Che materia stai cercando?

Biotecnologie Vegetali

Appunti di Biotecnologie vegetali basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Bracale dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biotecnologie vegetali docente Prof. M. Bracale

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

Fitormoni

Ormoni delle piante, in realtà si parla di fattori di crescita perché il sistema ormonale

della piante è molto diverso da quello degli animali. Il sistema di regolazione ormonale

nelle piante è diverso rispetto a quello animale: minore specificità di azione, a

differenza degli animali che hanno un bersaglio specifico, gli ormoni vegetali non

hanno una singola funzione, ma possono svolgere funzioni molto diverse a seconda del

tipo di tessuto, anche in base alle condizioni fisiologiche della pianta. Sono

fondamentali gli stimoli ambientali e molti processi fisiologici sono sotto il controllo di

vari regolatori. Le caratteristiche principali dei sistema ormonale delle piante possono

essere riassunti:

Largo spettro di risposte biologiche nei diversi tessuti della pianta, sebbene i

 vari ormoni possano manifestare un’azione specifica in tessuti ben precisi e in

stadi di sviluppo specifici

Fenomeni di interazioni tra i vari ormoni nei singoli processi fisiologici (di tipo

 additivo, sinergico, antagonista)

Ormoni vegetali:

Auxine -> Sia naturali (IAA) che di sintesi (IBA e NAA), questi vengono spesso

 usati perché sono molto efficaci.

Citochinine -> ormoni vegetali che derivano dall’adenina: isopententiladenina.

 Giberellline

 ABA, fattore di crescita in relazione alle condizioni ambientali diverse (siccità,

 freddo) da questo parte una cascata di attività genica che porta alla produzione

di metaboliti e altro per superare il periodo di stress idrico

Etilene

 Jasmonato o brassinosteroidi

Sono estremamente importanti per lo sviluppo corretto della pianta e per le interazioni

della pianta con l’ambiente. Auxine e citochinine aggiunte al terreno di crescita.

Citochinine promuovono lo sviluppo in alto della pianta, mentre le auxine promuovono

la formazione degli organi laterali (ramificazione) sempre nel meristema apicale. CK

promuovono il differenziamento delle radice, mentre le auxine hanno un effetto

antagonistico, inducono lo sviluppo delle radici, ma mantengono la parte

meristematica attiva, mantengono la caratteristica indifferenziata delle cellule apicali.

Ci sono differenze tra la parte apicale e quella area. È importante non solo la

concentrazione di fitormoni ma anche il rapporto tra le due. Cosa succede in coltura

quando si somministrano auxine? Più auxine rispetto alle CK, dall’espianto si

sviluppa la radice. Bassa [auxine] alta [CK] elevato sviluppo parte area e niente radici.

Cosa succede se metto un rapporto equimolare? Si sviluppa il callo! La presenza

di questi due nel terreno mi permette di modulare la rigenerazione del tessuto come

voglio io.

Fonte di carbonio

I germogli o gli espianti non sono capaci di fare fotosintesi in modo tale da soddisfare

le proprie esigenze quindi servono fonti di carbonio: saccarosio. I germogli in vitro

sono eterotrofi, devono trarre zuccheri direttamente dal substrato e fissano solo in

minima parte la CO . La fonte di carbonio più facilmente utilizzata da cellule in coltura

2

è il saccarosio che è idrolizzate da una serie di isoenzimi, noti come invertasi, a

glucosio e fruttosio. 7

Callo: perdita attività morfogenetica

Colture di calli in sospensione, capaci di organogenesi, mostrano una progressiva

perdita della capacità morfogenetica quando sono mantenuti in laboratorio mediante

periodici trasferimenti in terreno fresco. Per spiegare il fenomeno sono state avanzate

due ipotesi:

Ipotesi genetica: alterazioni nel patrimonio genetico di una cellula in coltura

 (mutazione cromosomica, euploidia o aneuploidia) determinano la selezione di

cellule devianti, difettive nella totipotenza ma con vantaggi selettivi nelle

condizioni di coltura usata

Ipotesi fisiologica: in risposta alle condizioni della coltura si attiva specifici

 meccanismi fisiologici che bloccano in parte l’espressione genica

Sterilizzazione di composti termolabili

È fondamentale la sterilizzazione del terreno perché è un terreno molto ricco. I fattori

di crescita vegetali sono termolabili, quindi vuol dire che perdono l’attività con il

calore. Quindi si prende dell’acqua nel quale si diluiscono, si sciolgono micro e

macroelemento, prendere la bottiglia e metterla in autoclave per un tot di tempo a

120°C. Dopo di che bisogna aspettare che la bottiglia si raffreddi. Poi si possono

aggiungere ormoni vegetai e vitamine, per aggiungerli li filtro che permettono il

passaggio delle sostanze di interesse e trattengono sul filtro batteri/agenti inquinanti.

Ovviamente il tutto sotto cappa. Sterilizzazione per filtrazione attraverso membrane

con pori da 0.45-0.22 μm, sono disponibili unità filtranti sterili monouso disponibili per

filtrare volumi di liquido da 1 a 200 mL. Esistono filtri di acetato di cellulosa o di nitrato

di cellulosa per soluzioni acquose o organiche. Durante la filtrazione, tutte le particelle,

virus e microrganismi di dimensioni superiori al diametro dei pori del filtro vengono

rimosse.

pH

Misurato prima di sterilizzazione il terreno di coltura, intorno al 5.0 e 6.0. Se voglio

TM TM

utilizzare un terreno solido devo aggiungere dell’agar, agarosio, gelrite , phytagel

-> sostanze che danno consistenza gelatinosa alla soluzione. Le aggiungo prima di

mettere tutto in autoclave. Se uso un terreno solido quando tiro fuori la bottiglia

dall’autoclave, la faccio raffreddare, ma non troppo perché se no si gelifica nella

bottiglia. Vantaggio di usare terreni solidi: ad esempio con piastre Petri posso impilarle

ed occupano poco spazio. Si forma una situazione disomogenea, le cellule sotto

risultano a contatto col terreno di coltura mentre quelle sopra no. Quelle sopra sono

più facilitate negli scambi gassosi. Ad esempio nelle cellule del callo si può creare una

certa polarità di struttura. Mentre per quanto riguarda il terreno liquido non bisogna

aggiungere una sostanza gelificante. Quali sono i vantaggi di questo terreno? In una

beuta c’è l’espianto e più o meno tutte le cellule dell’espianto sperimentano la stessa

condizione. Lo svantaggio è che queste colture per permettere la crescita delle cellule

devono essere areate perché se no le cellule vanno in anossia. Quindi devono essere

messe su degli agitatori orbitanti che ruotano e permettono l’agitazione del liquido

(30-150 rpm). Cosa succede? Occupano molto posto al contrario delle piastre Petri. Le

colture su terreno solido presentano anche notevoli inconvenienti soprattutto a livello

di callo. Si determina infatti pressochè in tutti i calli una certa differenziazione cellulare

che giunge, in alcuni casi, anche alla formazione di vasi conduttori. Ciò è dovuto al

fatto che non tutte le cellule del callo si trovano nelle stesse condizioni ambientali: le

cellule degli strati più esterni sono, infatti, più direttamente a contatto delle sostanze

8

nutritive e dei gas rispetto alle cellule degli strati più

interni. La coltura di cellule vegetali in sospensione in

terreni liquidi permette di evitare alcuni dei problemi

legati alle condizioni di crescita su terreni solidi, il terreno

liquido infatti: facilita gli scambi nutritivi e gassosi e

permette di evitare fenomeni di polarizzazione.

Fase di lag: le cellule si preparano alla divisione

 Fase esponenziale: la velocità di divisione cellulare

 è massima

Fase di decelerazione: la velocità di divisione cellulare cala

 Fase stazionaria: il numero di cellule resta costa

Fattori fisici che influenzano la crescita in coltura

Esigenze di luce: non necessaria solo per la fotosintesi, ma induce una serie di

fenomeni morfogenetici. Le piante rispondono al rapporto ore di luce/buio mettendo in

atto dei processi di morfogenesi. La quantità di luce necessaria è molto inferiore a

quella in campo ed essenzialmente necessaria per la fotomorfogenesi. Importante

anche il fotoperiodo in quanto attiva programmi morfogenetici. Normalmente si usa un

fotoperiodo di 16/8. Talvolta le prime fasi si devono svolgere al buio. Le risposte alla

luce sono dipendenti dal genotipo e dalla natura dell’espianto. La temperatura è

importante perché anche in questo caso cambia la morfologia. La temperatura di una

camera di crescita è di solito 24-28°C. Talvolta, sulla base delle esigenze dell’espianto

sono necessarie temperature più basse (18°C) o più elevate (28°C) soprattutto nel

caso di specie tropicali.

Organizzazione laboratorio di colture in vitro

Stanza per la preparazione di tutto il materiale, con autoclavi, lava-vetrerie, necessario

per la sterilizzazione. Poi c’è una parte più operativa con cappe sterili. Poi c’è una

camera di crescita con luce e temperatura controllate per lo sviluppo degli espianti.

Inquinamenti

Virus

 Batteri, identificabili come aloni lattiginosi o colonie mucillaginose che crescono

 sulla superficie del terreno di coltura. A volte possono essere colorati (giallo,

rosa, etc.). Cefotaxime 50 mg/L può essere aggiunto al terreno di coltura per

limitare le infezioni batteriche.

Funghi, crescita di masserelle lanose di micelio spesso bianche o grigiastre. Se

 Penicillium, Rhizopus

verdi -> se con piccoli granuli neri ->

Micoplasmi

 Micro artropodi e tripidi

A volte succede che l’espianto diventi molto scuro perché molte specie vegetali sono

ricche di sostanze chiamate polifenoli che sono prodotte in situazioni di stress,

presenza di patogeni/insetti, questi provocano delle lacerazioni e attraverso queste

lacerazioni possono entrare batteri che danneggiano la vitalità della pianta. La pianta

produce una serie di composti che hanno proprietà antibatteriche o comunque di

chiusura della ferita. I polifenoli entrano nella composizione della parete della cellula

vegetale. Quando si taglia con i bisturi si va a mimare la presenza di un insetto o una

lesione, quindi l’espianto reagisce con produzione di sostanze come queste. Però se

9

raggiungono una situazione, concentrazione molto elevata di polifenoli è dannoso per

la cellula perché inibiscono l’attività enzimatica e possono danneggiare

irreversibilmente l’espianto. Dopo la dissezione i polifenoli sono ossidati dalla

polifenolo ossidasi e i tessuti diventano bruni. I polifenoli ossidati inibiscono l’attività

enzimatica e possono danneggiare irreversibilmente l’espianto. Si può cercare di

evitare il fenomeno aggiungendo antiossidanti (acido ascorbico, acido citrico, PVP) al

terreno di coltura. C’è anche la formazione di una “cintura di sicurezza” intorno alla

parte lesa, perché ad esempio molto virus si propagano in presenza di cellule vegetali.

