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Biotecnologie Microbiche Vegetali

Argomenti trattati:
Ruolo dei microrganismi nella formazione del suolo, mantenimento della fertilità e ciclo della sostanza organica.

Microbiota del suolo, rizosfera, fillosfera. Associazioni tra microrganismi e piante: simbiosi micorriziche e attinorriziche, azotofissazione e simbiosi azotofissatrici.

Plant Growth Promoting Bacteria: i) meccanismi microbici di promozione... Vedi di più

Esame di Biotecnologie microbiche vegetali docente Prof. E. Crotti

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APPLICAZIONE:

- Utili in applicazioni agroforestali, ripristino ambientale, ingegneria naturalistica

- Contributo alla fertilità dei suoli: fonte di sostanza lignocellulosica a basso C/N

- Incrementano la crescita fino all’80% di piante non attinorriziche (diametro e altezza): le loro foglie

sono ricche in N e favoriscono la nutrizione azotata di piante consociate in suoli carenti di N

- Impiegate con successo per favorire la crescita di “latifoglie nobili” negli impianti di alboricoltura

da legno

[2] MICORRIZIE

- Il 90% piante terrestri stabilisce a livello radicale SIMBIOSI MUTUALISTICHE con FUNGHI MICORRIZICI

- I funghi colonizzano i tessuti della radice formando una rete ifale molto più estesa di quella radicale,

traslocando alla radice acqua e nutrienti minerali

➔TRASFERIMENTO

SIMBIOSI MICORRIZICA BIDIREZIONALE DI NUTRIENTI:

PIANTE FUNGHI (micorrizici)

forniscono al fungo zuccheri prodotti della sono simbionti obbligati

fotosintesi assorbono i nutrienti inorganici dal suolo

Le piante micorrizate hanno una crescita più producono fattori di crescita che inducono

rigogliosa (apporto di nutrienti) ed una maggiore alterazioni morfologiche nelle radici stimolando la

tolleranza a stress biotici ed abiotici, ma non formazione dello stato micorrizico.

dipendono dal fungo

WOOD WIDE WEB

- Le ife fungine interagiscono con la radice e contemporaneamente esplorano il suolo

- Piante MICOETEROTROFE non sono fotosintetiche e dipendono dal fungo per la nutrizione

- Connessioni ifali tra radici di piante diverse (della stessa o di diverse specie)

- Trasferimento di nutrienti organici ed inorganici da pianta a pianta attraverso il fungo secondo un

gradiente di concentrazione

[3] BIODIVERSITA’ DELLE MICORRIZIE

ECTOMICORRIZIE

- 5000 specie, basidiomiceti ed ascomiceti. Diffuse in ecos forestali con accumulo di sostanza organica

- Il fungo cresce attorno alle radici assorbenti formando un mantello di ife (MICOCLENA) avvolgendo

interamente gli apici radicali

- All’interno delle radici il fungo penetra nel tessuto corticale INTERCELLULARE formando il RETICOLO di

HARTIG

- All’esterno delle radici il fungo cresce in strutture rizomorfe o cordoni miceliari

- I funghi necessitano della pianta ospite per completare il ciclo vitale e produrre il corpo fruttifero

FUNGHI GENERALISTI: si associano con un alto numero di specie vegetali, abbondanti nei suoli giovani

FUNGHI SPECIALISTI: si associano con una o poche specie, su alberi maturi 18

ECTOENDOMICORRIZIE

- Ascomiceti e basidiomiceti. Stessi caratteri morfologici delle ectomicorrize (micoclena, reticolo…)

- Il fungo simbionte penetra all’interno delle cellule del primo strato corticale

- In piantine giovani che ospitano ectomicorrize (Pinus, Larix) e in alcune specie di Ericales

ENDOMICORRIZE

- Sono un numero inferiore di specie rispetto alle ectomicorrize. Ascomiceti e basidiomiceti

- Il fungo simbionte penetra all’interno delle cellule radicali della pianta ospite

Endomicorrizie ERICOIDI: Micorriza delle Ericales, terreni acidi tundre e brughiere. Il fungo arriva a

colonizzare l’80% del tessuto radicale

Endomicorrizie DELLE ORCHIDEE: I semi di molte specie delle Orchidaceae necessitano della presenza del

fungo che rifornisce il germoglio di zuccheri perché il seme è privo di sostanze di riserva. Il fungo è

necessario nelle fasi eterotrofe della pianta o in specie aclorofilliche

ENDOMICORRIZE ARBUSCOLARI

- Micorrize + diffuse in natura, colonizzano l’80% delle specie vegetali. Colonizzano le più importanti

piante agrarie

- I funghi MA sono BIOTROFI OBBLIGATI: non possono svilupparsi in assenza della pianta ospite

- Non sono ospite-specifici. Dominano nelle comunità erbacee ed arboree in terreni minerali a basse

latitudini

- Il P (fosforo) è il principale nutriente minerale traslocato alla pianta

FUNGHI MICORRIZICI ARBUSCOLARI: BIODIVERSITÀ

La tassonomia dei funghi MA si basa principalmente sui caratteri morfologici:

• forma, dimensioni, colore

• struttura della parete e dell’ifa di attacco

• presenza di sporocarpo

• modo di germinazione e infezione

- L’identificazione tassonomica non è sufficiente per descrivere la grande diversità funzionale

- Ceppi della stessa specie hanno reazioni diverse nei confronti dei parametri ambientali, influenzando

di conseguenza la capacità di colonizzazione, il ciclo vitale, l’efficienza di sporulazione

- I funghi MA sono simbionti obbligati, quindi sono moltiplicati in serra assieme alle piante ospiti in

condizioni colturali diverse da quelle del luogo di origine 19

PGRP [PLANT GROWTH PROMOTING RHIZOBACTERIA]

