengono alte concentrazioni di produzione.

Produzione di acido glutammico

Per l’ottenimento del glutammato, in primo luogo il glucosio entra nella cellula e poi va nella glicolisi e nel ciclo di Krebs; l’acido glutammico si ottiene dall’alfa-cheto-glutarato che è il substrato del ciclo di Krebs perché viene trasformato in acido succinico, oppure viene trasformato in glutammato e accumulato a 1,5-2 M (250 g/L). Si lavora con un metabolismo centrale per la vita della cellula e si sottraggono 2 M di alfa-cheto-glutarato e quindi la cellula smette di funzionare: si deve avere un sistema per non far smettere di funzionare il ciclo di Krebs grazie al fosfo-enol-piruvato e piruvato che sono le vie anaplerotiche (riempimento).

Le cellule che fanno queste concentrazioni di acido glutammico hanno vie anaplerotiche ben espresse e funzionanti che prevedono l’intervento di carbossilasi che sono enzimi che dipendono da un cofattore organico, ovvero la biotina. L’acido glutammico è una delle vie con cui una cellula microbica incorpora azoto inorganico; l’alfa cheto-glutarato viene amminato a glutammato; questa reazione è catalizzata dalla glutammato deidrogenasi che dipende dal NADPH. L’amminazione riduttiva è una reazione accoppiata e prevede l’ossidazione del NADPH che diventa NADP⁺ e acqua; questa via biosintetica è una delle vie che utilizza la cellula per incorporare azoto inorganico. Questo enzima funziona bene quando la concentrazione di ioni ammonio è 1 mM perché la Km per lo ione ammonio è circa 1mM e sotto questa concentrazione lavora male e quindi c’è un altro modo per incorporare azoto inorganico dalla cellula che è il GSGOGAT che prevede la glutammina sintasi e la glutammato sintasi: sono due semi-reazioni che accadono instantaneamente, quindi GS prende una mole di glutammato, lo ammina a glutammina spendendo una mole di ATP.

La glutammina reagisce con il sistema GOGAT dove una mole di glutammina reagisce con l’alfa-cheto-glutarato e si formano due moli di glutammato a discapito dell’uso di una mole di cofattore ridotto. Facendo la somma delle due semi-reazioni, si ottiene la stechiometria:

Si ottengono quindi due moli di glutammato; quando si ha una concentrazione esterna più bassa si spende energia per incorporare azoto inorganico. A livello industriale noti questi due sistemi enzimatici la concentrazione dello ione ammonio deve essere 1 mM in quanto non prevede l’uso di ATP e le cellule si duplicano; in questo modo è favorito il meccanismo della glutammato deidrogenasi. L’alfa cheto-glutarato è anche usato per fare il ciclo di Krebs e quindi le velocità della glutammato deidrogenasi deve essere 100-200 volte più veloce dell’alfa-cheto-glurato deidrogenasi, quindi si ha un ciclo di Krebs meno efficiente ma si ha la produzione di glutammato.

Effetto della biotina

L’effetto della biotina è importante in quanto ha effetto positivo sulla produzione di glutammato perché favorisce l’anaplerosi; tuttavia, Corynebacterium accumulano amminoacidi quando la biotina è in concentrazione basse perché è cofattore anche delle carbossilasi dell’acetil-CoA che è il primo passaggio per la biosintesi degli acidi grassi e avendo una concentrazione di biotina bassa si ottiene una permeabilità più alta delle cellule e facendo il test sulla concentrazione del glutammato fuori dalla cellule si vede il glutammato perché esce dal citosol.

La biotina ha effetto sulla via biosintetica perché favorisce l’anaplerosi ma anche sulla permeabilità e quindi bisogna giocare sul bilancio a livello di concentrazione: la biotina viene mantenuta a concentrazioni alte per favorire il riempimento del ciclo di Krebs a livello dell’alfa-cheto-glutarato e si lavora in un altro modo sulla permeabilità della membrana perturbandola con agenti chimici come acidi grassi saturi, glicerolo, carenza di acido oleico (penicillina) ecc. Si è obbligati a lavorare in questo modo per una questione economica che dipende dalle materie prime che si usano per la fermentazione; a livello industriale produrre glutammato utilizzando glucosio puro come substrato non ha senso e quindi si usano materie prime industriali che...