Biotecnologie Vegetali

BIOTECNOLOGIE VEGETALI

Libro: biologia cellulare e biotecnologie vegetali, Gabriella Pasqua. Biotecnologie e

genomica delle piante, Gnocchi.

Coltura in vitro di tessuti e cellule vegetali

Cosa si intende con coltura in vitro? Insieme delle tecniche che permettono di

coltivare, crescere delle parti di vegetali (espianti) su un mezzo di coltura in condizioni

adatte, in condizioni di sterilità ed ambiente controllato, al fine di ottenere cloni della

pianta. Murashige è stato uno dei maggiori ricercatori in questo campo.

In cosa consiste una coltura in vitro? Bisogna per prima cosa prelevare un tessuto

da una pianta donatrice, quindi prendere un espianto. Tutti i tessuti della pianta

possono essere messi in coltura (foglia, fusto, radice). All’interno di una pianta ci sono

dei tessuti particolari che sono i meristemi. Cosa sono? (Differenza tra cellule

meristematiche e somatiche) Le cellule meristematiche sono indifferenziate. Quali

sono le cellule che si duplicano? Quelle meristematiche. Mentre gli animali

arrestano la loro crescita raggiunta una certa dimensione o età (crescita determinata),

le piante continuano a crescere durante tutto il loro ciclo vitale (crescita

indeterminata). I meristemi generano continuamente nuove cellule. Ciò fornisce alle

piante un modo semplice di risolvere il problema dell’invecchiamento: quando un

organo è vecchio viene sostituito da uno nuovo

(abscissione fogliare). L’accrescimento delle piante è a

carico delle cellule meristematiche che si duplicano. Dalla

divisione si ha una parte che rimane indifferenziata e una

parte che si differenzia. Quanti meristemi ci sono? Un

meristema è nella parte apicale (localizzato all’estremità

delle radice e delle gemme dei fusti permettono

l’allungamento -> crescita primaria), un altro

meristema è nelle radice che crescono e hanno lo scopo

di andare ad esplorare il terreno; questi sono meristemi

primari. Meristemi laterali: ispessimento dei fusti e delle

radici -> crescita secondaria. Ci sono poi i tessuti

differenziati: foglie, fiori, etc. L’espianto può essere preso sia da meristemi che da

tessuti differenziati. SAM, meristema apicale del germoglio: le cellule

meristematiche sono molto piccole, molto dense, con nucleo molto grosso, poco

citoplasma, cellule il cui scopo è quello di differenziarsi. All’apice del germoglio una

piccola massa di cellule in continua divisione. Sono le progenitrici di tutte le cellule del

germoglio. Inoltre formano nuovi meristemi che daranno luogo alle gemme ascellari,

quiescenti fino all’arrivo dello stimolo ormonale. SAM ha la funzione di produrre la

parte aerea del corpo vegetativo della pianta (fusto e foglie) ma per effetto di stimoli

ambientali e/o ormonali il SAM può convertirsi nel meristema fiorale che produrrà i

primordi fiorali e poi la struttura riproduttiva matura (fiore) con i vari organi (sepali,

petali, stami, carpelli). Stimoli ambientali, in primo luogo luce e temperatura regolano

l’attività del SAM, attraverso la variazione dei livelli di alcuni ormoni. Questi ultimi

attivano cascate geniche che controllano nel meristema la velocità di divisione

cellulare, la dimensione del meristema, l’esatta posizione in cui si formano gli organi

(primordio fogliare) e la velocità di crescita dell’organo. RAM, meristema radice: è

presene all’apice di goni radice appena al di sotto della cuffia, la struttura che

protegge il meristema quando la radice cresce nel suolo. La radice stessa si origina da

poche cellule iniziali (da 3 a 6). 1

Caratteristiche delle cellule meristematiche:

Cellule piccole (circa 10 μm) senza spazi intercellulari

 Elevato rapporto nucleo/citoplasma

 Citoplasma denso ricco di organuli

 Provacuoli o piccoli vacuoli

 Proplastidi

 Mitocondri piccoli con poche creste in divisione

 Parete cellulare sottile che viene riformata dopo la divisione



Cellule vegetali

Il primo passaggio delle colture è il prelievo della parte apicale, si parla di micron,

lavoro fatto sotto il microscopio. Questo meristema si mette in coltura, cosa vuol

dire? Metterlo in una situazione in cui possa attrarre nutrimento necessario per la

sopravvivenza delle cellule. Le cellule poi crescono e si moltiplicano e si può avere

proprio una piantina, sotto opportuni stimoli ormonali posso indurla a mettere radice.