[1] INTRODUZIONE

- Microrganismi che colonizzano l’apparato radicale della pianta e ne promuovono la crescita

- Interazioni: aspecifiche/simbiotiche/dirette(approvvigionamento nutrienti, produzione di fitormoni)

indirette (attività di controllo nei confronti di fitopatogeni)

PERCHÉ SONO IMPORTANTI

- I fertilizzanti chimici sono costosi e richiedono processi produttivi di tipo industriale (inquinamento)

- L‘uso prolungato di fertilizzanti comporta inquinamento del suoli ed eutrofizzazione delle acque

- L‘uso di prodotti biologici per l‘agricoltura é incentivata a livello mondiale (anche UE)

TIPOLOGIE

PGPR INTRACELLULARI Vivono all’interno delle cellule della radice in strutture specializzate (i noduli

radicali) = RIZOBATTERI (RIZOBI) azotofissatori simbionti

PGPR EXTRACELLULARI Vivono nel suolo vicino alla radice (rizosfera) utilizzando i metaboliti essudati dalla

pianta come fonti di N e C . Colonizzano il rizoplano (superficie della radice)

PGPR ENDOFITI In grado di entrare nella radice attraverso la corteccia radicale negli spazi tra le cellule,

entrare nel sistema vascolare e quindi colonizzare gli altri organi della pianta.

LA ENDOSFERA:

- Le parti interne della pianta (l‘interno delle radici é a volte definito endoriza)

- Una penetrazione passiva dell‘endoderma radicale é possibile attraverso fessurazioni naturali o

attraverso co-migrazione con patogeni vegetali

- La risposta immunitaria della pianta avviene ma ad un livello inferiore rispetto a quella verso i patogeni

- Il microbiota endofitico é molto variabile e a bassa diversitá

- La pianta agisce come “filtro“ di microorganismi del suolo, selezionando quelli piú idonei e competenti

Gli endofiti possono usare i vasi dello xilema come “autostrade“ per diffondersi nella parte aerea della

pianta, fino anche a frutti e fiori

Gli endofiti sono considerati come potenziali inoculi microbici da utilizzare nelle applicazioni

biotecnologiche

[2] COMPETENZA

La prima caratteristica che un PGPR deve avere è la capacità di colonizzare la superficie radicale in

espansione, essere cioè RIZOSFERA COMPETENTE

- La prima risposta dei microrganismi rizosferici alla rizodeposizione è l’attivazione del processo di

colonizzazione radicale ➔

- Diverse specie hanno diversi profili di essudazione selezionano diverse comunità PGPR

- PGPR competenti rispondono agli stimoli delle rizodeposizioni, raggiungono il rizoplano e crescono

sulla radice in maniera competitiva rispetto agli altri

FATTORI CHE REGOLANO LA COMPETENZA

- LIPOPOLISACCARIDI DI SUPERFICIE (LPS): riconoscimento dell’ospite, processi di adesione alla radice

- FATTORI DI MOBILITÀ: ciglia, fimbrie, flagelli sostengono la risposta CHEMIOTATTICA

- SWITCHING FENOTIPICO: cambiamenti morfologici sulla superficie cellulare (antigeni di superficie,

LPS, perdita appendici) nel passaggio dal suolo libero al rizoplano 20

- SISTEMI DI CAPTAZIONE SEGNALI, risposta agli stress

- AUXOTROFIA limita l’efficienza di colonizzazione: gli essudati radicali sono in concentrazione troppo

bassa per complementare l’auxotrofia

[3] MECCANISMI DIRETTI DI PROMOZIONE DELLA CRESCITA (PAG 24 PGR)

BIOFERTILIZZANTI migliorano l’acquisizione dei nutrienti (N, P, Fe)

BIOFERTILIZZANTI: preparazioni contenenti 1 o + microrganismi vitali che fungono da parziali sostituti della

fertilizzazione chimica. Quando applicati ai semi, piante, suoli, colonizzano la rizosfera o la fillosfera o

l’interno della pianta e ne promuovono la crescita.

• SOLUBILIZZAZIONE DEL FOSFATO

- P è relativamente abbondante nei suoli, ma è uno dei principali nutrienti limitanti la crescita

- È principalmente presente in forma INSOLUBILE, non biodisponibile: fosfati inorganici (Sali di Ca, Al…) o

organici (fitati, fosfoesteri, inositolo)

- La SOLUBILIZZAZIONE DEL P è uno dei principali e più comuni meccanismi di promozione della crescita

- MECCANISMI GENERALIZZATI: la produzione di acidi organici (acetato, lattato, ossalato, tartrato,

succinato, gluconato) acidificano l’intorno cellulare con rilascio di fosfati per sostituzione protonica

- MECCANISMI SPECIFICI: mineralizzazione di P organico attraverso reazioni enzimatiche catalizzate da

FOSFATASI ACIDE e FITASI

- Solubilizzatori P: Enterobacter, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Bradyrhizobium

• PRODUZIONE DI SIDEROFORI

- le piante sono in grado di assumere solo ferro ferrico (Fe3+) producono composti organici solubili

(chelanti e fitosiderofori) che legano Fe3+ e lo mantengono in soluzione

- Alcuni PGP (pseudomonadi) producono siderofori che formano complessi con Fe3+

- Il ferro chelato dai siderofori batterici può essere assunto anche dalle piante

BIOSTIMOLATORI producono fitormoni, diretti induttori della crescita

• PRODUZIONE DI FITORMONI

- I fitormoni prodotti dai microrganismi possono influenzare in maniera significativa la crescita e lo

sviluppo vegetale sommandosi a quelli prodotti dalla pianta e alterandone gli equilibri

