Biotecnologie vegetali

Screening (o vaglio) delle genoteche

Fare lo screening di una genoteca (di qualunque tipo essa sia), vuol dire cercare una specifica sequenza tra tutti i cloni disponibili.

Per fare lo screening viene usata una sonda di DNA complementare alla sequenza di DNA che si sta cercando. Nel caso delle genoteche di espressione si può usare un anticorpo primario contro la proteina codificata dal gene che si sta cercando.

Step per lo screening di una genoteca:

• Fare le "replica plates" (trasferire le colonie su filtro)
• Ibridare con la sonda (di DNA o anticorpo)
• Fare la rivelazione

Come si progetta una sonda di DNA

Se nelle banche dati è presente una sequenza simile a quella che si sta cercando si costruisce una sonda identica e si usano condizioni di bassa-media stringenza, secondo il grado di similarità.

Se la sequenza nota appartiene a una specie diversa di quella di cui si sta analizzando la genoteca, la sonda viene costruita cambiando le triplette secondo il

«codon usage» della specie di interesse, per poteraumentare le condizioni di stringenza e dare origine a meno falsi positivi. Il codon usage è la preferenzavarie specie nell’usaredelle alcuni codoni per esprimere un aminoacido.Negli umani l’alanina è codificata preferenzialmente da GCC, nei lieviti da GCT. Quindi se io sto studiando ilfare una sonda, se c’è l’alaninalievito e ho come riferimento soltanto la sequenza del genoma umano e devometterò GCT non GCC.Se non è nota la sequenza di DNA del gene che stiamo cercando, ma è noto il prodotto proteico, si puòrisalire alla sequenza genica. Si fa o utilizzando una genoteca di espressione isolando tutti gli mRNA in unacerta situazione, facciamo i cDNA, li mettiamo in vettori di espressone, facciamo una genoteca e usiamo unanticorpo contro quella proteina, oppure si usa una genoteca genomica.Poiché una proteina è fatta da aa, possiamo

ricombinazione e più quei caratteri che sto studiando sono vicini nel DNA. Quindi per poter fare facilmente delle mappe ci vuole una f2 numerosissima.

Deve essere facilmente trasformabile per poter studiare la funzione dei geni tramite il silenziamento e l'espressione. '70 che c'era similitudine tra i DNA. Jaques Monod aveva intuito già negli anni degli organismi perché un'origine abbiamo comune, per cui in teoria sequenziare E.coli potrebbe darci informazioni sul genoma dell'elefante.

Per studiare il regno delle Piante è stata scelta la pianta modello Arabidopsis thaliana (fam. Cruciferae). È una pianta totalmente insignificante dal punto di vista agrario, ma ha delle caratteristiche che ne fanno un buon modello. La Frittillaria ha 40 volte più DNA dell'uomo. Questo intanto fa capire quanto non ci sia correlazione tra dimensione del genoma e complessità dell'organismo (paradosso del valore c).

Il DNA di

Arabidopsis è circa 1000 volte più piccolo di quello di Frittillaria anche se hanno caratteristiche morfologiche e riproduttive simili e presentano lo stesso numero di geni. Perché è stata scelta l'Arabidopsis thaliana:

• Ha un DNA dell'ordine di 10^6 bp organizzato in 5 coppie di cromosomi (2n=10)
• Presenta una distribuzione molto ampia e adattabilità a diverse condizioni, in quanto si trova praticamente dappertutto, in tutte le regioni a clima temperato
• È piccola, quindi necessita di poco spazio per la crescita sperimentale
• Dato che un ciclo biologico completo dura circa 6 settimane, si possono ottenere tante generazioni all'anno
• Fa molti semi (quindi mappe genetiche attendibili)
• Si trasforma facilmente con Agrobacterium tumefaciens (quindi è facile vedere a cosa servono i geni che vengono identificati)

Le informazioni ottenute dalla conoscenza dei genomi, sia per l'uomo che per Arabidopsis, sono state...

