Prof. Pelosi biotecnologie mediche (applicazioni biotecnologiche in medicina)

Tecniche in anatomia patologica

Reparto di tipo clinico

Le cellule allo stato nativo non sono colorate, vengono viste come ombre al microscopio sfruttando la diffrazione della luce, per questo servono strumenti che danno contrasto alle diverse porzioni della cellula.

Che cos'è l'anatomia patologica

Branca specialistica della medicina che studia le malattie umane mediante l'esame morfologico macro-microscopico e molecolare degli organi, dei tessuti e delle singole cellule. Studia quello che viene alterato nella malattia, le modificazioni che subiscono le singole cellule e i tessuti.

Strumento fondamentale per descrivere le modificazioni e le cause che le hanno sviluppate. L'indagine anatomopatologica consente di distinguere cellule e tessuti normali da quelli in cui si sia sviluppata un'alterazione valutabile morfologicamente, qualunque essa sia: infiammatoria, neoplastica, dismetabolica o regressiva (atrofia, necrosi).

Se le lesioni indotte da una malattia sono caratteristiche, il loro riscontro comporta la diagnosi di malattia. Analisi delle alterazioni, vedere se sono caratteristiche di una situazione diagnostica.

Alcune volte non si riesce a fare una specifica diagnosi, viene analizzato un quadro che può essere comune a diverse patologie, alterazioni simili in patologie diverse. Nella maggior parte dei casi, le diagnosi sono di tipo interpretativo, quando sono descrittive circoscrivono l'ambito diagnostico.

La diagnosi è il frutto di un ragionamento deduttivo/induttivo, giudizio diagnostico.

Identificazione di un determinato microrganismo, aumentato livello di glucosio nel sangue sono dei fenomeni biomarcatore: evento biologico che ha un certo significato. Non posso dire che il paziente è diabetico, può essere causato da altri fattori.

Tipologia di esame

Esami citologici

• Citologia esfoliativa
  • Spontanea: le cellule si distaccano spontaneamente (es: delle cellule dell'epitelio bronchiale nell'escreato, dell'epitelio urinario, presenza di cellule nel liquido ascitico).
  • Provocata: spazzolamento o brushing, staccate le cellule dalla superficie mucosa.
  Possono essere combinate: citologia esfoliativa + spazzolamento nel caso del PAP test; in questo caso le cellule derivano sia da un'esfoliazione naturale, ma viene provocata anche meccanicamente.
• Citologia agoaspirativa

  Estrazione di tessuto attraverso un meccanismo di depressione utilizzando l'ago direttamente nel sito della lesione, può virtualmente arrivare a tutte le zone del corpo umano.

  • Nodulo palpabile superficiale (identificazione manuale).
  • Nodulo non palpabile profondo (tecniche radiologiche).
  Viene utilizzato un ago di calibro inferiore a 1 mm; con la siringa si aspira e si raccolgono le cellule (devono restare nell'ago e non devono entrare nella siringa). Il materiale estratto dà indicazioni di tipo diagnostico, ma può anche essere inadeguato.

Usati 5 livelli, indipendenti dal tipo di cellule che vengono aspirate:

• C1: insufficiente o inadeguato
• C2: negativo
• C3: dubbio, probabilmente benigno
• C4: probabilmente maligno
• C5: maligno

Le cellule raccolte con il campione citologico sono separate le une dalle altre, si staccano da un contesto nativo in cui sono normalmente presenti. È necessario enfatizzare le alterazioni che si trovano nelle singole cellule: la diagnosi è citologica.

A volte, oltre le colorazioni di routine, servono altre tecniche di caratterizzazione molecolare per perfezionare la diagnosi e dare informazioni aggiuntive per il trattamento del paziente. Immunoistochimica, FISH, tecniche molecolari (estrazione di acidi nucleici e proteine), citoinclusione, si fanno anche analisi mutazionali.

Tecniche speciali

Tecnica dal citoagar

Fino a pochi anni fa, i campioni venivano strisciati sul vetrino e le cellule venivano osservate immediatamente dopo essere state asportate dal paziente. Le cellule vengono raggruppate tra loro e vengono disposte in un contesto particolare, in modo tale da poter ottenere più campioni da quello prelevato, si ottiene una sorta di frammento tissutale (come se fosse stata effettuata una biopsia).