Quando si ha una struttura di questo tipo si può prelevare e mettere in terra. Questo

dice che si possono ottenere delle piante (anche parecchie) da delle cellule

meristematiche, non da cellula uovo fecondata. Da un meristema si possono ottenere

svariate piante. Come saranno queste piante rispetto a quella donatrice? Sono

dei cloni! Dal seme non si ottengono cloni della pianta madre, sono geneticamente

diversi.

Tessuto differenziato

È possibile prendere un tessuto (ad esempio dalla foglia) e metterlo in coltura,

soluzione che dà nutrienti fondamentali per la sopravvivenza. A noi interessa che

anche da un pezzetto di foglia nasca una pianta clone della pianta madre. Anche da

tessuto completamente differenziato, incapace in natura di differenziarsi, se

messo in opportune condizioni è capace di rigenerare: morfogenesi diretta o indiretta.

Morfogenesi diretta

Dagli espianti si generano nuovi organi (radici, fogli), si parla di organogenesi

diretta. Per organogenesi diretta si intende la formazione di organi, germogli o radici,

direttamente da tessuto somatico in coltura. La capacità di dare origine a germogli

direttamente è propria di un numero ristretto di specie e può essere limitata da alcuni

tessuti o organi. Tessuti organizzati come foglie, radici, fusti, perdono la loro struttura

specializzata e sono in grado di riconvertire il loro programma fisiologico. Alcune

cellule dell’espianto sono in grado di generare delle foglioline. A questo punto cosa

succede? Si può staccare la parte che si è fermata (poche foglioline), metterla in un

mezzo di coltura che induce la formazione di radice e poi avere la pianta da mettere in

terra. Tessuto somatico perché deriva dal soma, dal corpo della pianta. Cosa c’è

dietro processo? Alcune cellule perdono la “memoria” della loro differenziazione,

recuperano la capacità di cellule meristematiche e sono capaci di produrre delle nuove

strutture. Processo che comporta due fasi:

1. Induzione: cellule perdono la memoria e riacquistano la capacità di dividersi, in

questa fase però non si vede ancora nulla

2. Determinazione: queste cellule riescono a formare delle strutture (apici

radicali/apicali) e questa capacità di rigenerare è specie-specifica, dipende

molto dalla specie vegetale con cui si lavora. Alcune specie ad esempio il

tabacco, petunia rigenerano molto facilmente; altre rigenerano con molta più

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fatica o alcune non rigenerano affatto. Ciò che c’è sotto questa diversa risposta

è che molto probabilmente non si conoscono le condizioni ottimali da tutte le

specie.

Ogni specie necessità di un determinato apporto di sostanza specifiche e

concentrazioni ottimali di ormoni. La stabilità genetica è discreta.

Come si propagano le piante? Riproduzione sessuale, ma anche in modo asessuale.

Alcune cellule di struttura differenziate acquistano la capacità meristematica, ad

esempio di creare germogli.

Embriogenesi somatica diretta

L’embriogenesi somatica diretta consiste nella produzione di embrioni da cellule

somatiche o non germinanti. Tali embrioni sono capaci di percorrere la successione

delle fondamentali fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione dell’embrione

zigotico. Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare che evolve in un

embrione cotiledonare. In questo caso le cellule dell’espianto non buttano subito fuori

radice e foglie, ma formano delle strutture che ricordano l’embrione e seguono tutti i

passaggi tipici dello sviluppo dell’embrione zigotico. Si formano dei veri e propri

embrioni zigotici da cellule somatiche e sono in grado di ripercorrere gli steps tipici

dello sviluppo dell’embrione. Da zigote -> struttura globulare -> struttura a cuore

(differenziazione SAM e RAM) -> struttura cotiledone -> maturazione, essicazione,

dormienza -> crescita, germinazione. A partire dallo stadio globulare è possibile

osservare la progressione della polarità attraverso uno stadio a cuore, a torpedo fino

alla formazione dei cotiledoni e la completa differenziazione della plantula. Da

espianto -> cellula va incontro a differenziamento e dà origine a delle strutture ->

identiche a quelle dello zigote -> direttamente piantina. Seme immaturo -> induzione

degli embrioni somatici -> proliferano e si sviluppano -> si staccano e germinano ->

coltivazione in vaso.

Stadio di embriogenesi

Un embrione è caratterizzato dalla sua origine, morfologia e sua evoluzione nel tempo.

Origine: un embrione zigotico è il risultato della fusione di cellule gametiche.