Identificate una serie di open reading frame e circa il 40% di questi non hanno una funzione conosciuta. Il paradosso dei risultati ottenuti dai progetti genoma è che conosciamo la sequenza di molto più di quello che sappiamo come funziona. Nel caso di Arabidopsis ci sono circa 27.000 ORF, quindi si presume ci siano circa 27.000 geni, di cui 6.000 geni con funzione nota, 3.000 funzione certa ma non identificata, 10.000 con funzione non dimostrata e 5.000 con funzione ipotetica. Tra questi il 40-50% hanno omologia con geni umani. Per quanto riguarda il genoma umano sono stati identificati circa 22.287 geni che codificano per proteine mentre gli altri codificano per rRNA, tRNA, snRNA, miRNA. Anche nel caso dell'uomo circa il 40% dei geni ha funzione sconosciuta. Nell'uomo c'è un gene ogni 145 kb quindi sono sparsi sul genoma (ma ci sono anche le famiglie geniche che costituiscono dei cluster). Un gene umano medio è fatto da 27.000 bp (perché ci sono

Il genoma umano è composto da circa 3 miliardi di basi e contiene circa 20.000-25.000 geni. Il genoma è organizzato in unità chiamate cromosomi, che sono costituiti da DNA e proteine. Ogni cromosoma contiene molteplici geni, che sono le unità fondamentali dell'ereditarietà.

Il genoma umano è composto da due tipi di sequenze: il DNA codificante e il DNA non codificante. Il DNA codificante contiene i geni, che sono responsabili della produzione di proteine. Il DNA non codificante, invece, svolge altre funzioni all'interno del genoma.

Il genoma umano è anche composto da sequenze ripetute, che sono sequenze di DNA che si ripetono molte volte all'interno del genoma. Queste sequenze ripetute possono essere classificate in due categorie: sequenze ripetute in tandem e sequenze ripetute intersperse.

Le sequenze ripetute in tandem sono sequenze di DNA che si ripetono una di seguito all'altra all'interno del genoma. Queste sequenze possono essere costituite da poche unità ripetute o da migliaia di unità ripetute. Le sequenze ripetute in tandem sono spesso associate a regioni del genoma che sono coinvolte nella regolazione dell'espressione genica.

Le sequenze ripetute intersperse sono sequenze di DNA che sono sparse in tutto il genoma. Queste sequenze possono essere costituite da poche unità ripetute o da migliaia di unità ripetute. Le sequenze ripetute intersperse sono spesso associate a regioni del genoma che sono coinvolte nella struttura e nella funzione dei cromosomi.

Le dimensioni fisiche del genoma si misurano in coppie di basi e corrispondono alle dimensioni reali del genoma.

Le dimensioni genetiche del genoma si misurano in centimorgan (cM) e dipendono dalla frequenza di ricombinazione. L'1% di ricombinazione è uguale a 1 cM. La dimensione genetica dà orientativamente idea di quanto sia la dimensione fisica.

Altre informazioni che abbiamo avuto confrontando i diversi genomi:

• La densità genica varia di molto tra le specie eucariotiche
• La densità genica tende a diminuire nei genomi più complessi
• I genomi grandi contengono: più DNA ripetuto, più introni e più grandi, più regioni intergeniche; quindi contengono più DNA non codificante.

Il confronto tra genomi ha permesso di definire la sintenia, ovvero la presenza degli stessi geni su cromosomi "simili" (dove è presente un gran numero di geni ortologhi): se

gene A e gene B stanno vicini sul cromosoma di un organismo, è molto probabile che lo saranno anche in un altro organismo. Ciò riflette l'origine comune degli organismi, ed è particolarmente evidente per quei geni che evolvono lentamente (non per le regioni con DNA ripetuto).

GENOMICA

Per genomica non si intende lo studio dei geni ma lo studio dei genomi intesi sia dal punto di vista strutturale che funzionale.

La definizione di genomica: è la caratterizzazione molecolare e funzionale di genomi interi (mappatura, sequenziamento, analisi funzionale del genoma). Permette di comprendere come gli organismi sono fatti, come si sviluppano e funzionano.

Genomica strutturale: permette la caratterizzazione della natura fisica dei genomi interi. Ha come obiettivi la costruzione di mappe genetiche e fisiche di un certo organismo e quindi il sequenziamento completo del genoma.

La genomica strutturale è preliminare alla genomica funzionale.

Genomi