- I fitormoni hanno principalmente azione sulla MORFOGENESI RADICALE: iperproliferazione di peli

radicali e radici laterali con conseguente aumento dell’assorbimento

- La produzione di fitormoni è una caratteristica comune nei fitopatogeni

- I fitormoni sono molecole segnale per i microrganismi: spesso prodotti da comunità microbiche e

non da colture pure

• ACIDO ABSCISSICO:

- Nelle piante promuove filloptosi e invecchiamento. Prodotto da alcuni fitopatogeni

- Molecola segnale che regola processi positivi durante la nodulazione tra rizobi e leguminose

- Nei microrganismi: aumenta l’attività della nitrogenasi in Azotobacter chroococcum e Nostoc

muscorum 21

• ETILENE

- Nelle piante è un inibitore della crescita, promuove la filloptosi, accelera la maturazione dei frutti,

rallenta l’estensione cellulare, disturba il geotropismo. Prodotto in condizioni di stress.

- Prodotto da numerosi batteri e funghi fitopatogeni ( Pseudomonas syringae , Ralstonia

solanacearum, Botrytis cinerea

• AUXINE:

- Nelle piante sono responsabili di divisione, estensione, differenziazione. Stimolano germinazione,

formazione di xilema, radici, fioritura, fotosintesi

- L’acido indolacetico (IAA) è la molecola più importante ed attiva

- Nelle piante è prodotto per deaminazione di triptofano, nei batteri tramite diverse reazioni, sempre

a partire dal triptofano

- Batteri e funghi rizosferici sono tra i più importanti produttori di IAA

- Alte concentrazioni di IAA nella rizosfera stimolano la proliferazione radicale (nutrizione, protezione

da stress idrico)

- Effetto negativo: induce la sintesi di ACC (acido 1-amminociclopropano-1carbossilico), precursore

dell’etilene

- Nei microrganismi: le auxine sono molecole segnale che stimolano crescita, azotofissazione e

resistenza agli stress ( Rhizobum, Azospirillum, Bacillus, Nostoc, Saccharomyces)

• GIBBERELLINE

- Nelle piante regolano divisione e allungamento, sintesi di membrane ed enzimi, fioritura

- Molti funghi (anche patogeni), batteri e cianobatteri producono gibberelline a partire dall’acetato

- Nei microrganismi: promuovono crescita, azotofissazione e sviluppo in batteri ( Azotobacter,

Pseudomonas, Lactobacillus ) e cianobatteri ( Anabaena )

• CITOCHININE

- Stimolano nelle piante la divisione cellulare, regolano la sintesi proteica, attivano la germinazione,

incrementano la resistenza agli stress

- Molti microrganismi rizosferici producono citochinine ( Rhizobium, Arthrobacter, Bacillus,

Pseudomonas , streptomiceti). Prodotte da alcuni funghi fitopatogen

- Nei microrganismi: stimolano sviluppo ed azotofissazione, inducono la sintesi di antibiotici, enzimi,

aminoacidi

PGPR E AUMENTO DELLA RESISTENZA AGLI STRESS ABIOTICI 22

[4] MECCANISMI IDIRETTI DI PROMOZIONE DELLA CRESCITA (52)

- Molti PGPR stimolano la crescita delle piante indirettamente, proteggendole da agenti patogeni come

batteri, funghi e nematodi

- CONTROLLO BIOLOGICO: implica l’impiego di organismi antagonisti ai fitopatogeni, costituisce

un’alternativa per ridurre l’uso di composti chimici (pesticidi) in agricoltura e mantenere al contempo

la popolazione dei patogeni rizosferici entro una soglia di non pericolosità

- La maggior parte dei PGPR attivi nel controllo biologico appartengono ai generi Pseudomonas e

Bacillus , scoperti per la prima volta in SUOLI REPRESSIVI

PROPRIETÀ DEGLI AGENTI DI CONTROLLO BIOLOGICO:

- Colonizzazione effettiva e competitiva della rizosfera

- Effetti di antagonismo sui patogeni = ANTIBIOSI

- Induzione della resistenza della pianta = INDUCED SYSTEMIC RESISTANCE (ISR)

PROBIOTICI VEGETALI: microrganismi con un effetto benefico sull’ospite

PGPR con azione di biocontrollo devono essere presenti sulla radice in numero sufficiente per dare l’effetto

benefico: 105-106 cfu/g radice (0,1-1% dei batteri totali)

ANTIBIOSI

• ANTIBIOSI: Uno (o più) metaboliti prodotti da un PGPR che mostra effetto dannoso su patogeni

- Agenti litici, enzimi, composti solubili, volatili o altri composti tossici

- L’azione antibiotica dei PGPR è alla base della LOTTA BIOLOGICA

• ANTIBIOTICI: molecole solubili e di basso peso molecolare, prodotte durante il metabolismo secondario

- Un ceppo PGPR può produrre uno o più antibiotici diversi

- Antibiotici selettivi o con ampio spettro d’ospite

[DAPG (2,4 diacetil floro glucinolo) FENAZINE, PIRROLNITRINA, ZWITTERMICINA A, HCN, LIPOPEPTIDI

CICLICI]

• ALTRE ATTIVITÀ DI ANTIBIOSI

- PRODUZIONE DI ENZIMI LITICI: enzimi idrolitici extracellulari che attaccano la parete degli antagonisti

