Biotecnologie Vegetali

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utilizzare un terreno solido devo aggiungere dell’agar, agarosio, gelrite , phytagel

-> sostanze che danno consistenza gelatinosa alla soluzione. Le aggiungo prima di

mettere tutto in autoclave. Se uso un terreno solido quando tiro fuori la bottiglia

dall’autoclave, la faccio raffreddare, ma non troppo perché se no si gelifica nella

bottiglia. Vantaggio di usare terreni solidi: ad esempio con piastre Petri posso impilarle

ed occupano poco spazio. Si forma una situazione disomogenea, le cellule sotto

risultano a contatto col terreno di coltura mentre quelle sopra no. Quelle sopra sono

più facilitate negli scambi gassosi. Ad esempio nelle cellule del callo si può creare una

certa polarità di struttura. Mentre per quanto riguarda il terreno liquido non bisogna

aggiungere una sostanza gelificante. Quali sono i vantaggi di questo terreno? In una

beuta c’è l’espianto e più o meno tutte le cellule dell’espianto sperimentano la stessa

condizione. Lo svantaggio è che queste colture per permettere la crescita delle cellule

devono essere areate perché se no le cellule vanno in anossia. Quindi devono essere

messe su degli agitatori orbitanti che ruotano e permettono l’agitazione del liquido

(30-150 rpm). Cosa succede? Occupano molto posto al contrario delle piastre Petri. Le

colture su terreno solido presentano anche notevoli inconvenienti soprattutto a livello

di callo. Si determina infatti pressochè in tutti i calli una certa differenziazione cellulare

che giunge, in alcuni casi, anche alla formazione di vasi conduttori. Ciò è dovuto al

fatto che non tutte le cellule del callo si trovano nelle stesse condizioni ambientali: le

cellule degli strati più esterni sono, infatti, più direttamente a contatto delle sostanze

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nutritive e dei gas rispetto alle cellule degli strati più

interni. La coltura di cellule vegetali in sospensione in

terreni liquidi permette di evitare alcuni dei problemi

legati alle condizioni di crescita su terreni solidi, il terreno

liquido infatti: facilita gli scambi nutritivi e gassosi e

permette di evitare fenomeni di polarizzazione.

Fase di lag: le cellule si preparano alla divisione

 Fase esponenziale: la velocità di divisione cellulare

 è massima

Fase di decelerazione: la velocità di divisione cellulare cala

 Fase stazionaria: il numero di cellule resta costa



Fattori fisici che influenzano la crescita in coltura

Esigenze di luce: non necessaria solo per la fotosintesi, ma induce una serie di

fenomeni morfogenetici. Le piante rispondono al rapporto ore di luce/buio mettendo in

atto dei processi di morfogenesi. La quantità di luce necessaria è molto inferiore a

quella in campo ed essenzialmente necessaria per la fotomorfogenesi. Importante

anche il fotoperiodo in quanto attiva programmi morfogenetici. Normalmente si usa un

fotoperiodo di 16/8. Talvolta le prime fasi si devono svolgere al buio. Le risposte alla

luce sono dipendenti dal genotipo e dalla natura dell’espianto. La temperatura è

importante perché anche in questo caso cambia la morfologia. La temperatura di una

camera di crescita è di solito 24-28°C. Talvolta, sulla base delle esigenze dell’espianto

sono necessarie temperature più basse (18°C) o più elevate (28°C) soprattutto nel

caso di specie tropicali.

Organizzazione laboratorio di colture in vitro

Stanza per la preparazione di tutto il materiale, con autoclavi, lava-vetrerie, necessario

per la sterilizzazione. Poi c’è una parte più operativa con cappe sterili. Poi c’è una

camera di crescita con luce e temperatura controllate per lo sviluppo degli espianti.

Inquinamenti

Virus

 Batteri, identificabili come aloni lattiginosi o colonie mucillaginose che crescono

 sulla superficie del terreno di coltura. A volte possono essere colorati (giallo,

rosa, etc.). Cefotaxime 50 mg/L può essere aggiunto al terreno di coltura per

limitare le infezioni batteriche.

Funghi, crescita di masserelle lanose di micelio spesso bianche o grigiastre. Se

 Penicillium, Rhizopus

verdi -> se con piccoli granuli neri ->

Micoplasmi

 Micro artropodi e tripidi



A volte succede che l’espianto diventi molto scuro perché molte specie vegetali sono

ricche di sostanze chiamate polifenoli che sono prodotte in situazioni di stress,

presenza di patogeni/insetti, questi provocano delle lacerazioni e attraverso queste

lacerazioni possono entrare batteri che danneggiano la vitalità della pianta. La pianta

produce una serie di composti che hanno proprietà antibatteriche o comunque di

chiusura della ferita. I polifenoli entrano nella composizione della parete della cellula

vegetale. Quando si taglia con i bisturi si va a mimare la presenza di un insetto o una

lesione, quindi l’espianto reagisce con produzione di sostanze come queste. Però se

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raggiungono una situazione, concentrazione molto elevata di polifenoli è dannoso per

la cellula perché inibiscono l’attività enzimatica e possono danneggiare

irreversibilmente l’espianto. Dopo la dissezione i polifenoli sono ossidati dalla

polifenolo ossidasi e i tessuti diventano bruni. I polifenoli ossidati inibiscono l’attività

enzimatica e possono danneggiare irreversibilmente l’espianto. Si può cercare di

evitare il fenomeno aggiungendo antiossidanti (acido ascorbico, acido citrico, PVP) al

terreno di coltura. C’è anche la formazione di una “cintura di sicurezza” intorno alla

parte lesa, perché ad esempio molto virus si propagano in presenza di cellule vegetali.

