Biotrasformazioni alimentari - modulo 2

Biotrasformazioni alimentari modulo 2

Enzimi

Un enzima catalizza una reazione, ovvero ha la capacità di abbassare l’energia di attivazione di una reazione rendendola più veloce; un enzima non può rendere possibile una reazione che non è spontanea, che non può avvenire. Una reazione può avvenire quando i prodotti hanno un livello energetico più basso di quelli iniziali e questa differenza di G, livello energetico, viene misurata con il quindi, l’enzima rende più veloce una reazione già spontanea. Non sempre tutto il substrato diventa un prodotto in quanto la reazione raggiunge il suo stato di equilibrio.

Gli enzimi sono proteine importanti usati nelle biotrasformazioni e per essere quantificati bisogna misurarne la velocità, ossia il prodotto che si forma nel tempo; la velocità di una reazione dipende da quanto enzima è presente, dal substrato presente, dal pH, dalla temperatura e dalla forza ionica, quindi, è un qualcosa di relativo. Per gli enzimi non cooperativi vale l’equazione di Michaelis-Menten, mentre per quelli cooperativi allosterici seguono un’equazione diversa come quella di Hill con cui viene introdotto un esponenziale; h è un parametro che misura quanto è cooperativa la reazione e quando vale 1 l’enzima non è cooperativo.

L’attività di un enzima si misura valutando come procede una reazione e vi è sempre associata un’attività specifica, ovvero espressa sull’unità di attività enzimatica ed è legata alla purezza; l’attività enzimatica è una misura relativa perché dipende dal saggio enzimatico utilizzato per misurarla. Ecco perché quando si dichiara l’attività enzimatica si dice anche il tipo di saggio utilizzato per misurarla.

Caratteristiche delle proteine nelle biotrasformazioni

Le proteine e gli enzimi nelle trasformazioni alimentari possono avere diverse applicazioni e classi di impiego; una prima distinzione è tra quando vengono utilizzate per fare un nuovo prodotto e quando vengono utilizzate come nuova tecnologia per realizzare un prodotto già esistente. L’applicazione di proteine come enzimi permette di produrre prodotti merceologicamente nuovi e che senza questi enzimi non potrebbero essere prodotti; per esempio, il latte HD ad alta digeribilità viene prodotto con la lattasi per idrolizzare il lattosio a glucosio e galattosio e questo prodotto dal punto di vista merceologico non è latte ma è diverso, nuovo e si può produrre solo con enzimi.

Altri esempi includono vari sciroppi di glucosio e fruttosio prodotti da diversi amidi, margarine, biodiesel, ecc. In altri casi invece gli enzimi e le proteine sono applicati per produrre in modo più semplice, sicuro, vantaggioso prodotti già esistenti; alcuni esempi sono i processi estrattivi nella produzione dell’olio con enzimi idrolitici che idrolizzano le pectine e la struttura dell’oliva semplificando l’estrazione. Nella panificazione tutti i prodotti vengono ottenuti utilizzando enzimi come miglioratori. Gli enzimi sono importanti anche per il controllo qualità come nella determinazione di attività enzimatiche residue, ad esempio nel caso del latte pastorizzato, dove deve essere assente la fosfatasi e presente la perossidasi come indicatore di un trattamento non eccessivamente drastico.

Legislazione e applicazioni degli enzimi

Tutte queste proteine ed enzimi che possono essere applicati nell’industria alimentare e nelle biotrasformazioni sono soggetti a legislazione: quando una proteina non ha attività specifica non ha una normativa specifica se non quella generica che riguarda l’etichettatura; se le proteine vengono utilizzate come ingrediente devono essere presenti nell’etichetta e soprattutto se sono allergeniche devono essere indicate. Un esempio sono le birre per celiaci o la lattoferrina che ha proprietà importanti nei confronti dei neonati e nel caso dei latti per neonati intolleranti bisogna dare una lattoferrina che non sia stata purificata dal latte perché altrimenti è un potenziale allergene; si ricerca in altre fonti microbiche e vegetali che hanno le stesse proprietà nutrizionali in modo da non indicare in etichetta che il prodotto contiene tracce di latte.