- DETOSSIFICAZIONE E DEGRADAZIONE DEI FATTORI DI VIRULENZA: • degradazione enzimatica (esterasi)

delle tossine prodotte da microrganismi antagonisti • produzione di proteine che si legano

reversibilmente alle tossine

- PRODUZIONE DI MOLECOLE VOLATILI

RESISTENZA INDOTTA

• ISR: Induced Systemic Resistance

- Processo di attiva resistenza innescata da agenti biotici o abiotici che dipende da barriere chimiche e

fisiche della pianta ospite

- Il ceppo PGPR ed il patogeno non devono essere necessariamente in contatto (foglie/radici)

- Interazione specifica pianta - ceppo PGPR

- I componenti batterici responsabili dell’induzione alla resistenza non sono ancora stati identificati:

flagelli, siderofori, LPS, composti volatili 23

• DIFFERENZE ISR – SAR (Systemic acquired Resistance)

- Nella SAR la preinfezione del patogeno induce nella pianta una reazione ipersensitiva visibile (lesione

necrotica), nella ISR non ci sono sintomi visibili

- L’ISR sembra associata ad un aumento della sensibilità delle cellule vegetali agli ormoni prodotti dai

PGPR più che alla loro sovrapproduzione

- La SAR induce un accumulo di proteine collegate alla patogenicità nella pianta, l’ISR no

QUORUM SENSING

- Il quorum sensing è un meccanismo di comunicazione tra batteri

- Invece del linguaggio, vengono usate MOLECOLE SEGNALE, prodotte normalmente a livelli minimi

basali, che vengono rilasciate nell’ambiente

- Quando la densità cellulare supera un valore soglia, la concentrazione delle molecole segnale

nell’ambiente esterno alla cellula è alta

- Alte concentrazioni delle molecole segnale attivano o reprimono specifici geni target

• MOLECOLE SEGNALE

- Specie diverse producono e riconoscono specifiche molecole segnale

- Molti batteri Gram- che possiedono QS regolano specifiche vie metaboliche tramite molecole segnale

= ACIL-OMOSERIN LATTONI (AHL)

- I batteri Gram+ utilizzano molecole segnale di diversa struttura, spesso piccoli polipeptidi

• QUORUM SENSING NEI RIZOBI

- Rhizobium produce molte diverse tipologie di AHL

- meccanismi di quorum sensing non hanno un ruolo essenziale, ma sono implicati nella regolazione di:

crescita nella rizosfera, nodulazione e sviluppo del nodulo, differenziazione dei batteroidi

- Bradyrhizobium japonicum produce delle molecole segnale (non AHL) che stimolano la produzione dei

fattori prodotti dalla pianta che inducono l’espressione nel batterio dei fattori nod

• QUORUM SENSING NEI FITOPATOGENI

- Erwinia carotovora subsp. carotovora è un fitopatogeno ed attiva la patogenesi e la sintesi di

esoenzimi ed antibiotici con un meccanismo di quorum sensing mediato da AHL

- Pseudomonas syringae pv syringae tramite quorum sensing regola la morfologia della colonia e la

vitalità in planta

• PGPR CHE DEGRADANO LE MOLECOLE SEGNALE

sono stati scoperti batteri in grado di degradare le molecole segnale come gli AHL («Quorum quenching»),

che quindi ostacolano le attività attivate nei microrganismi tramite quorum sensing 24

INOCULATI MICROBICI

[1] SIMBIONTI AZOTOFISSATORI

- Scoperti alla fine del’800. Sfruttati per migliorare la produttività delle leguminose da foraggio e

granella. Oggi viene applicata la BATTERIZZAZIONE dei semi di leguminosa

- È la più estesa e antica pratica di rilascio deliberato di microrganismi nell’ambiente

FATTORI CHE INFLUISCONO SULLA SOPRAVVIVENZA DELL’INOCULO:

- Acidità e umidità del suolo

- Presenza di sostanze inibenti o tossiche per i rizobi

- Antagonismo microbico

- Concentrazione di particolari ioni (influenza sulla nodulazione)

- Presenza di ceppi indigeni che competono per la nodulazione

- Scarsità di nutrienti

- Resa agronomica ottimale: 106 rizobi/seme

VALUTAZIONE DELLA PRESENZA DI RIZOBI NEL TERRENO

- L’inoculo dei semi è necessario quando nel suolo sono presenti < 10-100 rizobi/grammo

- Non esistono mezzi colturali selettivi per rizobi vengono effettuate PROVE DI NODULAZIONE: il

numero di rizobi è stimato in base al numero di piantine che sviluppano noduli radicali

- Diluizioni del suolo vengono messe in contatto con semi sterilizzati e pre-germinati e dopo alcune

settimane di crescita si contano le piante nodulate (Most Probable Number)

CRITERI DI SELEZIONE DEI RIZOBI

- EFFICACIA: quantità di N fissato dal rizobio. Si misura N tot, attività nitrogenasica, incorporazione N

marcato

- COMPETITIVITÀ: capacità del ceppo di indurre la nodulazione in presenza di popolazioni indigene di

rizobi (generalmente con elevata infettività e bassa efficacia)

- SOPRAVVIVENZA in varie condizioni ambientali: pH, contenuto di sostanza organica, composizione

ionica del suolo

- PERSISTENZA: capacità di sopravvivere nel suolo anche oltre il ciclo colturale. Evita successive

batterizzazioni ma limita la competitività di successivi ceppi migliori in alcuni paesi si adottano

ceppi non persistenti.

- TRACCIABILITÀ: è importante per identificare la presenza del ceppo nel prodotto finito e nel suolo.

Metodi: sierologici, produzione di antibiotici, altre caratteristiche biochimiche, metodi molecolari

BATTERIZZAZIONE

- Il ceppo selezionato di rizobio viene coltivato in fermentatori e la biomassa applicata ai semi come

PRODOTTO LIQUIDO o assieme a COFORMULATI SOLIDI

- Coformulati non sterili possono contenere patogeni per uomo o pianta, o microrganismi in

competizione con i rizobi

CO-FORMULATI

• TORBA

- finemente polverizzata è il supporto maggiormente usato.