Quindi se inducono una morte programmata impedisce l’ulteriore progressione

dell’infezione virali. Si ottiene aumentando la concentrazione di sostanze tossiche

nelle cellule vicine all’infezione virale. I polifenoli quindi svolgono due funzioni: a basse

[] servono per formare la parete, ad alte [] induce danni.

In coltura, come anche in natura, i tessuti lesionati portano alla produzione di molecole

che possono inibire la vitalità delle cellule vegetali. In coltura non voglio ciò e limito il

fenomeno aggiungendo degli antiossidanti (acido ascorbico, acido citrico, PVP) che

contrastano la formazione di queste sostanze. La formazione di queste sostanza è

molto specie-specifica. Alcuni problemi con la coltura in vitro posso risolvere stando

attenta altri problemi sono intrinseci al genoma con cui sto lavorando.

APPLICAZIONI DELLE COLTURE IN VITRO

Micropropagazione

Applicazione delle tecniche di coltura in vitro per la moltiplicazione massiva di piante

con un determinato fenotipo e background (genotipo) di grande importanza. La

variabilità genetica dovuta all’unione di patrimoni genetici diversi è un bene prezioso

per ottenere nuove combinazioni di geni, ma se l’obiettivo è quello di ottenere dei

cloni, cioè discendenze con le stesse caratteristiche genotipiche (e quindi con le stesse

caratteristiche organolettiche e produttive) della pianta madre, si deve ricorrere

necessariamente alla propagazione vegetativa. La riproduzione vegetativa di massa

non è meno costosa di quella per seme, ma è giustificata dalla superiorità ed

uniformità degli specifici cloni. Inoltre consente di realizzare, nel corso dell’anno,

un’attività continua (indipendente dalla stagione vegetativa) con un programma di

produzione più vicino alle esigenze di mercato. Prima di essere commercializzate viene

fatta una certa crescita in serra, perché comunque la pianta che si preleva dal vitro è

molto delicata. Perché non ha mai conosciuto un ambiente non sterile inoltre è sempre

vissuta in un ambiente con un’elevatissima umidità quindi la sua tendenza sarà quella

di avere sempre gli stomi aperti. Quindi bisogna far ambientare la pianta da una

situazione di sterilità ad una situazione naturale, fondamentale la fase di

acclimatazione in serra.

orchidee

Esempio:

Il mercato di orchidee raggiunge i 200 milioni di dollari! La germinazione dei semi di

orchidee è di estrema difficoltà essendo basata sulla simbiosi con specifici funghi.

Propagazione generativa: se il fiore viene impolverato, si genera una capsula si

demi con innumerevoli semi che però generano piante non identiche una all’altra. Ed è

per questo motivo che la propagazione generativa non è adatta ad una coltivazione

precisa, di varietà distinte detta propagazione viene però usata per l’ibridazione di

nuove varietà. Si prende il polline e si inseminano le singole piante, inoltre questa

operazione è piuttosto laboriosa (perché c’è la possibilità che si danneggi il polline).

Oggi invece si utilizza la propagazione in vitro, si parte da due tipi di espianti: gemme

apicali o coltura internodale. Le piante giovani vengono tolte dal contenitore, avendo

10

cura di togliere i residui del terreno di coltura.

È importante lavorare con cura per non

danneggiare le radici e le foglie, affinché le

piantine rimangano sane e possano subito

iniziare a crescere con forza. Già in questa

fase di trapianto è importante selezionare le

piante in diverse grandezze e per numero di

radici. Si può avere una quantità enorme di

piante tutte identiche tra loro pronte per il

mercato. Si possono utilizzare le colture in

vitro anche per le piante forestali che sono

fondamentali per la riforestazione. Si

producono anche piante di interesse agronomico.

Conservazione

Preso atto dell’erosione genetica o rischio di estinzione di un certo taxon si

in situ

programmano le strategie di conservazione più idonee al caso: conservazione e

ex situ.

conservazione Conservazione in situ: protezione delle specie nel loro ambiente

naturale. Conservazione ex situ: protezione del germoplasma rimosso dall’ambiente

naturale e conservato in collezioni.

Conservazione ex situ

Criteri che giustificano la coltivazione ex situ di una specie selvatica minacciata:

La specie è minacciata su grandi areali

 Determinate popolazioni di queste specie sono compromesse in modo

 irrimediabile

Esistono siti naturali o di sostituzione idonei alla reintroduzione delle specie

 coltivate

Oltre a mantenere le risorse genetiche esistenti, la conservazione ex situ è funzionale

anche ad altri importanti obiettivi:

Fornire popolazioni di riserva o stock da utilizzare per consentire la

 sopravvivenza delle specie durante le fasi di reintroduzione e ripopolamento o

per favorire il recupero e la riabilitazione degli habitat

Assicurare, attraverso lo stoccaggio a lunga scadenza, materiale per bisogni

 futuri

Sviluppare nuove cultivar, razze e ceppi durante i programmi di miglioramento

 genetico

Cosa sono le banche del germoplasma? Sono strutture specializzate nella

conservazione di parti di organismi viventi idonei a rigenerare un organismo completo.

Il materiale vegetale conservato nelle banche del germoplasma può essere suddiviso

in: Collezioni di semi, principalmente per le specie a preminente propagazione

 gamica

Collezioni clonali, principalmente per le specie di propagazione vegetativa

Produzione semi sintetici 11

Cosa si intende per semi sintetici? Si è iniziato a parlarne intorno agli anni ’70.

Non tutte le piante hanno semi vitali, ci possono essere o delle specie o dei singoli

individui che per qualche mutazione formano semi non vitali. Si è pensato intorno agli

anni ’70 di fare dei semi sintetici che permettessero la propagazione della piante con

semi non vitali. L’idea è quella di produrre degli embrioni e di incapsularli in una

matrice sintetica. Gli embrioni li produco in vitro, prendo un espianto, lo induco a callo

e da qui si ha l’embriogenesi modulando la presenza ed il rapporto degli ormoni. Gli

embrioni li stacco dal callo e li metto in una soluzione ad esempio di arginato di sodio

nella quale viene inglobato l’embrione. L’arginato di sodio per formare una capsula lo

devo inserire in CaCl 100mM, ovvero una soluzione complessante per circa 30 minuti.

2

L’arginato di sodio in CaCl forma una sfera e la matrice di incapsulazione che contiene

2

l’embrione forma delle strutture rotondeggianti con all’esterno la capsula e all’interno

l’embrione. Lavaggio in H O per circa 20 minuti. Poi metto la capsula in terra e da

2

questa fuoriesce la piantina. All’interno della capsula si possono mettere altre cose ad

esempio antibatterici (antibiotici), perché? Perché quando la capsula si scioglie per

permettere la germinazione della piantina la presenza di antibiotici permette di avere

nel terreno un circondario meno nocivo per la piantina. Posso aggiungere anche degli

stimolatori della crescita. I semi sintetici non vengono molto usati perché costano

molto rispetto ad esempio alla micropropagazione.

Risanamento da virus

I virus si possono trasmettere da pianta a pianta per contatto, per seme, per polline,

per propagazione vegetativa, per mezzo di funghi e per vettori animali. Se una pianta

ha delle virosi queste possono passare nel seme e trasmetterle alla generazione

successiva. Non essendo le malattie virali curabili con trattamenti in campo l’unico

modo per controllarle rimane la prevenzione. Per contrastare l’infezione si usa la

prevenzione. I meristemi apicali (cellule deputate alla moltiplicazione dell’apice) sono

nella maggior parte dei casi virus-free, non vengono contaminate, probabilmente

perché si sviluppano molto rapidamente.

Colture cellulari

Le colture cellulari vengono utilizzati per lo studio di metaboliti secondari importanti

dal punto di vista industriale e farmaceutico. I metaboliti secondari appartengono a 3

classi di composti chimici:

Alcaloidi

 Fenoli

 Terpeni

I metaboliti secondari giocano spesso un ruolo nella difesa chimica della pianta. Le

piante producono queste sostanze in condizioni limitate, mettendole in coltura si ha

una produzione più abbondante. Ad esempio il taxolo inibisce la depolimerizzazione

della tubulina e blocca la mitosi e impedisce così la proliferazione delle cellule

tumorali.

Il taxolo, inibendo la depolimerizzazione della tubulina, provoca il blocco della mitosi e

impedisce così la proliferazione delle cellule tumorali. Il taxolo è accumulato

soprattutto nella corteccia e l’estrazione diretta comporta la distruzione della pianta.

Le cellule in coltura possono essere utilizzate come fabbriche di sostanze utili per

l’industria farmaceutica, agroalimentare, cosmetica, etc. L’estrazione diretta dei

12

metaboliti di interesse spesso comporta la distruzione della pianta e ciò può risultare

problematico nei casi in cui la specie è:

Rara (difficile da reperire e/o protetta)

 Di difficile coltivazione

 A crescita lenta (piante legnose)

Vantaggi della produzione in vitro dei metaboliti secondari:

Stabilizzazione ed ottimizzazione della produzione attraverso variazione delle

 condizioni colturali e nutrizionali

Indipendenza dalla stagionalità

 Selezione di linee cellulari altamente produttive

 Produzione di nuove molecole

Biotrasformazioni

Uno dei principali fattori limitanti per la biosintesi di questi metaboliti è rappresentato

dalla biodisponibilità di precursori. Somministrazione di precursori a basso costo ->

produzione di composti ad alto valore.

Elicitazione

Le piante sono in grado di produrre, in seguito a stress, metaboliti secondari coinvolti

nella difesa chimica. Somministrazione di elicitori -> incremento di produzione. Diversi

composti (elicitori) mimano stress biotico o abiotico inducendo una risposta difensiva.

Alcuni elicitori largamente impiegati sono acido giasmonico, acido acetil salicilico ed

estratti di lievito.

Interesse applicativo

Non sempre le cellule in coltura, indifferenziate, producono i metaboliti di interesse,

talune vie biosintetiche sono:

Cellula-specifiche: si esprimono solo in cellule specializzate

 Tessuto-specifiche: sono espresse in specifici tessuti

 Organo-specifiche: sono localizzate in uno specifico organo

Coltura di protoplasti

Differenze cellule vegetali vs animali: parete cellulare, cloroplasti (fanno parte della

famiglia dei plastidi, svolgono funzione vessillifera, nelle foglie si chiamano

cromoplasti, accumulano dei pigmenti colorati), vacuolo.