1. Le cellule prelevate vengono raccolte in sospensione in un contesto liquido.
2. Centrifugazione e ottenimento di un pellet cellulare.
3. Trasformazione del pellet in un blocchetto istologico: viene aggiunta una sostanza che permette alle cellule di raggrupparsi le une con le altre, utilizzato agarosio o materiale gelificante.
4. Solidificazione del blocchetto.

È una tecnica molto utile e si cerca di applicarla spesso. Si tratta sempre di cellule decontestualizzate, ma raggruppate con questo sistema si perde una minore quantità di materiale; le cellule si trovano circoscritte in uno spazio ristretto. Possono essere utilizzate per colorazioni e per estrarre DNA/RNA in quanto derivano da un contesto alterato che si vuole investigare.

Citologia su strato sottile

Tecnica che si sta sviluppando. Le cellule vengono disposte in un unico monostrato, evitando che si sovrappongano le une sulle altre. Esistono varie tecniche che permettono di ottenere lo strato sottile.

Si cerca di eliminare il background di disturbo allontanando materiale che non si intende indagare (es: muco che tende a raggruppare le cellule e a ostacolare la visione). Possono essere utilizzati dei filtri attraverso i quali passa la sospensione e blocca solo certi tipi di cellule (in base alla dimensione dei pori del filtro).

Le cellule vengono messe in un contesto liquido che permette di eliminare il background con un filtro di 10-15 mm che trattiene le cellule e si trova appoggiato sul vetrino; le cellule rimangono aderenti alla superficie (vetrino carico positivamente) e concentrate in uno spazio ristretto.

Esami istologici

Sono basati su campioni di tipo tissutale; le cellule si trovano nella loro conformazione nativa, nel loro contesto originale.

Le indagini istologiche si possono dividere in base a quanto campione viene prelevato e come:

• Biopsia
  • Escissionale: asportata tutta la lesione.
  • Incisionale: asportata solo una parte della lesione.
  • Endoscopica: prelievo tramite tecniche che vanno all'interno di una cavità del corpo umano in modo meno invasivo di un metodo chirurgico, tecnicamente possono essere sia endoscopie escissionali (es: polipo intestinale) che incisionali.
  • Per ago: ha un calibro superiore al millimetro, maggiore di quello citologico, permette l'ottenimento di un cilindretto tissutale.
• Pezzo operatorio: campione grande, viene ottenuto durante un intervento chirurgico, demolizione parziale o completa di un organo.
• Autopsia: può essere considerato come un esame istologico in cui sono disponibili tutti i tessuti.

Esame estemporaneo o intraoperatorio

È un tipo di esame istologico particolare che viene effettuato quando durante un intervento chirurgico, al chirurgo servono delle informazioni particolari devono essere fornite tempestivamente, per decidere come procedere al meglio con l'operazione.

A cosa serve: a stabilire la presenza e la natura della lesione, a determinare lo stato dei margini chirurgici, margini di resezione, a stabilire l'adeguatezza diagnostica di un campione (anche se la precisa diagnosi potrebbe non essere possibile). Lo scopo dell'esame estemporaneo è quello di guidare l'intervento chirurgico, quindi deve avere tempistiche brevi (10-15 minuti, 20 minuti se utilizzata immunoistochimica), dare notizie cliniche complete, portare a una discussione del caso con il chirurgo.

È necessario avere abbastanza tessuto per ricavare delle sezioni sufficientemente sottili che permettono il passaggio della luce e quindi l'analisi delle cellule. Deve avvenire una veloce solidificazione del tessuto per congelamento ma dà alcuni problemi, in quanto i cristalli di acqua causano espansione volumetrica e possono provocare lisi cellulare, quindi perdita dell'asse morfologico della cellula. Per evitarlo, l'acqua deve essere sostituita con qualcosa che una volta congelato non si espande, solitamente isopropanolo o alcool isopropilico che consentono l'eliminazione di alcool dalla cellula.

1. Trattamento con alcool isopropilico che va a sostituirsi all'acqua deve avvenire a basse temperature, altrimenti le cellule una volta messe in azoto liquido possono lisarsi a causa dello shock termico.
2. Campione viene messo in azoto liquido (-196°C), in modo tale che si solidifichi.
3. Vengono tagliate le sezioni con un criostato (microtomo con camera a -25-30°C).
4. La sezione viene appoggiata sul vetrino a temperatura ambiente (si attacca da solo per differenza di temperatura).
5. Colorazione e osservazione al microscopio.