- Torba umidificata aderisce alla superficie dei semi 25

- Basse cariche di rizobi vengono adsorbiti su torba pre-sterilizzata (104 cfu/g), si moltiplicano in assenza

di competizione raggiungendo alte cariche (109 cfu/g)

- DIFETTI: scorte limitate, possibile presenza di inibitori, difficoltà sterilizzazione, possibile formazione

sottoprodotti tossici dalla sterilizzazione

• ALTRI VEICOLANTI: Vermiculite, polvere di carbone, fanghi essiccati e polverizzati, terreno minerale,

compost, bentonite, polvere di erba medica, residui industriali (canna da zucchero, caffè, cocco), paglia

(grano, riso, mais), lignite, caolinite, alginati, perlite

CONTROLLO EFFICACIA CEPPI UTILIZZATI

• TEST DI NODULAZIONE

- Effettuato su piante compatibili per la simbiosi, impiegando specie di piccola taglia

- I semi sono sterilizzati e fatti germogliare su H2O agarizzata

- Quando le radichette hanno raggiunto 1-2 cm le piantine vengono trasferite asetticamente su terreno

minerale agarizzato in provetta o inerte in idroponica o vaso (vermiculite o suolo sterile) PRIVO di N

COMBINATO contenente una sospensione di cellule

- Dopo 4-10 settimane in cella climatizzata (T, luce, umidità controllate) quando la radice ha esplorato la

maggior parte del substrato, viene valutata la nodulazione

• TEST DI AZOTOFISSAZIONE

- Sull’intera piantina, Su singole radici nodulate escisse

- ARA (Attività Acetilen Riduttasica) = moli di etilene prodotto per ora/ grammo di tessuto nodulare

secco (=attività nitrogenasica specifica)

PROCESSO PRODUTTIVO: La qualità del prodotto dipende da:

• Numero cellule vitali del rizobio • Numero contaminanti • Efficacia nodulazione • Tipo di prodotto

(liquido è + efficace) • Tempo e modalità di stoccaggio

[2] INOCULATI FUNGINI (FMA)

- I funghi micorrizici arbuscolari sono SIMBIONTI OBBLIGATI e non possono essere moltiplicati in grandi

fermentatori come i batteri o i funghi saprofiti

- Vengono mantenuti in camere di crescita o in serra, cresciuti in vaso o bancale assieme alle loro piante

ospitigranella. Oggi viene applicata la BATTERIZZAZIONE dei semi di leguminosa

- È la più estesa e antica pratica di rilascio deliberato di microrganismi nell’ambiente

[3] BIOFITOFARMACI

L’impiego di MICRORGANISMI ANTAGONISTI per controllare fitopatogeni è in uso da circa 50 anni. Oggi

sono disponibili diversi preparati commerciali a base di funghi o batteri antagonisti utilizzabili sulle colture

come (o in sinergia con) fitofarmaci

Per raggiungere lo sviluppo commerciale il ceppo antagonista deve soddisfare i seguenti criteri:

- Assenza di tossicità (pianta, animali, uomo)

- Assenza di effetti collaterali indesiderati 26

- Adattato all’ambiente (anche in condizioni avverse) e persistente in campo per almeno 1 ciclo

produttivo

- Rizosfera-competente

- Ampio spettro d’azione (patogeni e colture)

- Efficace in diverse aree geografiche

- Stabilità (genetica e biologica) durante produzione e conservazione

- Facile ed economico da coltivare

PREPARATI PER LA LOTTA BIOLOGICA

- La biomassa del fungo antagonista (cellule, micelio, spore) o del batterio (cellule, spore) viene

ottenuta in fermentatori

- Il prodotto commerciale viene preparato incorporando le cellule microbiche in differenti matrici

- Formulati granulari, in polvere, liquidi, ecc

- Circa il 90% dei prodotti per la lotta biologica sono preparati a base di spore di Bacillus thuringiensis

- Circa il 50% dei biofungicidi in commercio sono a base di Trichoderma o Gliocadium, utili per la

lotta biologica contro varie fitopatologie 27

BIOCONTROLLO CON INSETTI E BT (Bacillus THURINGIENSIS)

[1] BACILLUS THURINGIENSIS

- Batteri Gram+, aerobi, sporigeni. Ubiquitari e molto diffusi, habitat nel suolo.

- Costituiscono il 90% degli insetticidi biologici disponibili in commercio (Spray a base di proteine di

B. thuringiensis BT)

- Bt è attivo contro diversi ordini di insetti (Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera,

Homoptera, Orthoptera e Mallophaga) e contro protozoi, nematodi e acari

- L’attività insetticida è dovuta alla produzione di TOSSINE proteiche con attività insetticida

Diverse classi di tossine sono prodotte da

diverse sottospecie di B. thuringiensis ed

hanno diverso spettro d’ospite:

[2] LE TIPOLOGIE DI TOSSINE

•TOSSINE CRY

- Costituite da cristalli proteici

sintetizzati durante la fase della sporulazione

- Quando avviene la lisi della cellula, viene rilasciata nell’ambiente la spora ed il cristallo parasporale

• TOSSINE CYT

- Tossine CITOLITICHE tossiche contro le larve dei ditteri

- Prodotte da B. thuringiensis serovar israelensis e poche altre subspecie

- Basso peso molecolare, prodotte contemporaneamente alle tossine cry (40% dei cristalli parasporali)

