Biotecnologie vegetali

Clonaggio genico

Il clonaggio genico (o, più in generale, di porzioni di DNA) consiste nell'isolare un gene (o comunque una porzione di DNA non necessariamente corrispondente a un gene), introdurlo in un vettore, che, a sua volta, all'interno di un organismo piccolo (ospite), in modo che sia possibile "conservare" e verrà introdotto "moltiplicare" (clonare) il segmento di DNA in oggetto, attraverso la moltiplicazione dell'ospite stesso. Per poter clonare ci si avvale di vari mezzi molecolari, tra cui nucleasi ed enzimi di modificazione.

Nucleasi

Sono enzimi in grado di rompere la molecola di acido nucleico in modo più o meno specifico. Alcune tagliano solo l’RNA (RNAsi), altre solo il DNA (endonucleasi di restrizione), altre non hanno specificità; alcune agiscono solo su filamenti singoli, altre su doppi filamenti. Alcune nucleasi sono specifiche per il punto di taglio: le esonucleasi agiscono solo sulle estremità, le endonucleasi tagliano solo legami fosfodiesterici interni.

Endonucleasi di restrizione

Le endonucleasi di restrizione sono enzimi batterici che riconoscono brevi sequenze di DNA e svolgono naturalmente una funzione protettiva, in quanto degradano il DNA esogeno. Sono di tre tipi:

• Tipi I e III: Riconoscono un sito specifico ma tagliano lontano dal sito di riconoscimento. Svolgono anche reazioni di metilazione (di protezione del DNA endogeno).
• Tipo II: Riconoscono brevi sequenze specifiche e tagliano all'interno di quella sequenza bersaglio o ad una breve e precisa distanza da essa. Tutte riconoscono sequenze palindromiche (che presentano un asse di simmetria binario: se letti da sinistra o da destra hanno la stessa sequenza).

Gli enzimi che riconoscono sequenze palindromiche danno origine a due tipi di estremità: piatte o nette (blunt) e appiccicose (sticky). Nette se le endonucleasi di restrizione producono un semplice taglio a doppio filamento nel mezzo della sequenza di riconoscimento; appiccicose se i due filamenti di DNA non vengono tagliati esattamente nella stessa posizione, ma il taglio è sfalsato di due o quattro nucleotidi, così che i frammenti che ne risultano hanno brevi sporgenze a singolo filamento ad ogni estremità, che vengono dette estremità appiccicose perché l’appaiamento delle loro basi può di nuovo incollare la molecola. Le endonucleasi di restrizione sono importanti perché permettono di creare DNA ricombinante tagliando DNA proveniente da organismi diversi e riformando una molecola che sarà un ibrido tra questi diversi organismi.

Enzimi di modificazione

Nucleasi S1: o mung bean, enzima estratto dalla muffa Aspergillus onyzae che riconosce e degrada specificatamente il DNA a singolo filamento. Può essere utile se ho DNA con estremità appiccicose ma mi serve ad estremità piatte.

DNA ligasi: riforma il legame fosfodiesterico tra due molecole di DNA.

DNA polimerasi: sintetizza un nuovo stampo di DNA complementare a uno stampo esistente. Esistono più tipi di DNA polimerasi:

• DNA polimerasi I: si lega a una breve regione a singolo filamento (nick) in una molecola di DNA a doppio filamento e sintetizza un filamento complementare nuovo, degradando il filamento esistente man mano che procede. Questo enzima ha quindi una doppia attività, polimerasica e nucleasica. L’attività nucleasica è contenuta nei primi 323 aminoacidi del polipeptide, così che la rimozione di questo pezzo lasci un enzima modificato che mantiene la funzione polimerasica, ma è incapace di degradare il DNA. Questo enzima modificato, chiamato frammento di Klenow, può ancora sintetizzare un filamento complementare di DNA su uno stampo a singolo filamento, ma non avendo più funzione nucleasica non può continuare la sintesi una volta riempito il nick.
• Taq DNA polimerasi: è un enzima termostabile, quindi, resiste alla denaturazione dovuta al trattamento con il calore. Questo la rende adatta alla PCR perché, se non fosse termostabile si inattiverebbe alla temperatura di 94°C.
• Trascrittasi inversa: è un enzima di moltiplicazione presente nei retrovirus che in natura lo utilizzano per retro trascrivere l’RNA (il loro acido nucleico) in DNA che viene chiamato cDNA o DNA copia. Questo cDNA, in natura, è quello che viene inserito fisicamente all'interno del cromosoma del batterio in cui rimane costituendo il profago, e poi viene trascritto utilizzando l’apparato di sintesi proteica e quiescente, della trascrizione del batterio. È chiamata anche DNA polimerasi RNA dipendente. È usata in biotecnologia se vogliamo retro trascrivere messaggero. Ci sono i geni di classe II che codificano per proteine e quindi fanno degli mRNA. Nel caso degli eucarioti poi dopo la trascrizione in mRNA viene attaccata una coda di poli adenine che ha diversi scopi, per esempio, quello di stabilizzare l’mRNA. Questa coda di poli A presente negli mRNA eucariotici, può essere usata dal biotecnologo come primer (innesco) per la retro-trascrizione. Se abbiamo un mRNA e usiamo un innesco complementare alla coda di poli A cioè un poli T, questo incomincia, in presenza di trascrittasi inversa, a retro trascrivere questo mRNA che mi dà una singola elica di DNA. Quello che otterremo inizialmente sarà una doppia elica ibrida di RNA e cDNA. Ma a noi serve una doppia elica di DNA quindi dobbiamo eliminare la copia di mRNA e duplicare quella di cDNA. Per farlo si tratta la doppia elica ibrida con una rnasi oppure con un trattamento basico che elimina l’elica di RNA. Otteniamo quindi un cDNA a singola elica. Per ottenere la doppia elica si utilizza la formazione di una forcina: praticamente il cDNA si piega e funziona come un innesco, viene letto come un ossidrile libero pronto per polimerizzare il DNA. Si forma quindi una struttura a doppia elica, tranne nell’area della forcina dove non essendoci appaiamento rimane a singola elica. A questo punto si tratta con una nucleasi S1 che elimina la forcina.

Fosfatasi alcalina: è un enzima di modificazione che rimuove il fosfomonoestere (fosfato) in 5’ o 3’ terminale. La situazione classica di un DNA a doppia elica è il fosfato al 5’ e l’OH al 3’; può capitare, come nella marcatura del DNA, che questo fosfato debba essere sostituito con un fosfomonoestere con fosforo radioattivo per rendere visibile quella molecola di DNA. Togliendo il fosfato al 5’, rimane l’OH al 3’. Questa molecola può essere rimodificata aggiungendo un fosforo modificato, per esempio radioattivo, e questo viene fatto con un altro enzima di modificazione che è la polinucleotide chinasi, il contrario della fosfatasi.

Polinucleotide chinasi: una chinasi è un enzima che fosforila gli ossidrili in 5’ cioè aggiunge gruppi fosfato sui terminali 5’ liberi.

Transferasi terminale: Addiziona deossinucleotidi al termine della catena, per attaccare molecole diverse tra loro creando estremità appiccicose, o per ripristinare il registro di lettura di un certo gene.

Esonucleasi III: Enzima che rimuove i nucleotidi all’estremità 3’. Agisce solo sui doppi filamenti, andando a rimuovere i nucleotidi solo su uno dei due filamenti creando delezioni unidirezionali (dal 3’ al 5’).

Metilasi: Enzima che i batteri usano come proprio sistema di difesa dall’attacco dei batteriofagi. I batteri, infatti, proteggono il loro DNA dall’attacco degli enzimi di restrizione andando a metilare, cioè aggiungere un gruppo metilico alle citosine, gli stessi siti target degli enzimi di restrizione. Serve a proteggere le sequenze dall’attacco degli enzimi di restrizione (c’è una metilasi per ogni enzima di restrizione).

Sistemi ospite-vettore

Il clonaggio è una procedura che serve a moltiplicare il DNA per poterlo caratterizzare. Per caratterizzare qualcosa dobbiamo averne a disposizione una quantità sufficiente. Il clonaggio è quindi il primo passaggio per la caratterizzazione di qualunque tipo di DNA. Richiede sempre un sistema a due componenti che sono un ospite e un vettore che devono essere compatibili. Per clonare un frammento è necessario che l’inserto, il pezzo da clonare, sia messo all’interno di un vettore cioè una molecola che trasporta l’inserto, e deve replicarsi all’interno di una cellula ospite. Un vettore è una molecola di DNA in cui viene inserito il frammento da clonare.