Parete

Dà una tipica forma rettangolare nelle cellule della foglia, è una struttura più rigida

della membrana e anche più resistente, è permeabile perché le cellule devono

comunicare. Ha un’importante funzione di sostegno, determina la forma cellulare,

regola i processi di trasporto, in quando molecole piccole ed idrofile (acqua,

saccarosio, potassio ed ormoni come le auxine) possono liberamente permeare.

Partecipa anche al riconoscimento fra le cellule. È formata principalmente da cellulosa

(9-25%), associata con emicellulosa (20-50%), da pectina (10-35%) e proteine

strutturali (estensive e lectine, 10%). La lamella mediana che tiene unite le varie

cellule è formata da sostanze pectiche. È possibile avere delle cellule vegetali vitali (in

protoplasti.

coltura) prive della parete -> si ottengono cellule chiamate Inizialmente si

ottenevano con un taglio meccanico, procedimento lungo e di bassissima efficienza.

13

Come si fa? Si prendono le cellule vegetali e si mettono in mannitolo 0.5 M

(concentrazione abbastanza alta). Il vacuolo è così gonfio da far aderire la membrana

alla parete. Tagliando la cellula con un bisturi si tagliano la parete, la membrana e il

citoplasma -> si distrugge la cellula! Quindi si mette la cellula in una sospensione

ipertonica -> la membrana si stacca dalla parete, quindi tagliando successivamente

con un bisturi si può avere la possibilità di non tagliare anche il citoplasma ma di

riuscire a tagliare la parete e a far fuoriuscire il protoplasto. Il tempo di plasmolisi è di

circa 30 minuti-1 ora. Con la plasmolisi si permette alle cellule di adattarsi alla

pressione osmotica generata dal monosaccaride e di prepararsi alla digestione

enzimatica distaccando il plasmalemma della parete cellulare. Adesso invece si

digerisce enzimaticamente. Si prende il tessuto, lo si mette a contatto con la pectinasi

e si ha la digestione della lamella mediana, poi si aggiunge cellulasi e si elimina la

parete e si ottengono i protoplasti. Nella beuta avrà i protoplasti, cellule vegetali con

ancora la parete e anche ammassi cellulari, quindi bisogna isolare nel brodo ciò che mi

interessa. Problema: purificare i protoplasti che ho prodotto. Per prima cosa però devo

vedere se la digestione è andata a buon fine, perché non ha senso procedere con la

purificazione dei protoplasti se nella beuta ho uno scarso numero di questi. Quindi

dopo aver proceduto alla stima del numero di protoplasti isolati con l’ausilio di una

camera contaglobuli (attraverso la conta al microscopio), i protoplasti si raccolgono

per centrifugazione e si aggiunge il mezzo di coltura sino a portare la densità di

-1

protoplasti attorno a 100 protoplasti a ml . Bisogna regolare l’osmolarità del mezzo

per evitare che i protoplasti scoppino o che collassino su se stessi, bisogna avere

l’osmolarità del mezzo molto simile a quella delle cellule; si fa tramite mannitolo 0.3

M, saccarosio 0.05 M, CaCl 1gl-1 o ormoni. Le cellule diventano tonde. Per purificare si

2

centrifuga molto blandamente perché i protoplasti sono molto delicati dato che non

hanno più la parete. Nella provetta in superficie sono presenti i protoplasti purificati, si

recuperano con la pipetta e si mettono in coltura. I protoplasti sono vitali o no?

Devo verificare questa cosa! Come si stabilisce? Con dei test colorimetrici: con

Evans Blue che colora le cellule morte, diventano blu o fluorescenti, oppure con

fluoresceina diacetato, in questo caso sono fluorescenti le cellule vive. Se la % di

protoplasti vitali è buona si va avanti con la coltura, al contrario si butta tutto e si

ricomincia. Quindi quelli purificati si mettono in coltura tenendo conto della pressione

osmotica e si lasciano per circa 1 settimana, perché i protoplasti ci mettono circa 1

settimana per ambientarsi. La prima cosa che fanno è che rigenerano la parete! Dopo

una settimana si riduce la pressione osmotica del mezzo riducendo la concentrazione

di mannitolo. Una volta che il protoplasto ha depositato la parete può cominciare a

dividersi e forma delle micro-colonie che poi nel tempo vanno a formare dei micro-calli

e poi i calli! Ogni singolo callo è stato ottenuto a partire da ogni singolo protoplasto. È

possibile ottenere un callo ed una pianta completa da una singola cellula vegetale.

Fusione dei protoplasti 14

Quando si mettono in coltura si erano osservati fenomeni spontanei di fusione nel 10-

ibridazione somatica!

15% dei protoplasti in coltura, vanno a formare ibridi -> La

cellula finale che ha un’unica membrana all’interno ha due nuclei e 4 diversi corredi

citoplasmatici (corredo genomico citoplasmatico, cloroplasto + mitocondrio sono

portati solo dalla cellula uovo, quindi eredità materna!) [Il polline partecipa alla

formazione dello zigote solo con il corredo nucleare!]. Se parto da due protoplasto che

si fondono perché parlo di 4 corredi citoplasmatici? Entrambi hanno un nucleo,

cloroplasti e mitocondri -> quando si fondono la cellula che ne deriva avrà: nucleo,

cloroplasti e mitocondri da entrambe le cellule -> quindi 2 nuclei e 4 corredi

citoplasmatici da cloroplasti e mitocondri di entrambe le cellule!

eterocarionte,

Ciò che si forma dalla fusione si chiama se si hanno ibridi simmetrici

con eterogenomi. Ma si possono avere anche forme parziali: assenza di fusione, auto-

fusione (omogenomi), ibridi citoplasmatici (fusione molto parziale, la cellula ha nucleo

della petunia, mitocondrio petunia, ma mitocondri e plastidi del tabacco, no nucleo

tabacco), addizione parziale citoplasmatica, ibridi asimmetrici (eliminazione

cromosomica). A me interessano però gli eterocarionti! La fusione totale di due nuclei

e di due citoplasmi dà sbilanciamento e

incapacità di duplicazione. Si osserva spesso la

perdita spontanea di uno dei due genomi

durante la rigenerazione (non durante lo

sdifferenziamento) fase durante la quale si

evidenziano fenomeno di instabilità genomica. Si

ha: ibrido citoplasmatico o cibrido se uno dei

due nuclei è completamente rimosso.

Interessante per l’acquisizione di nuova

informazione citoplasmatica ibridazione

asimmetrica con eliminazione incompleta alcuni

caratteri del partner sono mantenuti.

Come si isolano?

Selezione visiva, citometria a flusso più

cell sorting. Permette di separare gli eterocarionti sulla base della fluorescenza

differenziale. Eccitati da una fonte laser, i protoplasti assorbono energie a ne

riemettono una parte come fluorescenza. Questa, raccolta e misurata, permette

di separare i protoplasto. I protoplasti possono essere già naturalmente

fluorescenti o resi fluorescenti con cromofori

Separazione sulla base di caratteristiche fisiche, gradienti di densità

 permettono una buona separazione a patto che la densità sia diversa dai

protoplasti parentali e dai prodotti di fusione omologhi

Complementazione genica di deficienze recessive, si utilizzano linee

 cellulari che portano mutazioni che forniscono per complementazione prodotti di

fusione capaci di crescere su terreno selettivo. Per esempio due linee cellulari

resistenti a sostanze tossiche diverse per cui sono l’ibrido resiste ad entrambe.

È possibile trattare a priori i parentali con inibitori irreversibili di proprietà

enzimatiche: solo la complementazione delle attività enzimatiche non inibite

fornisce la possibilità di crescere al solo prodotto di fusione.

La fusione somatica è stata applicata per ottenere ibridi somatici tra piante

appartenenti a specie e/o generi incompatibili nelle quali l’ibridazione per via sessuata

15

è estremamente difficile o impossibile. È un messo di scambio genetico che permette

di superare le barriere di incompatibilità sessuale che rendono impossibili incroci

sessuali tra piante appartenenti a gruppi tassonomici diversi.

Queste osservazioni hanno destato un grande interesse anche teorico, ma soprattutto

applicativo. Perché? Il più grande problema dell’agricoltura è ottenere delle piante

che siano il più vicino possibile ai nostri interessi, ovvero migliorare alcuni caratteri

che a noi interessano. Si cerca di ottenere piante che resistono in maniera più elevata

a variazioni biotiche e abiotiche. Per rendere il frumento più resistente al freddo

cosa posso fare? Ci si prova con incroci con piante resistenti al freddo. Bisogna

trovare il progenitore che ha questa caratteristica e poi il procedimento di inserimento

dei geni è molto molto lungo. Ad esempio, pianta moderna caratterizzata da

un’elevata produzione, elevata qualità e chicchi molto grandi, ma non resiste al

freddo. Progenitore caratterizzato da scarsa produzione, scarsa qualità e chicchi molto

piccoli, ma resiste al freddo. Tutte queste caratteristiche derivano dal genoma.

Incrociando queste due piante si possono ottenere le caratteristiche migliori, quindi le

caratteristiche della pianta moderna con la resistenza al freddo della pianta

progenitrice. Quindi si ha la riacquisizione di tutti i caratteri positivi originari della

pianta. La fusione dei protoplasti è sembrata una buona scappatoia in quanto

potrebbe essere più veloce. Ad esempio fusione tra protoplasto del frumento e della

patata (resiste al freddo), non è fondamentale un’ibridazione simmetrica. La fusione

somatica è stata applicata per ottenere ibridi somatici tra piante appartenenti a specie

e/o generi incompatibili nelle quali l’ibridazione per via sessuata è estremamente

difficile o impossibile. È un mezzo di scambio genetico che permette di superare le

barriere di incompatibilità sessuale che rendono impossibili incroci sessuali fra piante

appartenenti a gruppi tassonomici diversi. Si sono cercati anche dei metodi per

valutare l’efficienza di fusione che normale è intorno al 10-15%, come si fa per

aumentare? Si stimola l’avvicinamento delle cellule:

Mediante aggiunta di ioni calcio e PEG, fusione fino al 40%

 Elettrofusione: un campo elettrico provoca la rottura della membrana e facilita i

 fenomeni di fusioni fino al 60% di protoplasti fusi

Variazione somaclonale

A partire un espianto, posso metterlo in coltura, questo rigenera e si possono avere

migliaia di piante tutte cloni della pianta madre. Ma questo non è del tutto vero!