Quindi se inducono una morte programmata impedisce l’ulteriore progressione

dell’infezione virali. Si ottiene aumentando la concentrazione di sostanze tossiche

nelle cellule vicine all’infezione virale. I polifenoli quindi svolgono due funzioni: a basse

[] servono per formare la parete, ad alte [] induce danni.

In coltura, come anche in natura, i tessuti lesionati portano alla produzione di molecole

che possono inibire la vitalità delle cellule vegetali. In coltura non voglio ciò e limito il

fenomeno aggiungendo degli antiossidanti (acido ascorbico, acido citrico, PVP) che

contrastano la formazione di queste sostanze. La formazione di queste sostanza è

molto specie-specifica. Alcuni problemi con la coltura in vitro posso risolvere stando

attenta altri problemi sono intrinseci al genoma con cui sto lavorando.

APPLICAZIONI DELLE COLTURE IN VITRO

Micropropagazione

Applicazione delle tecniche di coltura in vitro per la moltiplicazione massiva di piante

con un determinato fenotipo e background (genotipo) di grande importanza. La

variabilità genetica dovuta all’unione di patrimoni genetici diversi è un bene prezioso

per ottenere nuove combinazioni di geni, ma se l’obiettivo è quello di ottenere dei

cloni, cioè discendenze con le stesse caratteristiche genotipiche (e quindi con le stesse

caratteristiche organolettiche e produttive) della pianta madre, si deve ricorrere

necessariamente alla propagazione vegetativa. La riproduzione vegetativa di massa

non è meno costosa di quella per seme, ma è giustificata dalla superiorità ed

uniformità degli specifici cloni. Inoltre consente di realizzare, nel corso dell’anno,

un’attività continua (indipendente dalla stagione vegetativa) con un programma di

produzione più vicino alle esigenze di mercato. Prima di essere commercializzate viene

fatta una certa crescita in serra, perché comunque la pianta che si preleva dal vitro è

molto delicata. Perché non ha mai conosciuto un ambiente non sterile inoltre è sempre

vissuta in un ambiente con un’elevatissima umidità quindi la sua tendenza sarà quella

di avere sempre gli stomi aperti. Quindi bisogna far ambientare la pianta da una

situazione di sterilità ad una situazione naturale, fondamentale la fase di

acclimatazione in serra.

orchidee

Esempio:

Il mercato di orchidee raggiunge i 200 milioni di dollari! La germinazione dei semi di

orchidee è di estrema difficoltà essendo basata sulla simbiosi con specifici funghi.

Propagazione generativa: se il fiore viene impolverato, si genera una capsula si

demi con innumerevoli semi che però generano piante non identiche una all’altra. Ed è

per questo motivo che la propagazione generativa non è adatta ad una coltivazione

precisa, di varietà distinte detta propagazione viene però usata per l’ibridazione di

nuove varietà. Si prende il polline e si inseminano le singole piante, inoltre questa

operazione è piuttosto laboriosa (perché c’è la possibilità che si danneggi il polline).

Oggi invece si utilizza la propagazione in vitro, si parte da due tipi di espianti: gemme

apicali o coltura internodale. Le piante giovani vengono tolte dal contenitore, avendo

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cura di togliere i residui del terreno di coltura.

È importante lavorare con cura per non

danneggiare le radici e le foglie, affinché le

piantine rimangano sane e possano subito

iniziare a crescere con forza. Già in questa

fase di trapianto è importante selezionare le

piante in diverse grandezze e per numero di

radici. Si può avere una quantità enorme di

piante tutte identiche tra loro pronte per il

mercato. Si possono utilizzare le colture in

vitro anche per le piante forestali che sono

fondamentali per la riforestazione. Si

producono anche piante di interesse agronomico.

Conservazione

Preso atto dell’erosione genetica o rischio di estinzione di un certo taxon si

in situ

programmano le strategie di conservazione più idonee al caso: conservazione e

ex situ.

conservazione Conservazione in situ: protezione delle specie nel loro ambiente

naturale. Conservazione ex situ: protezione del germoplasma rimosso dall’ambiente

naturale e conservato in collezioni.

Conservazione ex situ

Criteri che giustificano la coltivazione ex situ di una specie selvatica minacciata:

La specie è minacciata su grandi areali

 Determinate popolazioni di queste specie sono compromesse in modo

 irrimediabile

Esistono siti naturali o di sostituzione idonei alla reintroduzione delle specie

 coltivate

Oltre a mantenere le risorse genetiche esistenti, la conservazione ex situ è funzionale

anche ad altri importanti obiettivi:

Fornire popolazioni di riserva o stock da utilizzare per consentire la

 sopravvivenza delle specie durante le fasi di reintroduzione e ripopolamento o

per favorire il recupero e la riabilitazione degli habitat

Assicurare, attraverso lo stoccaggio a lunga scadenza, materiale per bisogni

 futuri

Sviluppare nuove