Biotrasformazioni alimentari - modulo 2

Separazione in condizioni diverse

Quando si aumenta la concentrazione di ammoniosolfato si ha poi una separazione in condizioni diverse; il coefficiente tende a crescere all'aumentare della concentrazione dell'ammoniosolfato e quindi il modo in cui si distribuisce nelle due fasi cambia. Questo si ha anche quando diminuisce la percentuale di PEG. Il coefficiente di ripartizione rappresenta il rapporto di concentrazione dell'enzima che ha nelle due fasi; bisogna tenere in considerazione qual è il volume che hanno le due fasi in quanto la quantità di enzima che si recupera non è per forza maggiore se la concentrazione nella fase è più alta ma dipende dalla concentrazione nella fase per il volume che ha la singola fase. Quando si valuta se conviene modificare le concentrazioni delle due fasi per aumentare il coefficiente di ripartizione bisogna tenere in considerazione di come varia il volume nelle due fasi. Quando PEG e solfato di ammonio hanno concentrazione fissa, il sistema

proteina intracellulare e quindi dal brodo colturale si centrifuga per recuperare le cellule intatte; si utilizza un mulino a palle per lisare le cellule. Da 50 kg di cellule si diluisce con 75 kg di acqua, quindi, si usa un gran volume di acqua rispetto al volume delle cellule presenti; si usa acqua perché contribuisce a rendere le cellule più fragili per shock osmotico e inoltre l'acqua viene aggiunta fredda contribuisce a non far alzare troppo la temperatura. Inoltre, in questo processo non c'è una separazione degli acidi nucleici e quindi diluire consente di rendere meno viscosa la soluzione. Viene fatto un trattamento termico a 54°C per 10 minuti; questo può contribuire a inattivare altri enzimi proteolitici presenti che potrebbero degradare l'enzima di interesse. A questa temperatura, le proteine non di interesse si possono denaturare, coagulare e precipitare e quindi si può usare la temperatura per fare una precipitazione frazionata (ipotesi). Si

ottengono 125 L di liquido con il lisato cellulare e si aggiungono potassio fosfato, PEG 400 e PEG1550 che vengono pre-disciolti in 125 L di soluzione; si ha un'elevata precisione delle quantità aggiunte. In queste condizioni l'enzima si concentra nella fase PEG che è quella sta sopra perché meno polare. Dopo di che si centrifuga e nella fase sottostante con i Sali ci sono i detriti cellulari che non vengono separati prima per filtrazione ma vengono lasciati perché con la separazione di fase la proteina di interesse si raccoglie nella fase PEG e i detriti cellulari precipitano e vengono separati con la fase salina sottostante. Sicuramente il coefficiente di ripartizione fa sì che l'enzima si concentra quasi tutto nella fase di PEG. La fase che contiene l'enzima in PEG viene aggiunta di altri Sali, ovvero cloruro di potassio e potassio fosfato: quando si miscela si forma un'altra separazione di fase; si forma una nuova

separazione di fase ma in questa secondaseparazione l'enzima si raccoglie nella fase che contiene il fosfato a causa del cambio della forza ionica. Dopodi che si separa per gravità, la fase con il PEG viene separata e la fase sottostante contiene l'enzima; poi siaggiunge ancora potassio fosfato PEG 400 e PEG 1550 e in queste condizioni l'enzima torna a concentrarsinella fase PEG. Modificando le concentrazioni di sale e PEG presente l'enzima non per forza finisce nellastessa fase ma il modo in cui cambia il coefficiente di ripartizione e il volume delle due fasi fa sì che l'enzimasi purifichi in una delle due fasi. Si hanno 233 L in cui si raccoglie l'enzima (da 50 kg di cellule). L'ultimopassaggio prevede l'aggiunta di potassio fosfato che viene aggiunto solido e si forma una separazione di fasein cui si forma una fase glicole che contiene l'enzima e una fase salina che contiene il fosfato e poco enzima. Si raccoglie

La cromatografia permette di separare le proteine in base alle loro caratteristiche chimico-fisiche peculiari; funziona con una colonna con la fase fissa su cui viene fatta scorrere la fase mobile. Quelle idonee a separare le proteine sono distinte in due grandi gruppi: il primo separa le proteine per dimensioni ed è inclusa la cromatografia per gel-filtrazione (GPC); l'altro gruppo sono le cromatografie che separano le proteine sfruttando la loro affinità con la fase fissa e in queste rientrano tecniche in cui la proteina instaura un legame con la fase fissa e quindi si ha sempre una fase in cui la proteina si lega in qualche modo. Tra queste si hanno la cromatografia a scambio ionico, interazione idrofobica, a fase inversa e di affinità. La prima e l'ultima sono quelle maggiormente utilizzate.