Per quanto riguarda gli enzimi, si ha una differenziazione in additivi o coadiuvanti: la grande distinzione è che l’additivo va dichiarato in etichetta, mentre il coadiuvante non va dichiarato in etichetta. Il consumatore preferisce non avere una dichiarazione e in genere un enzima è considerato additivo quando è presente ancora attivo nel prodotto consumato, mentre è un coadiuvante quando non è più attivo nel prodotto finito. Enzimi additivi sono il caglio nella mozzarella, il lisozima nel Grana Padano (recentemente declassato a coadiuvante perché con stagionatura non è più attivo).

Questa differenza è molto importante e viene definita dai regolamenti CE: a livello comunitario si trovano solo due enzimi, ovvero il lisozima e l’invertasi che sono autorizzati come additivi alimentari con il loro E-number in etichettata; tutti gli altri enzimi in attesa che vengano dichiarati come utilizzo comunitario vengono rimandati a regolamenti nazionali. Interessante è la definizione di coadiuvante tecnologico: tutte le sostanze di per sé non destinate al consumo alimentare diretto, bensì utilizzate nella trasformazione di materie prime, alimenti o loro ingredienti, per esercitare una determinata funzione tecnologica nella lavorazione o nella trasformazione, le quali possano dar luogo alla presenza, non intenzionale ma tecnicamente inevitabile, di residui di tali sostanze o loro derivati nel prodotto finale, a condizione che questi residui non costituiscano un rischio per la salute e non abbiano effetti tecnologici sul prodotto finito.

Non ricorre l’obbligo di citare i coadiuvanti in etichetta, quand’anche residuino nel prodotto finito. Ad esempio, la glucosio-ossidasi nel pane non è un ingrediente ma conferisce una maggiore forza alla farina e quindi è un coadiuvante tecnologico. Va indicato in etichetta qualsiasi ingrediente o coadiuvante tecnologico derivato da una sostanza o un prodotto che provochi allergie o intolleranze usato nella fabbricazione o nella preparazione di un alimento e ancora presente nel prodotto finito, anche se in forma alterata. Il lisozima aggiunto nel Grana Padano viene estratto dall’uovo e quindi si ha una polemica al suo utilizzo.

Produzione e mercato di enzimi e proteine

Tutti gli enzimi e le proteine possono essere prodotti in varie modalità; nell’industria chimica si hanno bulk chemicals, ovvero le sostanze prodotte in scala larga che servono per soddisfare il mercato globale. In genere hanno un basso costo e quindi si hanno grandi quantità di prodotto. I fine chemicals richiedono costi di produzione più alti e vengono lavorati in piccola quantità e in genere con processi non continui. Questa differenza tra bulk e fine chemicals può essere riportata anche per il mercato delle proteine e degli enzimi applicabili nelle produzioni industriali con delle differenze: con i bulk chemicals per gli enzimi si parla di quantità molto elevate (quintali) e quindi sono tutte le proteine ottenibili a basso costo e tra questi rientrano molti enzimi a perdere destinati per applicazioni grossolane. I fine chemicals sono invece proteine che hanno un più alto valore aggiunto prodotte in minore quantità perché richiedono processi estrattivi e di purificazione più complicati e in questa categoria rientrano molti enzimi intracellulari; sono utilizzati e recuperati per essere reinseriti in un ciclo produttivo, hanno un costo maggiore.

Oltre a questi si hanno anche specialty chemicals che sono prodotti a un livello di purezza ancora più alto e che hanno caratteristiche particolari come principi farmaceutici (ormoni), proteine ed enzimi ultrapuri per uso farmacologico (insulina).

Dal latte possono venire purificate numerose proteine che sono di interesse per le biotrasformazioni; il latte contiene circa il 3% di proteine, ovvero 30g/L e può essere purificata come bulk chemicals la caseina e sul mercato ha un prezzo di circa 30€/kg. Dal siero si può recuperare come fine chemicals la lattoferrina che è presente per il 0,1% e che viene utilizzata per diversi scopi e per farne 1 kg serve una tonnellata di latte; guardando il prezzo della materia prima ci si dovrebbe aspettare 1000€/kg ma in realtà è pari alla metà perché viene ottenuta da un sottoprodotto derivante da altre produzioni. Al dettaglio il prezzo è di 6000 €/kg rispetto all’ingrosso che è 500€/kg. Ciò che avanza può essere utilizzato per estrarre specialty chemicals, ovvero immunoglobuline che sono presenti per circa 1 mg/L e costano 1000€/g.