Perché in alcuni casi si sono osservate delle alterazioni, nelle piante figlie anche

macroscopicamente ci possono essere delle diversità. Perché questo? Perché

comunque il passaggio in coltura e i passaggi ormonali sono degli shock che possono

portare a dei riarrangiamenti a livello del genoma. Ci possono essere aberrazioni

cromosomali:

Alterazioni nel numero e nella struttura dei cromosomi

 Riarrangiamenti cromosomici

 Differenze nel numero di copie di sequenze di DNA (amplificazione o

 diminuzione di sequenze ripetute)

Metilazione del DNA

Questi effetti possono essere indotti o possono essere già presenti all’interno della

cellula che io metto in coltura, quindi possono essere pre-esistenti o indotti. Per

quanto riguarda quelli pre-esistenti, l’espianto non è geneticamente uniforme e le

cellule possono variare in ploidia e in altre caratteristiche genetiche, mutazioni

16

somatiche pre-esistenti nella pianta. Per quanto riguarda quelle indotte, il de-

differenziamento e la successiva rigenerazione sottopongono il genoma a una

condizione di stress.

Somaclonali: hanno differenze a livello della coltura in vitro.

Evidentemente, la variazione somaclonale è un fenomeno negativo nella propagazione

clonale, laddove si vogliono ottenere attraverso la moltiplicazione vegetativa di più

copie di un dato genotipo. In questo caso la variazione somaclonale è un aspetto

critico e negativo da limitare il più possibile e da tenere sotto controllo. La variazione

somaclonale ha anche una valenza positiva, laddove l’intento sia quello di aumentare

disponibilità di mutanti utili da introdurre come linee nuove in programmi di

miglioramento genetico. Una grossa percentuale delle variazioni casuali presentano

caratteristiche sfavorevoli, ma con bassa frequenza compaiono mutanti di interesse

per il miglioramento vegetale.

In un singolo esperimento in vitro si lavora con milioni di cellule, fra cui molte saranno

mutate. Inoltre, la frequenza di variazioni genetiche può essere aumentata:

Mediante radiazioni ionizzanti raggi X

 Mediante mutageni chimici

Sia su protoplasti, cellule, calli. La frequenza di variazioni aumenta all’aumentare della

dose mutagena, ma oltre un certo valore soglia si hanno effetti collaterali indesiderati

quali la diminuzione della capacità rigenerativa. Naturalmente le mutazioni sono tanto

più efficaci quanto più le cellule sono a contatto con l’agente mutageno. Quindi ideali

sono colture di protoplasti. Quindi un fattore negativo per il mantenimento e la

propagazione clonale di specie selezionate diventa uno strumento prezioso per

aumentare la variabilità genetica.La variazione somaclonale è fonte di larghissima

variabilità genetica che viene sfruttata per aumentare la disponibilità di mutanti da

introdurre come linee nuove in programmi di miglioramento genetico.

TRASFORMAZIONE GENICA

Cosa si intende? Si isola un gene e questo gene lo si inserisce in un genoma e si fa

questo per vari motivi. Ho isolato un certo gene perché ho lavorato e penso che quel

gene sia importante per la resistenza a patogeni. Le prove provate sono due? Io

inattivo quel gene e vedo che la pianta è più soggetta ad attacco da patogeni oppure

attivo quel gene e vedo che quella pianta è più resistente a patogeni. La

trasformazione genica è un insieme di tecniche che permettono:

Ottenimento del gene esogeno

 L’inserimento di un gene esogeno di interesse all’interno di un genoma ospite

 La sua integrazione stabile all’interno del genoma ospite

 La sua espressione corretta nel sistema della cellula ospite, è fondamentale che

 il gene si esprima

La sua trasmissione mendeliana alla progenie

Le tecniche di trasformazione sono molto utili per la ricerca di base. La prima cellule

vegetale resistente agli antibiotici è stata prodotta dalla Monsanto nel 1982. La prima

pianta transgenica è stata invece prodotta nel 1983. Le piante transgeniche sono uno

strumento: 17

Per verificare e studiare attraverso l’introduzione e l’espressione specifica di

 geni nelle cellule vegetali, ipotesi concernenti la funzione del loro prodotto

genico (genomica funzionale)

Da un punto di vista applicativo, produrre linee di piante in grado di esprimere

 geni per caratteri più desiderabili da un punto di vista agronomico

Il metodo di trasformazione ideale deve:

Essere efficiente

 Indipendente dalla specie vegetale e dal genotipo

 Veloce

 Semplice

 Poco costoso

 Prevedere fasi di coltura in vitro il più limitate possibili, per motivi di tempo e

 per problemi di variazione somaclonale, non è qualcosa che si va a cercare

Due tipi di trasformazione: stabile e transiente.

Stabile

Metodo biologico e metodi che si basano sulle caratteristiche fisiche. Il metodo

Agrobacterium tumefaciens

biologico utilizza per inserire il gene. Quelli fisici sono:

microiniezione, gene gun, elettroporazione, carbon nanotube.

Transiente

Posso andare a vedere l’effetto del transgene anche se non si inserisce nel genoma

ospite; vado ad utilizzare dei vettori diversi, ad esempio virus (si moltiplicano nel

citoplasma della cellula e qui sono attivi) o utilizzo l’agroinfiltrazione. Altro sistema:

CRISPs CAS, metodo di miglioramento.

Metodi biologici si basano sulle caratteristiche di organismi viventi che permettono di

fare questa trasformazione e ci sono anche metodi fisici che sono un po’ bruschi.

l’Agrobacterium tumefaciens

Principale strumento è che è un ingegnere genetico

naturale.

Agrobacterium

Fa parte del genere Agrobacterio, ci sono vari generi e tutti appartengono alla famiglia

delle rizobiacee, è un batterio gram negativo del suolo. Cosa fa? È un patogeno per

molte (circa 60%) dicotiledoni e solo per 5 monocotiledoni. La dicotiledone è un seme

caratterizzato da due cotiledoni e quando germina si formano le prime foglioline

(dicotiledoni), un esempio sono i fagioli (due cotiledoni e all’interno l’embrione). Nelle

monocotiledoni all’interno del seme non si distinguono due parti distinte, ad esempio il

mais, nella punta c’è l’embrione, di questo gruppo fanno parte tutti i cereali. Tutti i

cereali hanno una grande importanza a livello alimentare, sono la base

dell’alimentazione umana e forniscono gran parte delle calorie necessarie e anche dei

Agrobacterium

micronutrienti necessari. Il fatto che non trasformi le monocotiledoni

non è un gran vantaggio! Agrobacterium

Perché si parla di infezione/attacco? Perché laddove infetta la

pianta si formano delle masse che ricordano un po’ la morfologia di un callo, una

massa di cellule che cresce piuttosto velocemente senza una morfologia definita.

Questi ammassi cellulari vengono chiamati galle. Cos’è il colletto? La parte che è

all’interfaccia tra la parte sovrastante il suolo e il suolo. 18

Agrobacterium attacca molte dicotiledoni e quindi è stato molto studiato fin dagli inizi

del ‘900. È un patogeno che è stato studiato per motivi agronomici.

Agrobacterium vitis Agrobacterium rubi

provoca galle nella vita, provoca la galla in

rovi-more.

Le prime osservazioni risalgono nel 1853, dalle galle si è visto che un batterio era la

causa di questa formazione. All’inizio del ‘900 questi batteri sono stati isolati -> è

stata punta la galla e l’ago è stato utilizzato per inoculare una piastra Petri. Sulla

piastra Petri con un terreno di coltura si è visto che crescevano dei batteri. Quando

questi batteri sono stati ripresi e inoculati in una pianta sana si è formata una galla

L’agente eziologico di questa galla è un batterio!

anche in questa. Fra il 1930 e il 1950

ci sono stati altri studi. Le galle sono anche chiamate tumori, perché hanno l’aspetto di

un tumore, perché come le cellule del tumore si moltiplicano velocemente senza una

Agrobacterium

determinata morfologia. Gli steli di Cataranto sono stati inoculati con

tumefaciens, incubati a RT (temperatura nella quale vivono i batteri) per 4 giorni ed

esposti quindi per 5 giorni a 47°C per uccidere i batteri. Il batterio non vive oltre una

certa temperatura mentre il cataranto sì. Poi si è andati a verificare se il batterio,

anche se eliminato, formava lo stesso lo galla, per verificare se la sua presenza era

necessaria durante tutto il periodo oppure no. Anche se il batterio era stato eliminato

si è osservata la formazione della galla. Quindi la presenza dei batteri non è

necessaria dopo due giorni dall’infezione. Dopo i 5 giorni a 47°C i tumori sono

indipendenti dalla presenza del batterio, quindi cosa vuol dire? Vuole dire che in

qualche modo il batterio ha alterato le cellule ospiti trasferendo un qualche fattore al

loro interno che permette comunque lo sviluppo della galla.

Seconda osservazione: i tessuti della galla crescono in coltura in vitro senza

aggiunta esogena di fitormoni. Quando metto in coltura degli espianti vegetali devo

mettere degli ormoni, se voglio far sviluppare un callo devo mettere una certa quantità

di auxine e citochinine, stessa cosa per le radici. Le galle riescono a crescere in vitro

molto bene in un terreno senza ormoni. Se poi vado a fare un dosaggio all’interno del

tessuto di auxine e di citochinine trovo un livello molto alto di questi ormoni anche se

non li ho messi! È possibile per la cellula di una galla acquisire una crescita autonoma

grazie all’acquisizione di un sistema di sintesi delle sostanze di crescita (=fitormoni).

Terza osservazione: non solo in coltura, le galle producono composti che sono

sconosciuti in natura vegetale e sono chiamate opine. Vuol dire che nessun tessuto

vegetale tranne la galla produce questi composti che sono abbastanza complessi e

diversi. (1968)

Fra gli anni ’60-’70 ci sono altri studi che hanno portato alla quarta osservazione: non

Agrobacterium

tutti i ceppi di sono capaci di produrre la galla. Quelli capaci di indurre

una galla sono chiamati virulenti, quelli non capaci sono chiamati avirulenti. Tutti i

ceppi virulenti possiedono oltre al DNA normale possiedono anche un plasmide. Tutti i

ceppi che sono capaci di indurre una galla hanno un plasmide. È stato possibile

dimostrare che togliendo questo plasmide da un ceppo virulento questo ceppo diventa

avirulento. Viceversa se il plasmide lo metto in un ceppo avirulento produco batteri

che hanno la capacità di indurre la galla. Il plasmide è stato chiamato TI (=plasmide

che Induce il Tumore). Plasmide studiato mediante mutagenesi, sono stati

mutagenizzati i vari blocchi e si è visto cosa comportava.

