Prof. Pelosi biotecnologie mediche (applicazioni biotecnologiche in medicina)

INTEGRAZIONE DEI RISULTATI

∎

La cellula o la struttura che viene identificata deve avere un aspetto atteso rispetto a quello che si sta andando a ricercare ⇾

verosimiglianza morfologica

Il risultato deve essere finalizzato alla diagnosi (ma anche alla ricerca)

- attività diagnostica

viene enfatizzato il singolo risultato a livello del singolo paziente, l’obiettivo principale è quello di arrivare a una diagnosi per poter

trattare adeguatamente il paziente

si deve sempre ottenere un risultato, non devono esserci falsi positivi o falsi negativi

- attività di ricerca

si ragiona in un termine più ampio, casistica

possibile scartare campioni non adeguati perché una reazione non è avvenuta bene

• Applicazioni della diagnosi immuno-istopatologica

⇾ caratterizzazione delle neoplasie poco differenziate che non possono essere tipizzate correttamente solo su base morfologica

es: carcinoma anaplastico, melanoma amelanocitico, tumore a cellule germinali, linfoma a grandi cellule

⇾ caratterizzazione delle malattie linfoproliferative andando a individuare le sotto-popolazioni

⇾ identificazione della sede primitiva di lesioni metastatiche in quanto la positività per determinati marcatori identifica

univocamente la provenienza delle metastasi

Marcatori tessuto-specifici

- ER marcatore mammario e ovarico

- TTF-1 marcatore polmonare e tiroideo

- CDX-2 marcatore intestinale

- Hep-1 marcatore epatocellulare

Spesso non sono così tessuto-specifici, ma magari indicativi di un determinato stadio di malignità e che in generale possono venire ri-

espressi in molti tipi di neoplasie diverse

Esempio: rilevata presenza di cellule epiteliali a livello del midollo osseo (non dovrebbero esserci in condizioni di normalità)

utilizzando diversi anticorpi si è visto che queste cellule sono positive per il recettore degli estrogeni, rappresentano quindi delle

metastasi midollari che hanno origine da un tumore mammario (nella storia della paziente)

• Identificazione di marcatori a scopo terapeutico

I recettori degli estrogeni sono presenti in circa l’80% dei carcinomi alla mammella hanno un debole ruolo prognostico

l’espressione di questi recettori è correlata a una prognosi leggermente migliore

E’ molto rilevante per il ruolo predittivo ⇾ capacità di utilizzare una terapia endogena

Tamoxifen

ER agisce stimolando la proliferazione cellulare, esiste un farmaco, il , che va a competere con gli estrogeni per il legame al

recettore nucleare ⇾ inibizione della proliferazione

Per poter somministrare il farmaco, tutti i carcinomi della mammella devono venire testati per la presenza di ER per sapere che tipo di

terapia verrà successivamente effettuata (capire se il Tamoxifen può servire alla donna o no) ⇾ fattore predittivo

Il marcatore rappresenta un fattore predittivo se è in grado di predire la buona riuscita di una terapia dal punto di vista clinico

Fattore prognostico ⇾ definisce il grado di influenza della malattia sull’aspettativa di vita del paziente

Fattore predittivo ⇾ definisce come la terapia è in grado di influenzare l’andamento della malattia

Un fattore prognostico può anche essere predittivo, ma di solito viene amplificato solo uno dei due aspetti

Riassunto delle fasi di colorazione immunoistochimica

Tutte le reazioni di colorazione devono avvenire in ambiente acquoso

Un campione citologico deve essere idratato, mentre un campione istologico in paraffina deve essere portato all’acqua

Ogni passaggio necessita di lavaggi in soluzioni tampone per eliminare l’eccesso di reagente

1. Inattivazione dell’enzima di rilevazione endogeno in quanto potrebbe inferire con la reazione di rilevazione

di solito si tratta di perossidasi e fosfatasi alcalina

2. E’ necessario prevenire il legame aspecifico dell’anticorpo primario al di fuori del punto di reazione antigene di interesse-anticorpo

Si devono eliminare le cariche elettriche interferenti utilizzando soluzioni di BSA/HSA (non deve essere lavato via) oppure dei

composti commerciali

3. Applicazione dell’anticorpo primario (incubazione di 30/60 minuti)

4. Applicazione dell’anticorpo secondario coniugato con la molecola di enzima che riconosce l’anticorpo primario sistema di

⇾

rilevazione

5. Aggiunta della soluzione di cromogeno (prodotto in soluzione incolore) che permette di rilevare il segnale

Nel caso della perossidasi di rafano è la diaminobenzidina in presenza di H O , l’ossigeno va ad ossidare la diaminobenzidina e si

⇾ 2 2

forma un precipitato giallognolo nelle zone dove si trova l’enzima

L’effetto colorante può essere accentuato applicando degli intensificatori basati sull’utilizzo di soluzioni di solfato di rame

6. Bisogna dare risalto e contrasto alle cellule controcolorazione

⇾

ma non bisogna coprire il colore ottenuto dalla reazione immunoistochimica

Si utilizza una sostanza che colora solo i nuclei, non tutta la cellula

Si utilizzano dei particolari tipi di ematossiline molto diluite, i nuclei ottenuti sono colorati tenuamente in azzurro

7. Il campione deve essere trasformato in un campione permanente che resiste nel tempo

Le reazioni fino a questo momento sono avvenute in ambiente acquoso su un vetrino porta-oggetto