Le caratteristiche di base di un vettore sono:

• Origine di replicazione indipendente dal cromosoma ospite
• Deve essere presente in elevato numero di copie all’interno della cellula ospite
• Avere dei marcatori di selezione che mi permettano di riconoscerlo nelle cellule ricombinanti
• Avere i polylinker, siti unici di clonaggio

Esistono 3 tipi di vettori:

• Di clonaggio: serve a moltiplicare il DNA, sia sequenze codificanti che non codificanti, per poi studiarlo, moltiplicarlo e sequenziarlo.
• Di espressione: permette l’espressione del gene. Per far sì che questo gene si esprima ci sono dei promotori e dei siti di terminazione che permettono l’espressione del gene in una proteina.
• Di integrazione: è un particolare vettore di espressione. Permette di inserire il DNA all’interno di un sistema di espressione che può essere ad esempio il genoma di una pianta. Permette di inserire il DNA estraneo nel genoma di un altro organismo. Sono spesso vettori di espressione perché servono a sfruttare il genoma dell'ospite per replicare e sintetizzare le proteine presenti nel vettore di integrazione. La differenza tra quello di espressione e quello di integrazione è che il primo ha bisogno di una cellula ospite, il secondo più che una cellula, ha bisogno di un organismo e viene proprio fisicamente inserito nel genoma dell’ospite.

Tipi di vettori di clonaggio

I vettori di clonaggio si distinguono per le dimensioni dell’inserto che vanno da poche basi a milioni di paia di basi:

• Plasmidi 0-20 kb
• Fagi 20-45 kb
• Cosmidi 45-100 kb
• BAC (cromosomi batterici artificiali) 300-500 kb
• YAC (cromosomi artificiali di lievito) 0.5-1 Mb
• MAC (cromosomi artificiali di mammifero) più di 1 Mb

Un gene eucariotico, senza introni, è dell’ordine di grandezza di 1000-2000 pb quindi per clonarlo va bene il plasmide. Con gli introni si può arrivare anche a decine di migliaia di pb, in quel caso posso usare i plasmidi o i fagi.

Plasmidi

Molecole circolari di DNA a doppio filamento normalmente presenti nella cellula batterica che portano caratteristiche come fattori di resistenza agli antibiotici o fattori di coniugazione e si riproducono autonomamente nella cellula batterica. La caratteristica della resistenza agli antibiotici è utilizzata in laboratorio come marcatore di selezione, per assicurarci che i batteri di una coltura contengano un particolare plasmide. I plasmidi hanno almeno una sequenza di DNA che agisce da origine di replicazione, così da potersi replicare in modo indipendente dal cromosoma della cellula ospite. Alcuni tipi di plasmidi, gli episomi, sono anche capaci di replicarsi inserendosi nel cromosoma batterico. Un plasmide viene rappresentato di solito come un doppio cerchio, in cui vengono indicati: l’ori, il marcatore di selezione, e il polylinker che è la regione in cui può essere inserito il DNA. Il polylinker spesso comprende anche il marcatore di selezione. Un plasmide naturale ha dimensione di qualche migliaio di nucleotidi, circa 3000-4000. È stato visto però che più piccoli sono questi plasmidi, più si moltiplicano all’interno della cellula ospite. Quindi attualmente vengono elaborati dei plasmidi che sono sufficientemente piccoli da contenere il frammento che ci interessa e che si moltiplicano molto nella cellula. Uno dei primi plasmidi costruiti è il pBR322 che conteneva al massimo 15-20 copie (cioè si riproduceva al massimo 15-20 volte nella cellula); il pGEM 300-400 copie; pUC 500-700 copie; pT2 >1000. Nei primi plasmidi, i siti di restrizione erano sparsi per tutto il plasmide, attualmente si usano i polylinker che sono sequenze sintetiche che corrispondono a tutti i siti di restrizione unici, che si vogliono inserire in quel vettore.

Caratteristiche necessarie all'ospite

• Fornire al vettore tutto ciò che gli serve per replicarsi il più possibile; quindi non deve contenere elementi che inibiscano la replicazione del vettore
• Deve avere dei marcatori diversi da quelli del plasmide