- Ampio spettro d’ospite in vitro (non vengono riconosciute da recettori) e alta specifictà verso ditteri in

vivo

- È stato ipotizzato che agiscano aggregandosi aspecificamente sulla superficie delle membrane ed

esercitino un’azione analoga ai detergenti

• TOSSINE VIP

- Tossine insetticide contro alcune specie di coleotteri e lepidotteri

- Prodotte durante la fase di crescita vegetativa

- Non formano cristalli parasporali, secrete dalla cellula

- Per alcune specie di insetti sono anche più attive delle tossine cry

[3] PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

Specie vegetali ad interesse agronomico: • per nutrizione animale o umana • ornamentali • biosensori

Le piante transgeniche possiedono TRANSGENI = GENI ESOGENI inseriti nel cromosoma vegetale

Spesso i transgeni sono GENI BATTERICI che conferiscono alla pianta particolari caratteristiche:

maggiori rese • miglior prodotto • meno micotossine • meno antiparassitari

PIANTE BT

Piante Geneticamente Modificate (mais, cotone, patata, tabacco) mediante l’inserzione dei geni cry di B.

thuringiensis, che codificano per le proteine CRY 28

VANTAGGI PIANTE Bt

- I preparati biologici di B. thuringensis spruzzati sulle colture sono poco persistenti: sono facilmente

dilavabili dalla pianta e non raggiungono tutte le zone della pianta

- Gli insetti patogeni target delle tossine quando in forma di larva si nutrono dei tessuti di piante Bt,

ingeriscono la tossina in modo continuato ed uniforme fin dall’inizio del ciclo vitale, perché è presente

in tutti i tessuti verdi della pianta

- Le piante Bt risultano quindi AUTOPROTETTE e sono necessari meno trattamenti insetticidi (vantaggio

economico, meno rischi per gli operatori e per i consumatori)

- Le larve degli insetti si accrescono nei tessuti della pianta formando gallerie che sono siti di attacco per

funghi e muffe tossinogeni: le piante Bt hanno migliori rese produttive ed in genere i loro prodotti

contengono meno micotossine

LE PAINTE BT HANNO:

- Ridotto le popolazioni dei patogeni (anche nelle coltivazioni non Bt)

- Ridotto la dipendenza dagli insetticidi spray

- Aumentato il controllo dei patogeni da parte degli antagonisti naturali

- Aumentato il profitto degli agricoltori (Bt e non Bt)

POSSIBILI RISCHI CONNESSI ALLA IMMISSIONE DI GMP NELL’AMBIENTE

[3] BIOCONTROLLO DELLE PIANTE INFESTANTI

Biotecnologie di lotta alle erbe infestanti prevedono l’utilizzo di agenti di biocontrollo, cioè organismi

(insetti, batteri e funghi) antagonisti delle malerbe

Data l’elevata specificità di tutti gli agenti di biocontrollo i microrganismi sono proficuamente usati nei

seguenti casi:

- Singole infestanti che hanno evoluto resistenza ad un determinato erbicida ampiamente usato

- Singole infestanti la cui dose letale di erbicida è molto più elevata della maggior parte delle altre

infestanti

- Ambienti a rischio di contaminazione chimica diretta per la popolazione (es. centri urbani)

- Colture ad elevato reddito 29

Gli agenti di biocontrollo esplicano tossicità cronica e non acuta nei confronti dell’ospite

Il motivo della tossicità cronica è evolutivo: l’iperpatogenicità può portare all’estinzione sia del parassita

che dell’ospite, o comunque renderli meno diffusi nell’ambiente

Alti livelli di inoculo sono necessari per superare le barriere che regolano l’interazione patogeno-malerba e

trasformare il m.o. da agente con tossicità cronica in agente con tossicità acuta:

- Il m.o. deve raggiungere il target: foglie, apici meristematici, radici

- Il m.o. deve rapidamente infettare i tessuti (6-18 h)

- Difesa della pianta: chitinasi, glucanasi (barriera penetrazione nell’ospite) fitoalessine (tossine per i

funghi) suberina, lignina, ecc. (barriere fisiche)

Sono state elaborate 4 diverse strategie che permettono di assistere il m.o. nel superamento di queste

barriere e quindi renderne economicamente efficace l’uso

- Aggiunta di formulanti per facilitare la dispersione

- Sinergismo con erbicidi chimici E Sinergismo con altri m.o. non patogeni

- Manipolazione genetica del m.o. o della pianta

MIGLIORAMENTO DEL BIOCONTROLLO DELLE ERBE INFESTANTI

• MICOERBICIDI IN FORMULAZIONI

Come per gli erbicidi chimici l’aggiunta di formulanti permette di migliorare il contatto tra il m.o. ed il suo

target

Le formulazioni per le parti aeree contengono oltre al m.o.

- agenti di ispessimento contro la sedimentazione delle spore

- detergenti per impedire l’aggregazione delle spore

- agenti adesivi per mantenere il m.o adeso alle foglie

Le formulazioni per le parti ipogee contengono:

- un substrato solido per facilitare la diffusione del m.o.

- il m.o. può essere incapsulato in una matrice per aumentarne la persistenza

• SINERGIA DEI M.O. CON ERBICIDI CHIMICI

Lo scopo è di abbassare le difese della pianta e quindi aumentare la virulenza del m.o. quando

somministrato con:

- erbicidi chimici a livello sub-letale

- sostanze che inibiscono la formazione delle naturali difese della pianta, ad es. attraverso inibizione

della sintesi di suberina, callosio, lignina, fitoalessine, etc.