Il vetrino porta-oggetto deve essere coperto con il vetrino copri-oggetto

per l’adesione vengono utilizzate delle reazioni idro-insolubili percorso inverso rispetto alla deparaffinizzazione, dall’acqua scale di

⇾

alcool (si arriva in xilolo)

8. Ottenimento del preparato finale

FISH

Rappresenta la tecnica che nell’ambito dell’ibridazione in situ ha una maggiore rilevanza a livello clinico

Può avere valenza diagnostica, prognostica e predittiva

FISH Fluorescence In Situ Hybridization

⇾

Tecnica di ibridazione degli acidi nucleici, viene utilizzata una sonda complementare al gene o al cromosoma che si vuole individuare

La sonda è legata a un fluorocromo che eccitato in ultraviolette emette fluorescenza

L’ibridazione viene effettuata direttamente sulla sezione istologica o nel preparato istologico a vetrino in situ

⇾

Le sonde marcate con sostanze fluorescenti si legano a un gene o cromosoma specifico e il risultato viene valutato con un microscopio a

fluorescenza

Il più delle volte si utilizza del materiale fissato in paraffina, analisi del DNA di cellule in interfase

E’ una tecnica molto utile soprattutto nello studio di cellule neoplastiche che sono caratterizzate da molte alterazioni cromosomiche e

geniche che portano a una de-regolazione della sopravvivenza e del ciclo cellulare visibili molte cellule in fasi del ciclo cellulare

⇾

diverse

Nella maggioranza dei casi, le tecniche di ibridazione in situ vengono applicate a campioni istologici, ma possono essere utilizzati anche

campioni citologici e colture cellulari

L’ibridazione cerca di localizzare un acido nucleico utilizzando una sonda complementare alla sequenza di DNA o RNA che si vuole

mettere in evidenza (in diagnostica si utilizza soprattutto il DNA)

Esistono due categorie:

- visualizzazione con un comune microscopio in campo chiaro

- visualizzazione in un campo scuro

servono dei marcatori della sonda fluorocromi che eccitati da radiazioni di luce con lunghezze d’onda minori e maggiore energia

⇾

(luce UV) consentono l’emissione di una radiazione luminosa nello spettro del visibile a lunghezza d’onda diversa a seconda del

fluorocromo utilizzato

E’ necessario seguire una serie di step progressivi

1. Preparazione del campione

2. Denaturazione del campione e della sonda, avvengono nello stesso momento e sulla stessa sezione co-denaturazione

⇾

3. Ibridazione sonda/campione

4. Lavaggio post-ibridazione stringenza, allontanamento della sonda non legata

⇾

5. Controcolorazione dei nuclei con DAPI

consente di localizzare il nucleo, quindi di contestualizzare il segnale che si va a rilevare e per eventualmente contare le cellule

4’,6-diamidino-2-phenylindole

6. Rivelazione al microscopio

1. Preparazione del campione

Fase cruciale, fondamentale per la qualità della colorazione finale e per l’interpretazione

La qualità del segnale che viene analizzato dipende a sua volta dal campione in sé e da tutte le fasi pre-analitiche alle quali viene

sottoposto prima di iniziare la rilevazione

Importanza della fissazione e dell’eventuale utilizzo di sostanze che possono interferire con la reazione di ibridazione

Fissazione

Il campione citologico viene normalmente fissato in etanolo, il quale non interferisce con il legame sonda-DNA

Il campione può essere anche essiccato all’aria e colorato con GIEMSA, in questo caso il materiale è sub-ottimale

Il campione istologico di solito è fissato in formalina, la durata della fissazione è fondamentale perché la formalina continua a formare

dei legami crociati che possono impedire la reazione di ibridazione

Questi legami covalenti devono essere rotti con dei pre-trattamenti

Dopo 72 ore di fissazione è difficile ottenere buoni risultati in FISH, il materiale ottimale non deve essere fissato per oltre 24/48 ore

Esistono alcuni fissativi che vengono utilizzati per allestire preparati istologici che però danneggiano in modo irreversibile la possibilità

di avere la reazione di ibridazione reagenti contenenti acido picrico non devono essere utilizzati

⇾

La decalcificazione è indispensabile quando si utilizza del materiale osseo, ma impedisce di avere buoni risultati con la FISH

Spessore

Lo spessore delle sezioni è molto importante, bisogna analizzare dei nuclei che non devono essere sovrapposti gli uni sugli altri

se la sezione è troppo spessa, c’è sovrapposizione dei nuclei e quindi anche del segnale

Devono essere utilizzate sezioni di 2-3 micron, non devono essere troppo sottili perché si rischia di perdere del segnale

Per consentire l’adesione perfetta della sezione sul vetrino porta-oggetto, vengono utilizzati dei vetrini caricati positivamente che

permettono un’adesione perfetta

Le reazioni che avvengono nella FISH sono in ambiente acquoso, i campioni in paraffina devono essere portati all’acqua come avviene

per le reazioni immunoistochimiche, vengono utilizzati dei tamponi a pH 7.2-7.4

La sezione è ricca di proteine a carica negativa che interagiscono mediante interazioni elettrostatiche deboli con il vetrino carico

positivamente

La sezione di un tessuto adiposo si stacca più facilmente dal vetrino perché durante il pre-trattamento avviene la perdita della maggior

parte dei citoplasmi degli adipociti e quindi si avranno pochi punti di contatto tra il vetro e il campione

Pre-trattamenti

Servono ad eliminare i legami crociati e la componente proteica per portare alla corretta ibridazione dei filamenti di DNA

Bisogna allontanare la cromatina vengono utilizzati degli enzimi proteolitici comb