La differenza tra bulk e fine chemicals non è sempre così semplice perché non è importante solo la scala produttiva ma anche il livello di purezza con cui sono ottenuti questi enzimi o proteine. Ad esempio, le cellulasi hanno numerosi utilizzi nelle biotrasformazioni e nell’industria alimentare e l’azienda che produce a larga scala e a un alto livello di purezza li produce per l’industria tessile; il livello di purezza per usarli nell’industria tessile o nell’estrazione dell’olio è diverso e quindi questo livello può incidere sul fatto di avere bulk o fine chemicals.

Nel latte HD si usa la lattasi e oggi giorno viene prodotta mettendo l’enzima nel latte e facendolo agire per un certo tempo, a cui segue la sterilizzazione e la vendita; il tempo di sosta del latte costa e quando si idrolizza il lattosio la quantità di zuccheri riducenti raddoppia e si possono avere delle reazioni di Maillard per reazione con le proteine dando un gusto di cotto. Molte preparazioni di lattasi non hanno un livello di purezza elevatissimo e possono portarsi proteasi che danno reazioni di Maillard. Ecco che si sono studiati processi in cui si tratta termicamente il latte e poi l’enzima viene aggiunto come sterile e lasciato agire durante la distribuzione del prodotto; il problema non deve essere attivo al momento della vendita e se ci sono proteasi agiscono per molto tempo portando a un deterioramento del latte. La soluzione è efficace per prevenire il gusto di cotto ma se l’enzima non è ultra-puro si rischia di rovinare il prodotto nella conservazione.

Sono diversi gli enzimi e le proteine che possono essere utilizzati e le aziende che operano nel settore li vendono come materie prime, coadiuvanti; in realtà le aziende non vendono soltanto queste proteine o enzimi perché quasi sempre trattano anche l’impiantistica necessaria per applicare queste nuove tecnologie. Il punto forte dell’azienda è vendere la proteina e garantire un impianto brevettato in cui far avvenire il processo e differenziare il prodotto; quasi sempre le aziende oltre a vendere il prodotto forniscono anche dei servizi che sono il punto di forza. Gli enzimi non vengono venduti puri ma come formulazioni di impiego che sono già indicate per lo scopo che devono raggiungere presso il consumatore finale che è l’azienda che produce il prodotto alimentare; si vende una formulazione unica che dà il giusto prodotto. Infatti, insieme viene anche venduto il protocollo applicativo e quando serve aiutano il cliente sia con un’assistenza diretta e personalizzata per adattare il prodotto alle esigenze del cliente sia per customizzare i processi e gli impianti produttivi. Viene venduto anche il know how su come utilizzare le molecole.

In queste aziende si deve avere un guadagno e quindi il ricavo di vendita ricopre i costi di produzione degli enzimi; il ricavo è dato dal prezzo unitario del prodotto da vendere per il numero di utenti che lo comprano e il numero di utilizzi che ne fanno. Alzando il prezzo, la vendita diminuisce e il cliente sceglie un altro concorrente e quindi per modificare il ricavo si cerca lo stesso enzima da origini diverse per avere un prezzo unitario ancora più basso e rendere più competitivo il prezzo di vendita del prodotto. Il guadagno c’è se il costo è inferiore al ricavo stesso; il costo più grande è quello associato alla ricerca che è pagata dalla collettività; l’azienda non finanzia la ricerca ma lo sviluppo del prodotto, quindi, la messa a punto del processo anche se oggi giorno è in parte ricoperto dalla collettività. Importante è il costo di protezione del processo da parte dell’azienda che può essere fatta con brevetti o mantenendo il segreto industriale; gli enzimi non sono brevettabili ma si brevetta l’applicazione.

Molti processi non sono brevettabili e vengono protette con il segreto industriale che costa e non è facile ottenerlo. I costi di produzione di per sé poco rilevanti e quasi sempre è difficile fare economie di scala perché aumentando le produzioni non diminuiscono i costi. Fino a poco tempo fa si cercava l’enzima giusto per risolvere il problema mentre oggi si parte dall’enzima per applicarlo a un problema già esistente perché fare il contrario è davvero difficile. Oggi si tende anche a modificare gli enzimi per renderli più adatti a un particolare problema/applicazione (maggiore termostabilità di un enzima tramite ingegnerizzazione) ma non si parte mai da zero.