Com’è fatto il plasmide Ti? Plasmide di grosse dimensioni che può arrivare fino ad

800 kb (da 200 kb in funzione dei vari ceppi) ed è scomponibile in vari blocchi

funzionali. 19

Origine di replicazione

 Regione di virulenza, serve per l’induzione della galla (VIR)

 Grossa regione che viene chiamata T-DNA

 Regione di catabolismo delle opine

T-DNA

Mutagenizzando questa regione si osservava la formazione sempre di tumori, ma con

morfologie molto diverse. Quindi mutazioni nella regione vir provoca della galle con

morfologia alterata. Le due estremità di questa regione sono LB (Left Border) e RB

(Right Border) che sono sequenze di 25 bp quasi completamente identiche e sono le

due estremità di una parte del DNA che viene excisa dal plasmide e trasferita

all’interno della cellula vegetale. Come avviene questa excisione? È tutto a carico di

proteine sintetizzate dal plasmide Ti, questo produce tutte le proteine di enzimi

necessari per l’excisione del T-DNA dal plasmide fino all’interno del nucleo della cellula

vegetale. Questi enzimi responsabili dell’excisione e del trasferimento del DNA sono

contenuti all’interno della regione VIR, quindi se si altera questa regione inibendo la

funzione di alcuni geni e quindi di alcune proteine che operano il trasferimento questo

non avrà più luogo.

Regione VIR È su un’altra parte del plasmide, ma non viene trasferita.

I prodotti genici di questa regione non agiscono in cis ma

in trans; quindi il T-DNA è un elemento mobile che viene

mosso, regione mobile ma non trasponibile. La regione

VIR contiene 25 geni classificabili in 8 operoni che

codificano per funzioni essenziali per il trasferimento del

T-DNA all’interno della cellula vegetale. Vir A, vir B, vir C,

vir E, vir G sono gli operoni essenziali; vir F e vir H non

sono operoni essenziali; vir A e vir G sono gli unici

operoni costitutivi, gli altri sono tuti inducibili.

Meccanismo di infezione

Fase di adesione L’Agrobacterium

-> aderisce alla parete vegetale e si ha la sintesi e

Agrobacterium

la secrezione di polisaccaridi per l’ancoraggio. Le proteine di implicate

chv A

nell’ancoraggio alla cellula vegetale sono i prodotti genici di un insieme di geni:

chv B

e (chromosomal virulence) -> sintesi e secrezione dei polisaccaridi coinvolti

Att

nell’adesione alle cellule vegetali. ->legame con recettori (carboidrati e proteine)

Cell

della parete della cellula vegetale. -> biosintesi di cellulosa coinvolta

Agrobacterium

nell’aggregazione e colonizzazione. I geni cromosomiali di partecipano

alla trasmissione del T-DNA nelle cellule vegetali. Cosa succede se inattivo questi

geni per l’adesione? L’efficienza di infezione cala perché non tiene molto forte,

l’infezione però ha comunque luogo.

Quorum sensing Agrobacterium

-> sfrutta i meccanismi di difesa delle piante per

individuare piante potenzialmente suscettibili a infezione.

Le piante (dicotiledoni) sono degli organismi sessili, quindi che sono fermi in un posto

e quindi in quel posto devono far fronte a tutto quello che succede. Quindi attivano

diverse risposte: 20

Cercano di produrre dei composti del metabolismo secondario che abbiano delle

 capacità antibiotiche, perché attraverso una ferita si può avere un’infezione

ulteriore di batteri.

Meccanismi di riparo del punto della lesione che si basano su:

 Attiva divisione cellulare

o Sintesi di polisaccaridi di parete e di lignina. Questo processo è

o accompagnato da sintesi di zuccheri, composti fenolici, flavonoidi, pH

acetosiringone e

acido (5.0-5.8). Fra i composti fenolici ci sono

idrossiacetosiringone. Guarda le formule. L’acetosiringone è una piccola

molecola rilasciata dalla dicotiledoni dopo la ferita ed entra a far parte

della parete.

Agrobacterium infetta molto meglio tessuti vegetali che sono stati feriti perché in

seguito alla lesione non ho più la parete e ho una barriera in meno che deve superare

Agrobacterium. Agrobacterium sente attraverso il gradiente la concentrazione la

presenza di acetosiringone e si muove per andare a raggiungere le cellule vegetali

lesionate in modo da poterle infettare. Le radici essudano molti composti chimici che

Agrobacterium.

sono riconosciuti dal microbiota del suola, riconosciuti da Come

avviene poi l’infezione? È un processo complesso nel quale sempre l’acetosiringone ed

Agrobacterium

altri composti hanno un ruolo importante. sfrutta le difese della pianta

per attaccare. L’acetosiringone viene riconosciuto da vir A (operone della regione VIR),

che è una proteina della membrana vegetale. Gli zuccheri (prodotti dalla pianta ferita)

Agrobacterium),

vengono legati da chv E (prodotta dal cromosoma di poi si lega a vir A

e serve per amplificare il segnale che arriva su vir A dall’acetosiringone. Come fa la

proteina vir A a sentire e a rispondere all’acetosiringone? Vir A è un recettore

chinasico, formato da circa 830 aa ed è una proteina transmembrana e ha 5 domini

funzionali:

Regione periplasmatica

 2 domini transmembran

 Regione linker

 Dominio citoplasmatico che ha capacità di autofosforilazione su un residuo di

 istidina e ha anche un dominio inibitore

La proteina vir A quindi è fatta in questo modo. In presenza di AS la repressione che è

esercitata dal dominio inibitore R viene rilasciata e la proteina vir A si autofosforila ed

è in grado di cedere il fosfato ad una proteina completamente interna (prodotta da vir

G) che è una proteina completamente citoplasmatica. Vir G si attiva per fosforilazione

da vir A e inizia una cascata di reazioni. È un sistema due componenti: vir A e vir G, vir

A sente le modifiche nell’ambiente, riesce a cambiarsi e a cambiare un’altra proteina,

quindi viene attivata a dà l’innesco a una serie di reazioni. Più vir G è fosforilato più

azione farà questo. Vir G viene fosforilato su un residuo di asparagina, una volta

attivato cosa fa? Diventa un fattore di trascrizione, è in grado di legarsi a tutti i

promotori che sono a monte della regione VIR. Quindi i geni inducibili vengono indotti

e sono più espressi vir A e vir G. il tutto è messo in moto dalla presenza di AS (difesa

della pianta). I geni vir sono silenti in assenza di segnale dalla cellula vegetale, vir A e

vir G sono costitutivamente espressi a bassi livelli. Il pH acido a che cosa serve? Il pH

viene percepito da una proteina chiamata chv G (potrebbe essere un sensore di pH),

questa proteine si fosforila, poi fosforila chv I che poi fosforila vir G e poi va ad attivare

la cascata di eventi di VIR, è in grado di attivare i geni cromosomiali di virulenza.

Vir D 21

Silente normalmente, attivato da vir G. Vir D2 è prodotto da vir D ed è una nucleasi

che taglia il T-DNA alle sequenze border. Quindi viene prodotta una singola elica di

DNA che si chiama filamento D, singolo strand di DNA. Ad una delle due estremità del

filamento che viene exciso resta covalentemente legata la proteina D2. Questo singolo

strand sarà quello che poi andrà all’interno del nucleo della cellula vegetale. Vir D2 si

lega al 5’ dello strand.

L’apparato di trasferimento del T-DNA

Fatto da più proteine che vengono prodotte dal vir B. L’operone vir B ha circa 11 geni e

uno di questi produce una proteina ha la capacità di produrre ATP perché ha attività

ATPasica, il passaggio di T-strand attraverso il canale prodotto da queste proteine

richiede energia. Nella cellula vegetale lo strand viene ricoperto dal prodotto

dell’operone E. La proteina vir E viene prodotta all’interno di Agrobacterium ma esplica

la sua funzione all’interno della cellula vegetale, non si sa se passa all’interno dello

stesso canale. Ma nel citoplasma della cellula ospite copre completamente lo strand e

lo protegge dalle nucleasi. Vari ruoli di Vir E2:

Protegge il T-strand dalla degradazione

 Lo mantiene in forma bastoncellare

 Partecipa nel trasporto verso il pilus

 Interagisce con chaperones vegetali nel citoplasma della cellula vegetale

 Targhetta il T-strand nel nucleo

 Interagisce con fattori nucleari

La proteina Vir E ha dei segnali di locazione cellulari vegetali, una proteina batterica si

è evoluta in modo tale da contenere dei segnali di riconoscimento per l’entrata nel

nucleo di una cellula eucariotica vegetale mentre la proteina è batterica. Il T-strand è

un insieme di proteine batteriche, quindi come può entrare in una cellula eucariotica?

Lo scoprirai!! Vir E2 ha due NLS (Nuclear Localization Signal) specifici vegetali. Gli NLS

di Vir D2 e Vir E2 non localizzano nel nucleo di lieviti. Ci sono degli specifici recettori

sul nucleo della cellula vegetale che riconoscono Vir D2 grazie a delle sue

caratteristiche. Una volta che il T-DNA entra nel nucleo viene replicato in double strand

e viene integrato all’interno del DNA vegetale. Il meccanismo preciso non è chiaro,

l’inserimento sembra del tutto casuale. Si possono inserire nel genoma della cellula

vegetale anche due o più T-DNA, quando ciò accade le diverse copie di T-DNA si

possono trovare in un unico locus (cosa che accade) o in loci differenti.

Il sito di integrazione del T-DNA è casuale. Uno, due o più T-DNA si possono integrare

nel genoma di una singola cellula vegetale. Quando ciò accade, le diverse copie di T-

DNA si possono ritrovare:

In un unico locus

 In loci differenti, sullo stesso o su un altro cromosoma

Una volta integrato nel genoma vegetale, il T-DNA con tutto quel che contiene, si

comporta come il DNA della pianta, è stabile e viene trasferito alla progenie.

La regione del T-DNA

Agrobacterium sente tutta una serie di composti che la cellule vegetale (delle

dicotiledoni) emettono quando sono ferite, uno di questi composti infetta la pianta,

l’infezione è a carico solo dei geni VIR, alcuni di questi prodotti genici (2) sono

costitutivamente espressi gli altri sono indotti. Un singolo strand del DNA del plasmide

Ti viene exciso e viene inserito all’interno del genoma della cellula vegetale. Una volta

22

dentro il nucleo viene replicato e diventa doppio strand. Tutto il passaggio è controllato

da proteine VIR responsabili del canale tra cellule batterica e cellula vegetale e quelle

che aderiscono al T-DNA per proteggerlo da esonucleasi vegetali e per permettergli

l’entrata nel nucleo perché queste proteine hanno uno o più NLS. Ma cosa contiene

questo pezzo di DNA che viene trasferito dalla cellula batterica a quella vegetale? Per

Agrobacterium

quale motivo elabora tutto questo processo? Questa regione (quella

trasferita, inserita) è compresa tra LB e RB (se induco una mutazione in queste due

regioni non si ha la formazione di un tumore). Ci sono 3 tipi di regioni:

Shi, Shoot inducing, se si va a modificare (mutagenizzare) non si osserva più il

 tumore nella sua forma tradizionale (come galla), ma osservo delle foglie. Da

isopentenilpirofosfato a isopentenil adenosina (biosintesi auxine).