Tempistiche

L'esame citologico richiede dalle 3 alle 24 ore, ha un'accuratezza diagnostica molto elevata (quasi il 100%), ha un costo basso e si presta alle indagini di screening per gli individui a rischio, che possono essere un'ampia parte della popolazione, es: PAP-test.

L'esame istologico richiede dalle 24 alle 48 ore. L'esame autoptico può richiedere oltre le 48 ore.

Tecnologie in citologia

Il campione biologico viene sottoposto a:

1. Strisciamento o centrifugazione.
2. Fissazione a fresco o dopo essicamento.
3. Colorazione.
4. Esame microscopico.

Nella maggioranza dei casi, il campione viene fissato con l'etanolo, alcool è un fissativo di tipo coagulativo: fa precipitare le proteine evitando che avvengano processi di autolisi post-mortale. L'asciugatura avviene all'aria, gli enzimi che degradano la matrice cellulare sono delle idrolasi, l'essicamento blocca i processi di autolisi. La morfologia cellulare si preserva di più con i processi di fissazione.

Colorazione di Papanicolaou

Il vetrino viene passato in alcool a concentrazioni decrescenti fino ad acqua distillata. Si aggiunge ematossilina di Harris che colora i nuclei in blu-viola. Si lava con acqua distillata. Si passa in orange G6 e poi in colorante EA (soluzione policroma di eosina + bruno Bismark + luce verde) che colorano i citoplasmi e le varie componenti per consentire il riconoscimento delle cellule. L'orange G6 permette la distinzione tra le cellule squamose cheratinizzate (producono cheratina che si accumula nelle cellule) e cellule della esocervice. EA50 viene usato per preparati ginecologici. EA65 viene usato per preparati non ginecologici. Servono circa 20-40 minuti.

Colorazione di May-Grünwald-Giemsa

I due coloranti vanno a colorare parti diverse del nucleo e del citoplasma. Viene utilizzata in ambito ematologico per identificare le diverse sottocategorie di leucociti (granulati e non, sottopopolazioni).

Tecniche in istologia

Il campione istologico passa attraverso queste fasi:

1. Riduzione.
2. Fissazione.
3. Inclusione.
4. Taglio e colorazione.
5. Esame microscopico.

Mediamente sono necessarie 48 ore (in casi in cui si deve vedere se c'è un rigetto in atto, l'esame viene effettuato più velocemente).

Riduzione

O campionamento. Vengono effettuati prelievi specifici seguendo dei criteri che permettono di ottenere dei campioni rappresentativi della situazione clinica. Si deve scegliere cosa andare effettivamente ad analizzare.

Fissazione

Serve ad evitare i fenomeni degradativi autolitici post-mortali. Non è sinonimo di necrosi. Il campione viene fissato con formalina al 3.7%, aldeide formica, agente fissante che in soluzione acquosa si chiama formalina. L'aldeide formica è cancerogena, ma non esiste ancora un sostituto valido. È un fissativo progressivo che agisce formando legami covalenti crociati tra i residui delle proteine. Il numero dei legami aumenta in funzione del tempo, la consistenza aumenta progressivamente e può diventare duro tagliato per successive analisi anatomopatologiche. Il campione non deve restare troppo tempo in formalina, l'ideale è dalle 12 alle 24 ore (sconsigliato oltre le 72 ore).

Inclusione

Il campione viene inserito in cassette di inclusione, le quali hanno delle griglie che permettono il libero passaggio dei liquidi. L'obiettivo finale è quello di avere un campione sufficientemente solido da poter essere tagliato con il microtomo, in modo tale da ottenere una sezione istologica. Viene utilizzata la paraffina, in quanto è la sostanza che permette meglio di aumentare la consistenza. Vengono utilizzati dei processatori automatici (effetto combinato di calore e microonde).