Fonti di proteine ed enzimi

Le fonti proteiche possono essere animali, vegetali, microrganismi in quanto si tratta di molecole biologiche; anche gli insetti vengono utilizzati e stanno assumendo più interesse. Ci sono diverse fonti proteiche e i criteri di scelta sono tanti e ampi:

• Un criterio può essere collegato alle caratteristiche intrinseche della proteina; se serve una caseina o del glutine si estrae dal latte e dai cereali e quindi si ha una fonte obbligata, intrinseca anche se le caseine possono essere estratte da diverse specie animali (vaccina, bufalo, ovina, caprina) e le diverse caseine hanno diverse proprietà tecnologiche. Per altre proteine la fonte è più variabile come nel caso degli enzimi: una cellulasi può essere prodotta da microrganismi diversi e queste cellulasi hanno uguale attività catalitica ma diverse proprietà come la stabilità al pH o alla temperatura e in questo caso si selezionano diverse fonti per avere le proprietà più idonee allo scopo.
• Un altro criterio è la destinazione d’uso: nei prodotti alimentari la proteina deve essere sicura e food grade e di conseguenza anche la fonte.
• Un altro aspetto sono le considerazioni economiche in quanto minore è il costo meglio è; la fonte animale è costituita da scarti di lavorazione e di macellazione per estrarre le proteine, con le fonti microbiche per far crescere il microrganismo si ha un terreno che se costituito da scarti porta a un vantaggio economico.
• La reperibilità del materiale è fondamentale perché non tutti i materiali sono ugualmente reperibili; alcuni sono prodotti stagionali e molte coltivazioni vegetali sono fatte in paesi non stabili dal punto di vista politico e quindi i rapporti commerciali non sono sicuri.
• Come ultimo aspetto pratico si hanno le tecnologie presenti in azienda: se bisogna comprare una materia prima da cui estrarre la proteina/enzima bisogna valutare se in azienda si hanno le tecnologie idonee per utilizzare la fonte.

Le principali fonti animali

Le proteine di origine animale sono ricavate principalmente dal latte o da organi che sono sottoprodotti della lavorazione; dal latte si possono avere proteine bulk come la caseina e le sieroproteine che hanno delle proprietà diverse. La caseina è definita una proteina priva di struttura, IDP (proteine intrinsecamente disordinate) in quanto nel latte lo scopo biologico è far crescere il neonato, è la fonte proteica che deve essere facilmente digeribile e attaccabile dagli enzimi; le sieroproteine hanno una struttura precisa e proprietà funzionali diverse. Ci sono anche proteine fine con più interessante attività biologica come la lattoferrina. Nel caso degli organi, le proteine più interessanti sono enzimi; per esempio, si possono estrarre delle proteasi che vengono utilizzate per la coagulazione nella produzione di formaggi. La fonte proteica animale è la meno interessante.

Le proteine di fonte vegetale

Più interessanti e varie sono le proteine di fonte vegetale: si distinguono le proteine di riserva presenti nel seme e le proteine dei tessuti (floema); le proteine del glutine nei semi hanno una funzione di riserva per la germinazione. I due principali vegetali da cui si possono estrarre le proteine di riserva sono cereali e legumi che contengono proteine molto diverse: si tiene conto della classificazione di Osborne delle proteine dei cereali che è basata sulla solubilità che hanno queste diverse proteine. Le proteine dei cereali sono divise in proteine citoplasmatiche e proteine di riserva: le proteine citoplasmatiche sono del citosol che hanno funzione biologica all’interno delle cellule, mentre quelle di riserva servono per lo sviluppo della pianta in germinazione. Le citoplasmatiche sono distinte in albumine e globuline, invece le proteine di riserva sono distinte in gliadine e glutenine per il frumento. Per distinguere tra queste si considera la solubilità: le albumine sono solubili in acqua pura, ovvero in acqua dove non si ha forza ionica; le globuline sono solubili in soluzioni saline diluite e quindi si ha un minimo di forza ionica; le gliadine sono solubili in alcol al 70%, quindi in soluzioni più idrofobiche; le glutenine sono solubili in acidi e basi diluiti.