Roi, Root inducing, se vado a modificare questa zona vedo che il tumore non ha

 più la forma della galla, ma assume la forma di radice. Da triptofano a indolo 3

acetammide a indolo 3 acido acetico (biosintesi citochinine).

Nos, contiene geni che codificano per le opine, molecole relativamente

 semplici che contengono del carbonio. Queste vengono sintetizzate perché solo

nel plasmide Ti c’è una regione che contiene geni per la sintesi di enzimi che

sono in grado di catabolizzare le opine.

Citochinine e auxine a livello di tessuti vegetali una promuove la formazione di parte

area e l’altra di radici. Quindi la regione Shi contiene geni per la sintesi delle

citochinine, mentre Roi contiene geni per la sintesi delle auxine. Ma perché

Agrobacterium fa tutto ciò? Per indurre una sdifferenziazione del tessuto vegetale e

una rapida crescita, le cellule si riproducono molto velocemente. Ma perché si

riproducono così velocemente? Grazie alla regione Nos, contiene geni che

codificano per le opine. Queste sono molto simili ad aa e zuccheri, sono sintetizzate

dalla pianta, ma non possono essere utilizzate dalla pianta perché questa non ha i geni

di catabolismo delle opine, possono essere utilizzate solo esclusivamente da batteri

come fonti di carbonio ed azoto, ma solo da batteri che hanno i geni per questo

Agrobacterium.

catabolismo che è solo Ci sono vari tipi di opine ad esempio l’octopina

e la nopalina.

A che cosa serve tutta questa trasformazione? Si crea una nicchia ecologica

molto favorevole perché le piante secernono le opine all’esterno che diventano

Agrobacterium.

nutrimento esclusivamente per La presenza di opine induce il

trasferimento del plasmide da un ceppo batterico ad un altro, la presenza di queste

quindi fa aumentare di molto fra ceppi virulenti e avirulenti, perché? Perché se la

presenza induce la coniugazione del plasmide di conseguenza aumenta il numero dei

ceppi virulenti.

Tutti i geni che sono compresi nel T-DNA sono localizzati all’interno di un

batterio, ma non si esprimono in esso, si esprimono solo nella cellula

vegetale quindi questi geni devono essere eucariotici! Il T-DNA si può

localizzare solo all’interno del nucleo cellulare, grazie alle proteine che

avvolgono il T-DNA perché hanno dei segnali nucleari!

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

INGEGNERIZZAZIONE DI

Osservazioni importanti

I plasmidi Ti non sono adatti, così come sono, ad essere usati come vettori di

 trasformazione, perché: 23

Sono troppo grandi, è molto difficile quindi manipolarlo in vitro, più sono

o grossi più vanno incontro (dopo purificazione ed estrazione) a delle

modificazione, a riavvolgimenti; mentre tanto è più piccolo il plasmide

tanto più facilmente è manipolabile in vitro.

Inducono tumori vegetali non rigenerabili come piante fertili.

o

Cellula vegetale -> voglio modificare il nucleo inserendo un gene diverso. Se lascio i

geni responsabili di citochinine e auxine nel nucleo e voglio aggiungere citochinine e

auxine rimango bloccata perché all’interno delle cellule il livello di citochinine e auxine

endogeno è elevatissimo. Siccome i geni all’interno delle regioni roi e shi obbligano le

cellule vegetali in grossisime quantità aux e citoc dall’esterno non è più possibile

regolare la quantità di citocc e aux perché le cellule non sentono questi stimoli, non

sentono l’aggiunta di queste. Non riesco quindi mai ad uscire dalla situazione di callo,

non riesco ad ottenere la pianta.

Nucleo con T-DNA, fatto da 3 regioni -> quindi questa cellula produce molte auxine e

citochinine, quando duplica e si riduplica forma un callo (perché lo produce la cellula

dato che è strapiena) -> questo callo se voglio rigenerarlo (esprimere delle foglioline o

delle radici) si usa mettere nel terreno di coltura delle citochinine e auxine (ma in un

rapporto leggermente sbilanciato verso una o verso l’altra ma in modo ridotto), ma se

la cellula produce al suo interno un sacco di citochinine e auxine non riesce a sentire

quelle che aggiungo da fuori. Appesantisce di molto il metabolismo delle cellule

trasformate. Queste meno sono danneggiate meglio è, anche la regione di sintesi delle

opine non va molto bene. Tutti i passaggi (induzione di callo, rigenerazione, etc.) devo

guidarli io con ciò che metto nel terreno di coltura, non voglio che siano geni endogeni

Agrobacterium

della pianta infilati da perché una volta inseriti questi geni non posso

più pilotare, modificare la mia coltura.

L’analisi molecolare dei plasmidi Ti ha dimostrato che, mentre RB e LB sono

 essenziali per il trasferimento del T-DNA, il T-DNA stesso non lo è. Il T-DNA è un

elemento mobile. Posso togliere tutto quello che non mi va bene e sostituirlo

con quello che voglio (posso sostituire Shi, Roi o Nos).

È stato dimostrato sperimentalmente (SLIDE)

Excidendo il T-DNA ho risolto il problema della formazione all’interno della cellula

trasformata elevate quantità di auxine e citochinine. Come faccio però a ridurre il

plasmide? Prima cosa che si può fare è togliere la regione di catabolismo delle opine.

Posso anche rimuovere tutta la regione, che invece è essenziale, dei geni Vir e la

posso mettere su un altro plasmide. Quindi alla fine rimane la regione Ori e la cassetta

batterica (RB e LB), si chiama plasmide mini o mini Ti. Il plasmide con la regione Vir

e l’origine di replicazione è chiamato plasmide Ti helper. Cosa succede? Si possono

Agrobacterium

comprare dei ceppi di che hanno all’interno il plasmide che porta la

regione Vir, poi lavorando con il mini Ti e metto all’interno di RB e LB i geni di

Agrobacterium.

interesse, poi inserisco il mini Ti all’interno del ceppo di Sia

Agrobacterium che mini Ti necessitano di Ori, mini Ti ha RB e LB. Servono passaggi di

apertura e ligazione, questi passaggi li faccio in E. Coli. Sul mini Ti metto due Ori, una

Agrobacterium.

per E. Coli e una per Manca ancora una cosa, ma cosa? Cosa succede

in coltura? Mancano dei sistemi per selezionare i plasmidi. Il più semplice sistema di

selezione è utilizzare l’antibiotico, metto su entrambi i plasmidi il resistente agli

antibiotici, ma devo averli entrambi e c’è il rischio che uno dei due plasmidi esca dal

batterio e quindi non mi interessa. Quindi utilizzo dei resistenti a due antibiotici

differenti, quindi se perdo uno o perdo l’altro la cellula muore perché non ha più la

resistenza al singolo antibiotico. 24

All’interno del mini Ti bisogna mettere dei polylinker perché vogliamo avere la

possibilità di digerire con tanti enzimi di restrizione. Ma perché? Perché in questo

modo si può avere uno strumento duttile, se voglio inserire un costrutto che magari

contiene una sequenza che viene digerita da un certo enzima di restrizione, nel

polylinker ne metto un altro in questo modo non taglio il costrutto di interesse. Il

costrutto di interesse va clonato in E. Coli per amplificarlo, poi isolato con opportuni

enzimi di restrizione e ligato nel plasmide mini Ti di Agrobacterium. Infine si ottiene il

vettore binario con il gene target, con il gene di interesse.

STRUTTURA DI UN GENE

Come si progetta un costrutto? DEVE ESSERE EUCARIOTICO!! La regione codificante

può essere una regione a priori proveniente da qualsiasi origine, può essere animale,

vegetale, virale, in quanto il codice genetico è universale. Quelle che devono essere

strettamente vegetali sono le regioni regolatrici, quelle a monte e a valle, il promotore

e il segnale di stop. I promotori possono essere:

Costitutivi -> fanno sì che il gene a valle sia sempre espresso

 Tessuto-specifici -> geni che si esprimono solo in determinati tessuti

 Inducibili -> da stimoli esterni, un esempio di promotore è l’acido abscissico,

 ad esempio la presenza della luce induce un sacco di geni per la fotosintesi.

Cloroplasto alla luce: doppia membrana, stroma in cui sono immersi i tilacoidi.

Cloroplasto al buio -> ezioplasto: scompaiono le membrane e compare un

sistema molto regolare di proto-membrane le quali appena si riaccende la luce

riformano subito tutto il sistema di membrane per fare la fotosintesi. Tutti questi

geni sono geni inducibili dalla luce. Ci sono molti geni inducibili in pianta: dalla

presenza di stress ambientali, dalla presenza di patogeni, dalla variazione di

temperatura.

Questa ampia gamma di promotori mi permette di costruire il costrutto come voglio!

Promotori costitutivi

Sono sempre attivi in tutte le cellule, tutti i tessuti, organi della pianta e duranti tutti

gli stadi di sviluppo, quindi la loro espressione è ubiquitaria. Vantaggio -> garantiscono

elevati livelli di espressione genica, sono dei promotori forti. Il più utilizzato è il

promotore 35 S, promotore del virus del mosaico del cavolfiore -> CaMV 35S.

Ma è un promotore di un virus vegetale! Moltiplica i suoi geni all’interno delle cellule

vegetali, quindi hanno dei promotori che vengono riconosciuti dall’apparto di

traduzione/trascrizione della cellula vegetale. Quindi posso usare sia dei promotori

vegetali che dei promotori di patogeni vegetali. CaMV 35S ha un’attività elevata

(bassa nei cereali) e permette livelli di espressione del transgene tra lo 0.1 e l’1% delle

proteine totali. Altro promotore pNos -> promotore del gene nopalina sintetasi, deriva

da Agrobacterium tumefaciens, presenta attività elevata.

geni inducibili:

Vantaggi

È possibile analizzare la funzione di geni la cui espressione ectopica è tossica

 La funzione del transgene può essere analizzata comparando la stessa pianta in

 condizioni di induzione e di non induzione

Poiché l’attivazione del transgene ha un inizio, è possibile capire meglio gli

 eventi causati dalle sue funzioni

I promotori inducibili possono essere di due tipi: 25

Vegetali

 Non vegetali, molto complicati perché devono essere a loro volta posti sotto il

 controllo di un altro promotore che per forza è vegetale

Quelli vegetali possono essere tessuto-specifici (radici, frutti, semi) o cellula-specifici.