Inserimento di DNA ricombinante in un vettore plasmidico

Come si inserisce un pezzo di DNA ricombinante in un vettore plasmidico: Prima di tutto bisogna pipettare la quantità richiesta di DNA in una provetta. L’altro componente della reazione è l’endonucleasi di restrizione. Prima di aggiungere l’endonucleasi però bisogna modificare la soluzione contenente il DNA in modo da fare rendere al massimo l’enzima: la maggior parte delle endonucleasi di restrizione funziona bene a 37°C e pH 7,4; è consigliato anche aggiungere un agente riducente come il DTT che stabilizza l’enzima e ne impedisce l’attivazione. Adesso si può aggiungere l’endonucleasi di restrizione. In un'altra provetta si taglia il plasmide con lo stesso tipo di endonucleasi di restrizione, per renderlo lineare. I plasmidi tagliati e il DNA vengono mischiati insieme, così si legheranno formando plasmidi ricombinanti. Vengono aggiunti i batteri alla provetta di plasmidi ricombinanti e si usa l’elettroporazione che, con impulsi veloci di elettricità, crea piccoli pori nella parete cellulare batterica, così che i plasmidi ricombinanti sono in grado di entrare nei batteri. I batteri trasformati sono considerati transgenici. Normalmente i plasmidi contengono geni per la resistenza agli antibiotici, quindi rendono i batteri anch’essi resistenti. Ma non tutti i batteri assumono il plasmide in provetta e diventano transgenici. Dopo l’attivazione, infatti, viene fatta una selezione in base al marcatore per distinguere quali batteri hanno assunto il plasmide e quali no: i batteri vengono messi su una piastra contenente l’antibiotico, quelli non trasformati moriranno, quelli trasformati cresceranno e moltiplicheranno creando colonie. L’intera popolazione di cellule trasformate rappresenta una libreria genomica.

Batteriofagi

Vettori che vengono usati per clonare frammenti superiori ai 20 mila e inferiori a 50 mila nucleotidi. I virus non sono in grado di autoreplicarsi, ma infettano cellule ospiti delle quali utilizzano i sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi. Tra i vari virus, i batteriofagi (o fagi) sono usati per il clonaggio genico perché hanno caratteristiche che li rendono ideali a questo scopo. Il fago più usato in biotecnologia è il fago lambda: è un virus a DNA contenuto in una testa proteica la cui adesione alle cellule avviene tramite altre particelle proteiche della coda che ha funzione di riconoscimento per i recettori presenti sul batterio. Il ciclo infettivo dei fagi si compone di tre fasi principali:

• Il virus riconosce il batterio e si attacca riversando il proprio DNA all’interno della cellula ospite.
• Il DNA fagico viene replicato e indirizza la sintesi proteica del batterio per produrre i propri geni. Si cominciano quindi a costruire le particelle proteiche necessarie alla costruzione del virus.
• Si formano nuove particelle virali che rompono la cellula.

I fagi con ciclo litico completano questo processo in una ventina di minuti.

Struttura del fago lambda

Ha una struttura testa-coda: il DNA è contenuto nella testa icosaedrica, avvolta da un capside proteico; la coda ha funzione di riconoscimento per i recettori presenti sul batterio. Il DNA del fago lambda è lungo circa 50 Kb. Ha delle regioni contenenti dei geni per la ricostruzione dell’assemblaggio dei capsidi e virus e altri geni che servono per altri processi vitali del virus come l’integrazione e l’escissione o la lisi della cellula ospite. Ha anche una regione centrale che non è essenziale. Questo genoma è stato ingegnerizzato in modo da poter togliere tutto quello che non è essenziale per il virus e sostituirlo con quello che noi dobbiamo clonare. Quindi alcune regioni del genoma possono essere modificate e sostituite da DNA esogeno o eliminate senza modificare la capacità di lambda di infettare l’ospite e assemblare nuovi virioni.

Il DNA virale è una molecola che in alcuni stadi vitali è circolare, in altri lineare. È lineare quando è all’interno del fago maturo, ma quando deve essere immesso nel batterio si circolarizza. La circolarità è mantenuta da 12 bp che stanno alle estremità coesive (cos). Quando il virus è completo il DNA è lineare; quando il virus deve far penetrare il proprio DNA all’interno della cellula ospite, le estremità coesive si appiccicano tra loro e il DNA circolarizza. A questo punto il virus inizia a replicarsi dando origine a un concatamero: da una singola molecola di DNA vengono formate migliaia di copie del DNA virale.

Clonaggio di DNA nel fago lambda

Come fanno i virus neo nati a inglobare il genoma? C’è un gene nel virus che codifica per una proteina che si chiama terminasi in grado di riconoscere due siti cos e tagliare quando questi sono distanziati tra loro da circa 50 kb. Quindi ogni nuova testa viene riempita con unità da 50 kb, successivamente viene aggiunta la coda. Attraverso i fagi è possibile clonare frammenti di dimensioni che vanno da 20 kb a 50 kb. Se metto frammenti più piccoli di 20kb, la terminasi non riconosce i due siti cos; se sono più grandi di 50 kb la stessa cosa.