Cromatografia per gel-filtrazione: separa le proteine in funzione della loro dimensione (massa) e in questa tecnica non si può formare un legame tra proteina e fase fissa.

fase fissa che permette di fare la separazione è costituita da un gel poroso main realtà è fatta da particelle di gel poroso. La fase mobile scorre nella fase fissa trascinandole proteine che sono solubili nella fase fissa. Quando la proteina è piccola può entrare nei pori delle singole particelle; il fatto che la molecola possa accedere a questi pori fa sì che venga trattenuta dalla fase fissa. Il fatto che la proteina è piccola fa sì che le particelle di gel trattengono la proteina e compiono un percorso più tortuoso; le proteine più grandi che non entrano nei pori attraversano la colonna passando nelle particelle con un percorso più lineare e vengono eluite per prime. Si ottiene un cromatogramma dove si ha un segnale strumentale che rileva quando la proteina viene eluita; il cromatogramma è composto da più picchi che corrispondono alla proteina. In una gel-filtrazione i primi picchi sono le proteine

condimensioni maggiori e poi si hanno quelle più piccole; è una tecnica di purificazione in quanto si separano dalle altre proteine con cui prima erano miscelate. Le fasi fisse possono essere distinte per due caratteristiche: dimensione dei pori che hanno le particelle; le dimensioni differenziano la classe di PM che possono venire separati. In base alla dimensione che hanno i pori tutte le fasi fisse sono caratterizzate da un certo limite di esclusione che è il PM massimo che può venire efficacemente separato; tutte le molecole che hanno un PM più grande escono assieme dalla cromatografia non separate dalle altre nel primo picco del cromatogramma. La dimensione dei pori permette di distinguere le proteine; un parametro importante è anche la dimensione delle particelle, ovvero apertura di porosità, si possono avere particelle più grandi o più piccole. Le particelle vengono differenziate in micrometri ma molte volte in fine,

medium e coarse. Cambiando la dimensione delle particelle si modifica la resistenza che la fase fissa esercita rispetto allo scorrimento della fase mobile; più le particelle sono piccole, più la fase fissa oppone resistenza allo scorrimento della fase mobile. Più le particelle hanno dimensione piccola, migliore è la separazione e la risoluzione. Trovare questo compromesso non è facile e su scala di laboratorio si usano particelle piccole, mentre su scala industriale si hanno particelle di dimensione maggiore con produttività maggiore e molte volte a livello industriale si lavora con prodotti grezzi che potrebbero far fatica a fluire nella fase fissa. Il flusso della fase mobile è funzione della pressione: maggiore è la pressione, maggiore è il flusso. Se a un certo punto si continua ad aumentare la pressione, la fase fissa collassa sotto la pressione esercitata dalla fase mobile e quindi utilizzare particelle più grandi.

consente di avere un flusso maggiore senza avere un aumento eccessivo della pressione. Più una fase fissa ha pori grandi, più è adatta a separare proteine con dimensioni maggiori e meno è resistente all’aumento di pressione e collassa più facilmente. La sephadex G-25 ha un limite di esclusione molto piccolo, circa 8000 Da (50-60 aa pochi più grandi dei peptidi) e viene utilizzata per fare un cambio di solvente. Tutte le proteine del campione non vengono separate tra di loro ma eluiscono tutte insieme nel primo picco del cromatogramma, mentre le specie chimiche che vengono rallentate sono Sali o altre piccole molecole e quindi eluiscono più tardi. Raccogliendo le proteine del primo picco sono purificate dai Sali in cui erano disciolte all’inizio; sono sciolte nel tampone della fase mobile e così si cambia il tampone alle proteine. Sephadex è disponibile con diverse dimensioni di particelle per utilizzarlo su