Rubisco è inducibile dalla luce, heat shock proteins proteine indotte da calore.

Promotori tempo-specifici: attivi soltanto in alcuni momenti del ciclo vitale della

pianta, come la fioritura, la germinazione, la maturazione dei frutti. Negli eucarioti tutti

i geni heat shock condividono la presenza di una regione di risposta allo heat shock. I

vettori inducibili da heat shock sono stati costruiti inserendo un box HSE nel promotore

basale a monte del gene che si vuole indurre. Questi promotori heat shock hanno molti

vantaggi:

Espressione molto forte

 Il calore è sentito in modo omogeneo in tutta la pianta e rapido

 I sistemi HS non sono utilizzabili su tempi molto lunghi in quanto temperature

 elevate danneggiano gli organismi vegetali

Per far sì che un gene venga trascritto in un modo giusto serve un promotore

adeguato a monte e questo può essere o di origine vegetale (derivato da un’altra

pianta o dalla stessa) o di origine non vegetale (un virus vegetale). I virus (patogeni

virali di cellule vegetali) sono riconosciuti come i patogeni animali dalle cellule animali.

Questi promotori possono essere di due tipi: costitutivi o inducibili. Costitutivi si

esprimono sempre in tutti gli stadi di sviluppo della pianta; inducibili vuol dire che

dall’esterno posso regolarli e scelgo io quando esprimerli. Inducibili possono essere:

fisiologicamente inducibili, quindi tessuto-specifici, tappeto-specifici, radici-specifici,

oppure possono essere indotti da segnali esterni, come ad esempio dal calore o dalla

luce. Gli inducibili possono essere vegetali o non vegetali: i primi variano perché sono

tessuto-specifici o ambienti-specifici.

Promotori inducibili non vegetali

Organismi distanti dalle piante in termini evoluzionistici hanno sviluppato meccanismi

di regolazione genica che rispondono a segnali esterni ignoti nel regno vegetale.

Gli antibiotici influenzano principalmente i procarioti che hanno sviluppato geni

 di resistenza specifici

Il lattosio induce geni del metabolismo in batteri, ma non nelle piante

 Gli ormoni steroidi controllano lo sviluppo animale ma non hanno equivalenti nel

 mondo vegetale

Se il meccanismo regolativo coinvolge il legame di una sola proteina regolativa a una

specifica sequenza cis, allora possono essere presi in considerazione come sistemi di

espressione che rispondono in modo altamente specifico a agenti chimici per

ingegnerizzare le piante.

Caratteristiche di un induttore ideale:

Non presente in pianta, questo promotore deve essere proprio specifico per il

 transgene, non ce ne deve essere uno simile in pianta che potrebbe essere

espresso a basso livello

Non tossico

 Non deve influenzare l’espressione di altri geni vegetali (alta specificità per

 l’induttore)

Facile e rapida penetrazione in tutte le cellule della pianta

 26

Risposta rapida dopo induzione

 Rapido silenziamento dopo rimozione

 Non tossico per l’operatore e l’ambiente

 Bassi costi

Questi promotori non vegetali richiedono l’inserzione di un costrutto più complicato,

richiedono l’espressione di due geni nelle piante transgeniche:

Un gene che codifica per una proteina responsabile della regolazione

 (repressore o attivatore trascrizionale)

Il gene di interesse posto sotto il controllo di un promotore target regolato da 1

Esempio 1: il sistema ALCR/ALCA

Aspergillus nidulans,

In il fattore trascrizionale alcR è attivato da etanolo ed attiva la

trascrizione di altri geni:

1. alcA che codifica per una alcol deidrogenasi (ADHI)

2. aldA che codifica per un’aldeide deidrogenasi (AldDHI)

Tutto questo sistema risponde quando c’è etanolo nell’ambiente. Ma questo sistema lo

posso utilizzare come promotore inducibile non vegetale. La sequenza del gene ALCR

(capace di legarsi a siti specifici presenti sul promotore alcA) è posta sotto il controllo

del promotore forte CaMV 35S; quindi la proteina ALCR è sempre espressa. Ma il

fattore di trascrizione si attiva soltanto in presenza di etanolo, in assenza di questo

non è funzionale. Se do etanolo il fattore di trascrizione diventa attivo, ma per

diventare attivo deve trovare il promotore a cui questo si lega normalmente e quindi

promotore lo metto a monte. I gene di interesse deve essere posto sotto un promotore

che non viene riconosciuto normalmente dalla pianta e che è sensibile all’alcol,

siccome il promotore non è riconosciuto dall’apparato di trascrizione vegetale devo

necessariamente aggiungere qualcosa che induce il promotore e questo qualcosa deve

essere per forza sotto un promotore che è riconosciuto dalla cellula vegetale, perché

se non lo fosse dovrei aggiungere un altro gene. ALCR si lega al promotore, se prendo

questo promotore e lo metto a monte del gene di interesse [G o GOI] (poi si mette il

terminatore) e se metto questo costrutto nella cellula vegetale non otterrei nulla

perché questo promotore non viene riconosciuto dalla cellula vegetale. Ma se a monte

di questo promotore metto il gene AlcR (col terminatore) succede che quando il gene

viene tradotto e quando il fattore di trascrizione si attiva questo è in grado di legarsi al

promotore del gene AlcA. Ma il promotore di AlcR come deve essere per far

esprimere il gene? Deve essere il promotore 35S che viene riconosciuto dalla cellula

vegetale.

Il costrutto è composto da due elementi: il gene alcR e il promotore alcA. ALCR è di

origine non vegetale, il fattore trascrizionale ALCR non è in grado di attivare altri

promotori all’interno del genoma della cellule vegetale. L’etanolo è un buon induttore:

non è tossico, è biodegradabile.

Esempio 2: il sistema TETR: tetracycline-regulated promotores

Operone di resistenza alla tetraciclina è presente in E. Coli e agisce negativamente.

L’interazione tra la proteina e il repressore e una sequenza di DNA reprime l’attività

del promotore. Ho operone TetR e una sequenza alla quale si lega. In assenza di

induttore TetR si lega al promotore TetO legandosi al promotore impedisce che i fattori

di trascrizione si leghino e portino alla formazione di proteine. Se do tetraciclina

questa si lega a TetR, provoca un cambiamento conformazionale del fattore di

27

trascrizione, quindi TetR non si lega a TetO e quindi i fattori di trascrizione si legano e

danno origine al fattore stesso. Il gene TetO deve avere un promotore, cosa succede?

Perché questo si esprima al promotore si deve legare una proteina/fattore di

trascrizione che attiva la trascrizione di questo gene. Se qualcosa impedisce questo

legame, qualcosa ingombra, il fattore di trascrizione non si può legare. Questo

ingombro è fatto da proteine che sono codificate da un gene: TetR. Ma se diamo

tetraciclina questa ha una composizione tale che è in grado di legarsi a TetR e induce

un cambiamento conformazionale, quindi le proteine non si legano più al promotore in

seguito al cambiamento. La tetraciclina sequestra la proteina TetR e impedisce il suo

legame al promotore di TetO. Quindi il promotore è libero e TetO è in grado di legarsi

ad esso e ha la capacità di codificare il gene. Come si può usare nelle piante? Il

gene di interesse (gene X) è posto sotto il controllo di un promotore CaMV modificato

con tre siti di legame per TetR cioè tre sequenze TetO. In assenza di tetraciclina, TetR si

lega a TetO e blocca l’espressione del gene di interesse. In presenza di tetraciclina

l’elevata affinità di TetB per la tetraciclina sequestra la proteina chimerica inibendone

la capacità di binding al DNA. Si ha quindi la sintesi del gene di interesse.

L’espressione del gene di interesse riesco a modularla dall’esterno somministrando o

meno tetraciclina. Si utilizza un sistema che non è presente normalmente in pianta,

non è presente il gene TetR e inoltre si lega con alta specificità soltanto con i siti di

legame che ho posto all’interno del promotore del gene di interesse. Il costrutto è fatto

dal gene X più il promotore, cosa succede in condizioni normali? Il gene costitutivo

attiva costitutivamente il gene TetR, la proteina TetR si lega alle sequenze che ho

inserito ad hoc all’interno delle sequenze inserite nel gene di interesse.

Vantaggi di questo sistema

Livelli di espressione molto elevati in tabacco, patata e pomodoro

 La Tet può essere facilmente applicata per infiltrazione (anche solo sul tessuto

 dove si vuole studiare l’espressione del transgene)

Svantaggi

La Tet ha una breve emivita e deve essere applicata continuamente

 Deve essere applicata a concentrazioni piuttosto elevate, per alcune specie

 vegetali tali concentrazioni sono tossiche perché interferiscono con la fisiologia

della fotosintesi

Esempio 3: il sistema inducibile da glucocorticoidi

Utilizza il meccanismo di regolazione dei recettori degli ormoni steroidei dei vertebrati.

Sistema a due componenti: promotore 35S che è stato modificato, sono stati inseriti 6

regioni di legame per un fattore di trascrizione (una proteina) ed è regolato da un altro

promotore, questo fattore è una proteina chimerica. Questa proteina consta di 3 parti:

GAL4 DBF (dominio di legame al DNA), VP16 e GR. In condizioni normali il gene che

codifica GVG è attivo perché è a valle di un promotore costitutivo, la proteine GVG

viene trasferita nel citoplasma dove si lega aspecificatamente attraverso il dominio GR

a proteine citoplasmatiche formano complessi che non riescono ad entrare nel nucleo.

Includendo un glucocorticoide questo si lega alla regione GR in modo altamente

specifico, induce una modificazione del GVG e questo permette alla proteina chimerica

di passare la membrana nucleare. Una volta entrato nel nucleo cosa succede? GAL4

se lega alle regioni che sono presenti a monte del gene di interesse e porta vicino al

promotore che cosa? La proteine VP16 che promuove la trascrizione del gene di

interesse. In questo caso il sistema funziona come attivatore della trascrizione. 28

La possibilità di utilizzare un ampio spettro di promotori con diversa

capacità di regolare lo schema di espressione spaziale e temporale dei

transgeni aumenta moltissimi il campo di applicazione delle tecnologie

transgeniche, sia per quanto riguarda la ricerca di base che per le

applicazioni pratiche (miglioramento per alcune qualità/caratteristiche).