Per poter trattare il campione in paraffina:

• L'acqua deve essere allontanata dal campione: passaggi graduali in alcool a varie concentrazioni fino all'alcool assoluto.
• Il campione deve essere passato in xilolo in quanto la paraffina non è solubile in alcool. Lo xilolo (o altri idrocarburi simili, cancerogeni) ha anche il ruolo di diafanizzazione: sostituisce l'acqua e trasforma il tessuto in un materiale semi-trasparente.
• Il campione viene aggiunto in paraffina a massimo 60°C: penetra nel campione, anche nelle singole cellule (processo lento, servono diverse ore).
• Il campione immerso in paraffina deve essere messo su un blocco più grande (sempre di paraffina): fase di inclusione, corretta superficie di taglio per la lama del microtomo, è necessario orientare bene i campioni.

Taglio con microtomo

Taglio di una sezione istologica che ha lo spessore di 2-3 micron. Viene prelevata con un pennello al quale aderisce mediante forze elettrostatiche e viene poi appoggiata a bagno a 42°C affinché la sezione si distenda (devono essere eliminate le grinze che si formano con il taglio). L'acqua ha un'elevata tensione superficiale: ammorbidisce e distende la paraffina. Il vetrino viene poi messo in stufa in modo tale da asciugare tutta l'acqua.

Colorazione

Necessaria per dare contrasto. Colorazioni:

• Ematossilina-eosina istomorfologica: l'ematossilina colora in blu gli acidi nucleici, l'eosina colora in rosa/rosso la matrice extracellulare e il citoplasma.
• Colorazioni speciali costituenti di tessuti o microrganismi.
• Colorazioni istochimiche zuccheri, lipidi, ferro, etc.
• Colorazioni immunoistochimiche singole molecole.

Le colorazioni sono delle reazioni chimiche. Avvengono tramite interazioni delle molecole coloranti ai tessuti mediante interazioni chimico-fisiche (anche se a volte sono sconosciute). Formazioni di legami covalenti ed elettrostatici. Le colorazioni avvengono sempre in ambiente acquoso, per i campioni in paraffina deve essere effettuato il processo inverso, scala di sostanze in cui la paraffina è solubile, prima lo xilolo e poi scala di alcool. Campioni devono essere portati all'acqua.

Ematossilina

Sostanza naturale di origine vegetale, viene estratta da un albero, come tale non è un colorante, non riesce a interagire chimicamente con il suo substrato biologico. Per ottenere la colorazione, l'ematossilina deve essere ossidata a emateina. L'emateina è un chelante che lega sali (ioni metallici) che a loro volta legano il campione. L'emateina come tale è un anione (carica negativamente come il DNA) quindi ha una scarsa disponibilità a interagire con gli acidi nucleici.

Deve essere cambiata la carica elettrica, vengono forniti sali (alluminio, ferro, cromo) carichi positivamente con i quali la molecola si complessa, processo di mordenzatura. Viene ottenuto un prodotto insolubile (lacca), che si lega al composto mediante interazioni elettrostatiche.

L'interazione con gli acidi nucleici è di tipo elettrostatico, i coloranti cationici si localizzano nella parte esterna del DNA, quindi senza danneggiarlo (non sono intercalanti). Il DNA rimane nella sua conformazione nativa, è possibile estrarlo. Il sale più utilizzato per la mordenzatura è l'allume di potassio, prodotto non solubile, lacca ottenuta: emallume (ematossilina Mayer, Carazzi, Harris), colora i nuclei in blu/azzurro intenso. I sali di ferro e cromo danno colorazioni di tonalità differenti (blu, rossastro) e hanno utilizzi limitati.

L'ematossilina è una colorazione progressiva; l'interazione tra la sezione e l'ematossilina avviene per un certo tempo, poi la sostanza che non si è legata al suo substrato viene allontanata medianti lavaggi in acqua (lavaggio di contrasto). Altre ematossilina agiscono in modo regressivo: colorano rapidamente e intensamente il substrato, dopo di che l'eccesso viene allontanato.

Eosina

È un colorante acido. Viene utilizzata in soluzione acquosa o in soluzione alcolica. I derivati maggiormente utilizzati sono due analoghi strutturali:

• Eosina Y (yellowish): 4 molecole di bromo.
• Eosina B (bluish): 2 molecole di bromo e 2 gruppi nitroso -NO₂.

L'eosina colora i citoplasmi e la sostanza extracellulare di rosa/rosso. Non si conoscono le basi chimiche di interazione con il substrato.