 Per la formazione dell’embrione somatico non è necessaria questa fusione.

Morfologia: un embrione completo è un asse bipolare con un meristema

 apicale e uno radicale. È inoltre caratterizzato da cotiledoni.

Evoluzione: lo sviluppo dell’embrione è caratterizzato da una successione di

 stadi morfologici tipici -> globulare, a forma di cuore e torpedo o cometa

Cosa induce la morfogenesi diretta e l’embriogenesi somatica diretta?

Dipende dalle specie: alcune solo organogenesi, altri solo embriogenesi, altre possono

fare entrambe.

Morfogenesi indiretta

La morfogenesi indiretta consiste in un passaggio di sdifferenziazione prima della

formazione di nuove strutture organizzate. In questo caso tessuti organizzati come

foglie, radici, fusti perdono la loro struttura specializzata per accrescersi sotto forma di

un ammasso di cellule disorganizzate che prendono il nome di callo. Il tessuto

differenziato può sì differenziare per morfogenesi diretta, ma anche per quella

indiretta. In quella indiretta non si ha la formazione di radici, foglie o embrione

direttamente dalle cellule dell’espianto, ma c’è un passaggio in più in quando si forma

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una struttura che si chiama callo. Dal tessuto differenziato, come ad esempio una

foglia, si formano degli ammassi molto visibili di tessuto indifferenziato, formato da

cellule che hanno una morfologia molto diversa. In alcuni casi è bianco, in altri è

verde, in alcuni casi è estremamente colorato perché assumono dei pigmenti

fotosintetici. Quindi il callo è specie-specifico. Nel tabacco ha un aspetto più

spugnoso ed è bianco, mentre il callo dell’Arabidopsis è sempre bianco, ma sembra

più duro, sembra corallo. Le cellule del callo hanno un vacuolo molto piccolo, nucleo

molto grande e molto evidente. Simili alle cellule meristematiche. Il callo è inoltre

capace di proliferare indefinitivamente: le cellule del callo sono potenzialmente

immortali. Le cellule del callo sono anche in grado di differenziarsi e rigenerare delle

piante sotto una serie di condizioni, un gran numero di variabili:

Genotipo, parametro importante nel determinare il successo del passaggio a

 callo. Per esempio, le monocotiledoni sono più recalcitranti a formare il callo

delle dicotiledoni. Varietà di riso japonica formano callo da molti tessuti

Dimensione ed età espianto

 Condizioni di coltura, ogni specie necessita di un determinato apporto di

 sostanze specifiche e di particolari condizioni ambientali, quali quantità,

intensità radiazione luminosa e fotoperiodo

Intorno alla ferita la pianta deposita del nuovo materiale cellulare, per evitare infezioni

da patogeni e questo si ha tramite induzione. Il tessuto che si forma è un tessuto che è

molto vicino a quello che è stato chiamato callo in coltura in vitro perché non è un

tessuto differenziato, tessuto che è cresciuto rapidamente.

Rigenerazione del callo

Può ridifferenziare a dare un’intera piantina e può differenziare per organogenesi o

embriogenesi somatica -> possono derivare o degli organi o degli embrioni. In questo

caso si dice organogenesi indiretta o embriogenesi somatica indiretta per

indicare un ulteriore passaggio, ovvero la formazione del callo. Cosa fa imboccare

una strada o un’altra? È sempre un discorso specie-specifico. Nel caso della vite

vanno bene vari tipi di espianti (foglie, fiori o embrioni somatici) questi formano un

callo embriogenico che può dare origine ai vari embrioni somatici.

Tecniche di coltura in vitro

Si basano su due caratteristiche delle cellule vegetali: plasticità e totipotenza.

Plasticità: capacità di adattamento dei tessuti vegetali al variare delle condizioni

ambientali. Totipotenza: capacità della cellula vegetale anche completamente

differenziata di esprimere tutta la potenzialità genetica di una cellula meristematica.

Le piante sono immobili, quindi devono far fronte al circondario che cambia in situ.

Che cambia cosa vuole dire? Escursioni termiche non opportune, raggi UV, attacchi

patogeni. Riescono a riadattarsi metabolicamente in modo molto veloce, crescita e

sviluppo in funzione dell’ambiente che cambia. Una delle strategie ad esempio è

quello di arrestare la crescita. Per quanto riguarda la totipotenza: cellule totalmente

differenziate presentano silenziamento genetico che è reversibile. A differenza delle

cellule animali che possono rigenerare altri organismi SOLO a partire da cellule della

linea germinale, nelle piante qualunque tessuto può dar origine ad un nuovo individuo.

