Biotecnologie genetico-molecolare

Biotecnologie genetico-molecolari

Cellula procariota come modello di studio e applicazione

La cellula procariota è una cellula aploide, ovvero possiede solo un cromosoma batterico chiamato DNA cromosomale; è una sola molecola presente in forma chiusa circolare superavvolta (doppio filamento) e la conformazione viene indicata con 3C (circolare covalente chiusa). Questa molecola di DNA presenta più di un milione di basi nucleotidiche in sequenza; distesa in tutta la sua lunghezza raggiunge la dimensione di 1mm. Il DNA è la molecola che contiene tutte le informazioni della cellula.

La cellula procariota può contenere anche molecole di DNA extracromosomale che sono noti come plasmidi, i quali non contengono informazioni fondamentali per la vita e la sopravvivenza della cellula ma informazioni addizionali; essi sono degli elementi genetici mobili quindi possono essere acquisiti e persi da una cellula in funzione di vari eventi ed inoltre sono molto piccoli quindi la dimensione piccola facilita l’eventuale trasferimento da una cellula all’altra o all’interno di una stessa.

Utilizzare la cellula procariota come modello permette di capire fenomeni come il trasferimento genico orizzontale legato alla resistenza agli antibiotici. I plasmidi rappresentano nell’ingegneria genetica degli idonei vettori di clonaggio, ovvero possono trasferire informazioni genetiche da una cellula all’altra e quindi permettere ad esempio di valutare se un ceppo è idoneo per esser utilizzato nel settore alimentare. I plasmidi possono replicarsi autonomamente più volte e permanere nella cellula batterica per numerose generazioni. È necessario che ci sia compatibilità tra la cellula ospite e il plasmide. Non tutti i plasmidi che la cellula può incontrare durante la sua vita possono essere acquisiti. I plasmidi possono trovare un sito di riferimento sul DNA cromosomale e integrarsi all’interno, questi sono noti con il nome di episomi.

Linee evolutive e albero filogenetico

• Archaea: sono batteri procarioti estremofili, ovvero sono stati isolati in ambienti come ghiacciai etc.; hanno una composizione chimica della parete e della membrana diversa da quella degli altri.
• Bacteria: eucarioti.
• Eukarya: eucarioti; sono animali, funghi e piante.

La cellula eucariota è nata dalla simbiosi casuale di due cellule procariote che si trovavano a colonizzare uno stesso ambiente ed in questo erano in difficoltà per cui si sono organizzate, ovvero una delle due cellule è entrata nell’altra specializzandosi in qualche funzione che ha permesso alle cellule tenute insieme di sopravvivere ed adattarsi meglio ai nuovi cambiamenti ambientali. In questa teoria quindi i mitocondri e i cloroplasti sono delle cellule procariote che sono entrate in altre cellule specializzandosi nella respirazione nel caso dei mitocondri o nella raccolta dei vari elementi per effettuare la fotosintesi nelle cellule vegetali nel caso dei cloroplasti.

Questi organelli presenti nelle cellule eucariote hanno conservato dell’RNA, del DNA e dei ribosomi che hanno le stesse caratteristiche delle cellule batteriche. Questa scoperta ha permesso di poter studiare le distanze evolutive dei vari microrganismi e di costruire l’albero filogenetico perché si è trovato quello che viene chiamato orologio molecolare, ovvero una macromolecola interazionale che fosse presente in tutte le cellule, da quella più antica alle nostre, sia in quella procariota che nella eucariota; questa macromolecola è stata studiata per quanto riguarda la sua sequenza ed è stato visto che poche variazioni di sequenza sono intercorse nell’arco di miliardi di anni, il che voleva dire che è una macromolecola che possedeva un’informazione indispensabile per lo sviluppo di tutte le cellule. Questi studi hanno permesso di individuare come orologio molecolare l’RNA ribosomale che è presente nella subunità più piccola dei ribosomi batterici. Il gene che codifica per questo prodotto sarà un gene target per diverse metodologie genetico-molecolari.

RNA ribosomale e ribosomi

L’RNA ribosomale è stato trovato in tutte le cellule. La sequenza di basi nucleotidiche che porta alla formazione di questo RNA ribosomale ha subito nel corso degli anni pochissimi cambiamenti quindi è una molecola che è stata altamente conservata all’interno di tutte le cellule, con le quali è stato possibile calcolare le distanze evolutive. I ribosomi sono costituiti da due subunità, che nel caso dei batteri queste sono distinte da un coefficiente di sedimentazione (70S = unità Svedberg). La subunità più grande ha una densità di 50S e quella più piccola 30S, quando queste si uniscono si forma un ribosoma attivo 70S in quanto parliamo di densità e non di peso. Queste per essere attive contengono del RNA ribosomale; quello presente nella subunità più piccola ha una densità di 16S e viene chiamato rRNA 16S, mentre rRNA 23S costituisce la subunità più grande. Questi rRNA hanno le stesse caratteristiche ma essendo 16S più piccolo è stato considerato come un orologio molecolare. Il ribosoma 16S è codificato da un gene specifico chiamato 16S-rDNA, target presente con una sequenza poco variata tra i vari microrganismi che può essere utilizzata per metter appunto delle metodiche senza necessariamente conoscere a priori con quale ceppo abbiamo a che fare.