Il terminatore:

Importante per la corretta maturazione del mRNA, lunghezza variabile

 Include il segnale di poliadenilazione AATAAA: 10-35 bp a valle avviene il taglio

 e l’aggiunta della coda poly-A

Altri elementi possono contribuire alla stabilità del mRNA

Serve una sequenza segnale che resti fusa con la sequenza di proteina di interessa e

degli aa in più servono per il segnale. Targeting sequences to cellular organelles:

essenziale per mantenere l’integrità strutturale e funzionale nella cellula permettendo

ai vari comparti subcellulari di eseguire le loro particolari funzioni metaboliche. Sono

noti segnali specifici implicati nel trasporto e indirizzamento delle proteine al nucleo,

cloroplasto, mitocondrio, RE, Golgi, vacuolo, etc. Agrobacterium

Attorno al costrutto metto RB e LB così utilizzo il quale avrà i geni

Agrobacterium

Helper che contiene VIR. Quando si infetta con questo sa cosa fare e se

all’interno metto questo transgene tutto deve funzionare appena entra all’interno del

Agrobacterium

genoma della cellula ospite. Ma non è vero che trasforma tutte le

cellule, ne trasforma alcune, arriva fino al 20%. Basta inserire questo costrutto

Agrobacterium

all’interno di per avere delle piante trasformate? No! Bisogna

capire quali cellule sono state trasformate e quali no. Introduco un marcatore

selezionabile all’interno del costrutto che dia la possibilità alle cellule di sopravvivere e

in questo modo vedo quali sono vive e quali no.

MARCATORI DI SELEZIONE

I marcatori di selezione servono per selezionare soltanto le cellule trasformate,

questo perché? Perché devo dare la possibilità solo alle cellule trasformate di

sopravvivere anche perché quelle non trasformate in coltura stanno meglio rispetto a

quelle trasformate. I marcatori di selezione più comunemente usati funzionano come

marcatori a selezione negativa poiché essi conferiscono alle cellule trasformate la

capacità di sopravvivere a trattamenti con antibiotici o erbicidi, mentre le cellule che

non sono state trasformate subiscono un’inibizione della crescita o vengono

soppresse. Perciò se le cellule vegetali vengono fatte crescere su di un mezzo di

coltura contenente uno di questi marcatori di selezione, cresceranno solo le cellule

trasformate.

Il costrutto più semplice è formato dal gene di interesse con il suo promotore e il suo

terminatore e dal marcatore selezionabile con il suo promotore e il terminatore.

I marcatori più utilizzati sono: neomicina fosfotransferasi, igromicina

fosfotransferasi, aminoglicoside acetiltransferasi, diidrofolato reduttare,

fosfoinotricini acetiltransferasi. Come funzionano?

NPT II = neomicina fosfotransferasi II 43-

Enzimi kanamicina fosfotransferasi è in grado di aggiungere un gruppo PO alla

kanamicina in una determinata posizione, in questo modo diventa inattiva quindi

questo enzima è in grado di detossificare la kanamicina per aggiunta di un gruppo

29

fosforico. Se metto kanamicina nel mezzo devo dare alle cellule la possibilità di

sopravvivere.

La selezione con Bar

Selezione con erbicida, gli erbicidi funzionano inibendo delle funzioni che sono

essenziali per la cellula vegetale. La GS (=Glutammina Sintetasi) è un enzima chiave

dell’assimilazione dell’azoto che porta alla sintesi della glutammina da ammoniaca.

L’inibizione della GS porta ad accumulazione dell’ammoniaca nelle cellule ed è tossica.

Il Glufosinato è un substrato analogo al glutammato che è il substrato della

glutammina sintasi. Quando si aggiunge questo substrato, la glutammina sintasi si

lega a questo e non al glutammato quindi la reazione non avviene più, si ha sempre un

maggior accumulo dell’ammoniaca e la cellula muore. Se do fosfinotricina questo è un

buon modo per selezionare le cellule non trasformate, quindi devo dare alle cellule

trasformate la possibilità di sopravvivere. Ci sono alcuni microrganismi che sono in

grado di detossificare il PPT, ovvero l’enzima PAT che causa un’acetilazione al gruppo

amminico. L’enzima PAT trasforma la fosfinotrocina in acetil-fosfinotricina, PAT è

codificato dal gene bar. Quindi il gene bar può essere usato come marcatore di

selezione se nel mezzo di coltura metto PPT. Il glufosinato con il gruppo acetilico non

funziona più.

Costrutto più semplice -> come deve essere il promotore che metto a monte del

marcatore? Deve essere vegetale e costitutivo, forte.

TECNICHE DI TRASFORMAZIONE CON AGROBATTERIO

Per costruire un costrutto:

A monte si mette un promotore

 A valle si mette un terminatore

 Marcatore di selezione (con a monte e a valle il promotore e il terminatore), per

 Agrobacterium)

selezionare le cellule vegetali che sono trasformate (da rispetto

a quelle non trasformate

Aggiungo anche LB e RB

 Agrobacterium?

Come si mette il costrutto in Dato che ne ho poco di costrutto lo

devo amplificare, per amplificarlo lo metto E. Coli (perché è troppo grande per una

PCR) che si duplica velocemente. Per inserirlo in E. Coli devo prima metterlo in un

plasmide. Cos’ha questo plasmide? Un’origine di replicazione, dei polylinker che

verranno tagliati con enzimi di restrizione e un marcatore di selezione, per selezionare

i batteri trasformati. Serve un altro marcatore perché il promotore del mercatore del

costrutto è eucariotico, non può funzionare all’interno di un batterio (infatti il costrutto

rimane silente fino a che non arriva nella cellula vegetale). Dopo aver ottenuto il

plasmide tramite elettroporazione lo metto in E. Coli e aspetto la duplicazione e nel

terreno di E. Coli metto l’antibiotico per la selezione.

Prendo la coltura di E. Coli e la liso, in questo modo recupero il plasmide. Questo

plasmide può andare incontro a due vie: o è già predisposto con un’altra origine di

Agrobacterium

replicazione per quindi posso metterlo tramite elettroporazione in

Agrobacterium o se non va bene lo taglio con enzimi di restrizione (la regione dei

Agrobacterium.

polylinker) e ottengo il costrutto che lo metto nel plasmide corretto di

Agrobacterium,

A questo punto? Una volta che ho elettroporato il plasmide in faccio

Agrobacterium

crescere sempre in un mezzo di selezione che sarò portato dal vettore

30

binario. Crescono solo quelli con plasmide Helper e vettore binario. Nel mezzo selettivo

Agrobacterium.

ci devo mettere due antibiotici diversi perché ho due plasmidi in

Agrobacterium,

Quindi ora faccio crescere poi dopo un po’ di tempo si misura OD e per

farlo serve una certa concentrazione di batteri. L’efficienza di trasformazione non è

altissima, se parto da pochi batteri l’efficienza di trasformazione è bassa. Quando

raggiungo OD giusta (0.5-0.6-0.7), centrifugo, risospendo in un tampone e poi

Agrobacterium

fisicamente metto a contatto con la soluzione di gli espianti. Le

dimensioni degli espianti sono molto importanti, di solito 0.5-0.8 cm x 0.5-0.8 cm. Il

Agrobacterium.

secondo step è quello di incubare con Oltre che in sospensione gli

Agrobacterium.

espianti si possono mettere a contatto con una carta imbevuta di Si

lascia per un tempo variabile, dipende dall’espianto, bisogna lasciare che

Agrobacterium si avvicini e si attacchi agli espianti. Nel mezzo si mette acetosiringone

per aumentare al massimo il processo di infezione. Terzo step: si asciugano

superficialmente gli espianti infettati, poi si mettono in una Petri e si lasciano co-

coltivare per un tot di tempo per far sì che il processo funzioni per bene. Circa 2-4

giorni, al buio di solito e si aggiunge ancora nel mezzo acetosiringone. Il costrutto va

ad inserirsi in alcune cellule vegetali del costrutto. Dopo la co-coltivazione cosa si

fa? Si prendono gli espianti che vanno messi in un nuovo terreno. In questo nuovo

terreno ci sarà il marcatore di selezione del costrutto, perché è arrivato effettivamente

nella cellule vegetale e bisogna selezionare (quelle poche) cellule vegetali

dell’espianto che hanno il costrutto. Quindi prelevo gli espianti, li metto in una nuova

Petri, nella quale ci saranno tutte le componenti di un terreno e in più ci sarà l’agente

selettivo. Ma devo fare un’altra cosa!! Per fare una coltura in vitro devo partire da

espianti sterili. Ma come sono questi espianti che prelevo e metto nel nuovo

Agrobacterium!

terreno? Sono completamente ricoperti da Devo utilizzare un

Agrobacterium!

ulteriore antibiotico anche perché devo rimuovere L’OD giusta mi

permette poi alla fine di poter “eliminare” alcuni espianti troppo carichi di

Agrobacterium. Quindi quando trasferisco nel nuovo terreno aggiungo l’antibiotico per

Agrobacterium più il marcatore selettivo per il transgene.

Come preferisco che rigeneri una pianta dopo la trasformazione? Per

organogenesi somatico o per embriogenesi somatica? E perché? Per

embriogenesi somatica un’unica cellula va incontro al differenziamento e dà una

pianta, quindi questa pianta sarà tutta omogenea ed è meglio così ha un background

uguale. Per organogenesi invece ottengo una pianta con diverse cellule trasformate

con diversi livelli di espressione quindi non ho una pianta omogenea e può essere

instabile.

SOLO PER ARABIDOPSIS THALIANA: trasformazione in pianta

È una Brassicacea, è una pianta molto piccola. Ma perché è così utilizzata in studi di

fisiologia vegetale, di genetica? Perché è molto piccola, facile da coltivare, in circa 40-

50 giorni va da seme a seme, il suo ciclo vitale è di poco più di un mese, ha il genoma

più piccolo fra quelli vegetali. Si è messo a punto un metodo di trasformazione

Arabidopsis,

alternativa per ma non si ha rigenerazione da un espianto di questo

Agrobacterium.

pianta. La piantina viene capovolta e immersa nella soluzione di Si

Agrobacterium

mette sempre un po’ di detergente per facilitare l’adesione di al

tessuto vegetale. Questa tecnica è del 1998, qual è l’idea? Di trasformare gli ovuli di

Arabidopsis, Arabidopsis

prima che vengano fecondati dal polline. Il ginoecio di è

31


PAGINE

57

PESO

714.41 KB

AUTORE

elaisa9

PUBBLICATO

4 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze e tecnologie biologiche
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie vegetali e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Bracale Marcella.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Corso di laurea in scienze e tecnologie biologiche

Evoluzione e Classificazione - Artropodi
Appunto
Evoluzione e Classificazione - Poriferi
Appunto
Evoluzione e Classificazione, Platelminti
Appunto
Evoluzione e Classificazione, Cordati
Appunto