• SINERGIA CON ALTRI M.O. NON PATOGENI

- Si possono aggiungere alla formulazione m.o. non patogeni, che però possono diventare patogeni

opportunisti in seguito all’attacco del m.o. patogeno

- Un esempio riguarda l’interazione tra un fungo agente di una ruggine che attacca un’infestante, ma

non la controlla. Subentra quindi un Colleotrichum sp. che pur essendo inefficace da solo, riesce a

penetrare l’infezione ed ad uccidere la pianta 30

ECOLOGIA MICROBICA MOLECOLARE

[1] INTRODUZIONE

RELAZIONI FILOGENETICHE

- Filogenesi: storia evolutiva e correlazioni genetiche tra microrganismi

- La molecola più utilizzata per indagare il grado di relazione evolutiva tra i microrganismi è l’rRNA.

- rRNA è contenuto nei ribosomi (sintesi proteica) di tutti gli organismi diffusione universale

- rRNA ha subito modificazioni molto lente durante l’evoluzione natura altamente conservata

IL 16 Rrna

- Gene lungo ca 1542 nt, dopo la trascrizione assume una particolare struttura secondaria

- Codifica per la subunità piccola del ribosoma procariota (negli eucarioti 18S rRNA)

- È l’orologio molecolare più usato per studiare la filogenesi ed identificare i batteri

- Deve assumere una determinata struttura tridimensionale per assolvere la sua funzione, quindi ha un

basso tasso di mutazione (la maggior parte delle mutazioni producono ribosomi non funzionanti e non

vengono trasmesse alla progenie)

Nella sequenza del gene 16S rRNA si riconoscono diverse regioni:

- regioni CONSERVATE universali, che hanno la stessa sequenza in tutti i batteri

- regioni SEMICONSERVATE, che hanno sequenza uguale tra batteri dello stesso taxon

- regioni VARIABILI, che hanno la stessa sequenza tra batteri appartenenti alla stessa specie

Confrontando la sequenza di questo gene di diversi batteri è possibile:

- Quantificarne la DISTANZA FILOGENETICA: determinare a che punto dell’evoluzione 2 organismi si

sono differenziati

- Determinare la diversità tra gli organismi

- Identificare un batterio: se 2 organismi hanno 16S rRNA con più del 97% delle basi identiche,

appartengono alla stessa specie

ALBERO DELLA VITA

Confrontando le sequenze del gene 16S/18S rRNA è possibile raggruppare tutti gli organismi viventi e

riconoscerne le relazioni evolutive

[2] BIOTECNOLOGIE AMBIENTALI ED ECOLOGIA MICROBICA

Comunità microbiche: Sono un insieme di popolazioni microbiche che si auto-organizzano ed auto-

sostengono. Sono in grado di fornire i seguenti «servizi» in maniera affidabile, continua, economicamente

vantaggiosa:

- Detossificazione di acque, reflui, sedimenti, suoli

- Cattura di risorse rinnovabili, in particolare energia ed acqua

- Rilevazione di contaminanti e patogeni nell’ambiente

Ecologia microbica: Disciplina scientifica che ha come obiettivo lo studio delle comunità microbiche per

comprendere come esse interagiscono con il loro ambiente 31

L’ecologia microbica si occupa di studiare 4 aspetti delle comunità microbiche:

- Quali/quanti microrganismi sono presenti nella comunità = la STRUTTURA

- Quali capacità hanno i microrganismi di condurre reazioni/metabolismi = il POTENZIALE FENOTIPICO

- Quali reazioni i membri della comunità fanno effettivamente = la FUNZIONE

- Le relazioni dei membri della comunità tra di loro e con l’ambiente = il NETWORK

Biotecnologie ambientali: gestire le comunità microbiche per fornire un servizio alla società: creare delle

tecnologie che favoriscono i microrganismi, così che i microrganismi possano lavorare per noi

MRM = Microbial Resource Management

ECOLOGIA MICROBICA MOLECOLARE

Pochi microrganismi sono coltivabili in laboratorio. Diversi motivi:

- Mancanza degli adatti substrati e di opportuni fattori di crescita

- Crescita solo in associazione (sintrofismo)

- Il substrato accelera la morte dei microrganismi

- Tempo di incubazione non sufficiente (selezione di r-strateghi)

I metodi molecolari basati su opportune sequenze geniche consentono di conoscere:

- Struttura della comunità microbica

- Ricchezza in specie (biodiversità)

- Identificazione delle specie presenti nella comunità

Si possono applicare anche ai microrganismi isolati per identificarli e caratterizzarne la diversità intra-specie

METODI MOLECOLARI PER L’ANALISI DI COMUNITA’ MICROBICHE:

Librerie geniche del gene 16S rRNA, Fingerprinting su gel, Sequenziamento massivo, Omics approaches

IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI PRESENTI IN UN CAMPIONE AMBIENTALE

SEQUENZIAMENTO: determinazione

dell'ordine dei diversi nucleotidi

Sequenzionamento di nuova generazione: Si

tratta di metodologie nuove basate sul

principio del sequenziamento di ' 32

BIORISANAMENTO

[1] INTRODUZIONE

Biorisanamento: processo che impiega microrganismi, piante o enzimi per eliminare o ridurre la

concentrazione di sostanze xenobiotiche da siti contaminati per ottenere il loro risanamento

Principi generali della biorimediazione: Un fenomeno di inquinamento ha un’azione tossica, provoca

profonde perturbazioni degli equilibri preesistenti nelle popolazioni microbiche, e finisce per favorire solo

le popolazioni che resistono alla tossicità dei contaminanti e sono in grado di usarli come fonte di nutrienti.