Con tecniche di micropropagazione in vitro, utilizzando degli espianti, si può indurre la

perdita del programma differenziativo. I calli sono colture di tessuti indifferenziati che

possono essere mantenute per lungo tempo in coltura, da cui possono essere

rigenerate piante intere o fertili. 4

Micropropagazione: crescita in vitro.

Pulizia mezzo di coltura -> preparazione nutrienti del terreno -> selezione e

sterilizzazione dell’espianto -> morfogenesi diretta o indiretta.

Espianto

Può essere prelevato da ogni parte della pianta! Più un tessuto è giovane più dà

garanzie di rispondere meglio in vitro. Partendo da foglie di solito si fanno dei

quadratini perché è meglio avere in coltura strutture con le medesime dimensioni, né

troppo piccole né troppo grandi. Bisogna lavorare con bisturi o altri strumenti e può

portare ad un danno delle cellule, bisogna essere delicati. Più piccolo è l’espianto

minori sono i rischi di fitopatie. I tessuti più interni sono meno contaminati. Lo stadio

giovanile dell’espianto influisce sul successo della coltura. Le condizioni della pianta

influiscono sul successo della coltura, se la pianta è sana, vigorosa e giovane ho più

garanzie di successo.

Sterilizzazione – condizione di asepsi

Caratteristica peculiare di tutti i tipi di coltura in vitro e la necessità di operare e

mantenere condizioni di asepsi rese necessarie dalla presenza nel substrato nutritivo

di zuccheri e di altri composti organici che favorirebbero lo sviluppo di microrganismi

inquinanti. Sterilizzazione superficiale del materiale di partenza, sterilizzazione degli

strumenti e dei materiali utilizzati e infine sterilizzazione dei substrati nutritivi. La

buona sterilizzazione del materiale vegetale prevede che: i microrganismi

contaminanti vengano completamente eliminati e che il tessuto non venga

danneggiato -> tempi di impiego e concentrazione degli agenti sterilizzanti vanno

messi a punto a seconda della sensibilità dei tessuti e della difficoltà di sterilizzazione.

Ad esempio le foglie vanno sterilizzate perché su di esse ci possono essere dei

patogeni perché messe in un terreno di coltura prolifererebbero i microrganismi

presenti sull’espianto che si moltiplicano più rapidamente della cellula vegetale.

Bisogna sterilizzare il materiale di partenza (espianto), anche tutto il materiale che

viene in contatto con la coltura in vitro: mezzo di coltura, strumenti da laboratorio

(pinzette ad esempio). I tempi di impiego e la concentrazione degli agenti sterilizzanti

vanno messi a punto a seconda della sensibilità di tessuti e della difficoltà di

sterilizzazione. Bisogna assicurarsi che i detergenti sterilizzanti non vadano ad

intaccare, a danneggiare l’espianto, le cellule dell’espianto. Protocollo: 5

Tagliare il materiale vegetale in porzioni di grandezza appropriata

 Sciacquare il materiale vegetale sotto acqua corrente

 Agitare in alcool per pochi minuti (alcool al 70% è più efficace per denaturare le

 proteine)

HgCl (0.1-1%) + 2 gocce/100mL di TWEEN 20 per 3-5 minuti (attività basata

 2 -

sull’azione del Cl e metalli pesanti che denaturano le proteine)

Risciacquare in acqua distillata sterile

 Ipoclorito di sodio (NaOCl, varichina commerciale) 7-15% + 2 gocce/100 mL di

 TWEEN20 per 10-30 minuti

Risciacquare diverse volte in acqua sterile distillata



Il TWEEN è un detergente che serve per abbassare la tensione superficiale questo

comporta la formazione minore di microbolle sulla superficie, serve per aumentare

l’efficienza della sterilizzazione. Ci sono dei materiali che sono molto ostici da

sterilizzare, ad esempio: foglie di eucalipto, è difficile arrivare a sterilizzare sotto la

cera; anche le foglie di salvia sono difficili da sterilizzare. Le cappe che vengono

utilizzate sono quelle a flusso laminare. La formazione di microbolle sulla superficie

dell’espianto potrebbe proteggere microbi e funghi dal contatto con il solvente di

sterilizzazione. L’aggiunta di detergenti riduce la tensione superficiale sulla foglia.

Ambiente di coltura

Si può utilizzare una piastra Petri, in vasi di vetro, in tubi, piastre Magenta (alta per

permettere la crescita de