Per alcuni ceppi microbici si crea così una condizione estremamente favorevole:

- disponibilità di nutrienti (inquinanti)

- assenza di competizione sull’impiego dei nutrienti e ridotta minaccia negli equilibri predatore-preda

Questo processo avviene spontaneamente negli ambienti inquinati = NATURAL ATTENUATION I processi di

natural attenuation sono lenti:

- Accumulo di inquinanti nell’ambiente

- Effetti tossici per uomo e ambiente

- Rischio di movimento degli inquinanti in comparti non inquinati

Tecnologie di BIOREMEDIATION velocizzano il naturale processo di natural attenuation rendendo più veloce

il metabolismo dei microrganismi degradatori

FATTORI CRITICI CHE INFLUENZANO LA VELOCITÀ DI BIODEGRADAZIONE

• CHIMICO-FISICI, attribuibili prevalentemente alla matrice ambientale:

- temperatura - presenza di sostanze limitandone la

- potenziale redox organiche in grado di biodisponibilità

- salinità e pH adsorbire i contaminanti

• NUTRIZIONALI, critici per la moltiplicazione dei microrganismi

- disponibilità di acqua - O2 ed altri accettori finali di elettroni (nitrati,

- N, P solfati, CO2,…)

- micronutrienti (Fe, Co, Zn,…)

• TOSSICOLOGICI, attribuibili ai contaminanti: natura dell’inquinante e concentrazione media e puntuale

[2] LA BIOREMEDIATION

Il principio su cui si basano tutte le tecnologie di bonifica biologica è l’accelerazione dei naturali processi

degradativi a carico degli inquinanti

- BIOENHANCEMENT: tecnologie che sfruttano la moltiplicazione delle popolazioni microbiche

direttamente nel suolo o nelle acque a spese delle sostanze da degradare

- BIOAGUMENTATION: preparazione, in adatti sistemi fermentativi, di inoculi costituiti da

microorganismi con specifiche capacità degradative selezionati sia dai materiali stessi da bonificare, sia

da da materiali provenienti da siti diversi 33

- Efficienza/efficacia di un processo di degradazione di contaminanti in suolo o acque è da attribuire

generalmente ad un “consorzio” di microrganismi

- La bonifica biologica di un sito è basata sulla sequenza di fenomeni di continua trasformazione degli

inquinanti e delle popolazioni microbiche, per cui ogni fase è diversa da quella precedente e da quella

successiva

- I protagonisti principali dei processi biodegradativi sono i BATTERI:

➢ Sono piccoli: elevato rapporto superficie/volume, alta dispersibilità

➢ Elevata diversità tassonomica e metabolica: elevato potenziale catabolico e catalitico

➢ velocità di moltiplicazione generalmente superiore a quella degli altri microrganismi

➢ BATTERI ESTREMOFILI: in grado di tollerare e/o crescere in condizioni ambientali sfavorevoli per

gli altri organismi

• VANTAGGI BIOREMEDIATION

- E’ un processo naturale

- Molti composti vengono completamente mineralizzati; altri sono trasformati in prodotti non tossici

- I siti contaminati vengono risanati senza alterare radicalmente il loro stato (bioremediation in situ)

- Sono trattamenti competitivi dal punto di vista dei costi

- Sono facilmente accettati dall’opinione pubblica

• LIMITI BIOREMEDIATION

- E’ un trattamento altamente specifico: ogni sito contaminato presenta problemi specifici diversi

- Non tutti gli xenobiotici sono degradabili

- Presenza della microflora degradativa adatta

- Necessità adatte condizioni ambientali di crescita dei m.o.

- Selezione appropriate concentrazioni substrati e nutrienti

- Problemi dovuti alle contaminazioni multiple (es. composti organici, metalli pesanti e radionuclidi)

- I prodotti di degradazione possono essere più tossici dei composti originali (es. la degradazione del TCE

può portare a cloruro di vinile, sospetto cancerogeno)

- Carenza di personale preparato nei diversi campi scientifici legati alla bioremediation e carenza di dati

di campo.

• PROBLEMI E CONNESSI AD INTERVENTI DI BIOREMEDIATION

ETEROGENEITA’ DEGLI INQUINANTI

Gli inquinanti organici ed inorganici sono dispersi in maniera eterogenea nel suolo, e possono essere

presenti in forma solida, liquida e gassosa. Inoltre possono essere liberi in soluzione, adsorbiti o legati

chimicamente al particolato.

EFFETTO CONCENTRAZIONE

Gli inquinanti possono essere presenti in alte o basse concentrazioni. Le basse concentrazioni possono

essere troppo basse per supportare la crescita dei microrganismi o determinare induzione enzimatica. Le

alte concentrazioni possono determinare effetti inibitori o tossici. 34


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DESCRIZIONE APPUNTO

Argomenti trattati:
Ruolo dei microrganismi nella formazione del suolo, mantenimento della fertilità e ciclo della sostanza organica.

Microbiota del suolo, rizosfera, fillosfera. Associazioni tra microrganismi e piante: simbiosi micorriziche e attinorriziche, azotofissazione e simbiosi azotofissatrici.

Plant Growth Promoting Bacteria: i) meccanismi microbici di promozione diretta della crescita, biostimolazione e biofertilizzazione, ii) meccanismi microbici di promozione indiretta della crescita, microrganismi antagonisti, controllo simbiotico degli insetti dannosi o vettori di fitopatogeni, OGM per la lotta agli insetti.

Inoculanti microbici: produzione, uso in pieno campo, effetti agronomici Biotecnologie microbiche per la produzione vegetale e lo smaltimento dei residui: insilamento, digestione anaerobica, smaltimento dei reflui. Biorisanamento dei suoli.

Identificazione microbica e studio delle comunità microbiche ambientali, gli strumenti dell’ecologia microbica: ecologia microbica molecolare

Voto: 28


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in scienze della produzione e protezione delle piante
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher simone.raspagni di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie microbiche vegetali e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Crotti Elena Sara.

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