Ricombinazione genica

I processi della ricombinazione genica sono i principali meccanismi con cui la cellula cerca di evolversi. Lo scopo principale della cellula quando si trova in un ambiente è la sopravvivenza, ovvero cercare di adattarsi alle condizioni ambientali e di colonizzare l’ambiente. Quando si parla di colonizzazione, si parla di crescita microbica, in quanto più cellule della stessa progenie sono in grado di crescere in quell’ambiente minore sarà la competizione che bisognerà avere con cellule di altro tipo che avranno altre caratteristiche, in modo da recuperare dall’ambiente tutti gli elementi necessari.

Non sempre la cellula si trova in un ambiente favorevole, sia per la stessa crescita che cambia i parametri ambientali sia perché alcuni parametri colturali non sono più presenti nell’ambiente, quindi la cellula ha bisogno di evolversi, cioè di cambiare in modo tale da esser in grado di vivere in un ambiente diverso rispetto a quello ideale. Cambiare per una cellula significa modificare o acquisire delle nuove informazioni che portano ad avere dei prodotti diversi che possano essere impiegati nel nuovo ambiente e quindi si tratta di fenomeni che vanno a modificare poco o tanto a seconda del processo quella che è la sequenza di basi nucleotidiche del DNA ribosomale.

I processi più noti di ricombinazione genica sono: trasformazione, coniugazione e trasduzione.

Trasformazione

I batteri non hanno una riproduzione sessuale come le cellule eucariote dove attraverso i fenomeni di crossing-over si può avere la variabilità e quindi l’evoluzione, di conseguenza hanno bisogno di modificare il proprio DNA cambiandosi una piccola porzione del DNA cromosomale che deriva da una cellula donatrice e viene acquisito da una cellula ricevente; sono quindi degli scambi unidirezionali.

L’esito di questi processi che in alcuni casi sono proprio mediati dalla cellula che sente che ci sono degli stress ambientali per cui o cerca di cambiare o andrà incontro alla morte; i risultati di questi processi di ricombinazione non sono noti alla cellula, quindi la cellula rischia di metter in atto questi meccanismi sperando che questi possano migliorare la sua vita e non peggiorarla; per questo questi eventi in natura avvengono con bassa frequenza.

La trasformazione è il processo più semplice che non implica un vero e proprio contatto tra cellule. La cellula può vivere in un ambiente in cui è presente del DNA cromosomale o dei frammenti di DNA che derivano dalla lisi e dalla morte di altre cellule che sono presenti nell’ambiente e le cui macromolecole si stanno degradando. Quindi dei sensori chimici segnalano alla cellula che è presente del DNA cromosomale esterno, che proviene da un’altra cellula batterica.

Se la cellula ha necessità di evolversi, metterà in atto quello che viene chiamato stato di competenza, ovvero attiverà una serie di informazioni presenti sul proprio DNA cromosomale al fine di sintetizzare proteine ed enzimi che sono specifici per il processo di acquisizione di quel DNA esterno alla cellula. Quindi è un processo voluto e mediato dalla cellula. Se la cellula decide di acquisire questo DNA estraneo, attiverà delle proteine di trasporto specifiche che sono presenti a livello della membrana e della parete; a volte se il DNA esterno è abbastanza grande si hanno delle nucleasi che vanno in parte a degradarlo o a trasformare il DNA a doppio filamento in un singolo filamento, che è più facile da acquisire.

Una volta che queste proteine di trasporto portano all’interno questo DNA esogeno, si attivano altre proteine per stabilizzare questo filamento di DNA per evitare che si ripieghi su se stesso e lo portano nella regione nucleare dove si trova il DNA superavvolto. A questo punto altre proteine specifiche vanno a cercare lungo il DNA cromosomale se ci sono dei siti in cui il DNA esogeno può integrarsi; questa integrazione è legata alla presenza di particolari basi nucleotidiche alle quali il filamento di DNA può legarsi.

Se questo è possibile e quindi questa proteina trova il sito di inserimento, attraverso una serie di enzimi specifici che tagliano il DNA cromosomale e permettono l’inserimento del DNA esogeno, si ha l’integrazione e si ha un DNA cromosomale modificato rispetto a quello nativo. L’esito può essere positivo se il DNA è riuscito ad integrarsi e quella frazione di DNA contiene delle informazioni che sono rimaste intatte e possono essere espresse dalla cellula; se tali informazioni sono tali da dare un miglioramento alla cellula, essa avrà acquisito delle caratteristiche in più che permettono la sopravvivenza.

L’esito potrebbe essere negativo, a partire dal fatto che il DNA esogeno non si è integrato nel DNA cromosomale, ma esso viene degradato da specifici enzimi per poter utilizzare i vari componenti come le basi nucleotidiche per la sintesi di nuove molecole da parte della cellula. Oppure l’esito è negativo in quanto questo DNA esogeno che si è inserito non porta nessuna informazione utile per la sopravvivenza, oppure perché il DNA esogeno si è inserito all’interno di un gene che si è inattivato.

Questo processo di trasformazione avviene maggiormente tra i gram-positivi (+) e a livello di laboratorio si riesce ad indurre lo stato di competenza in modo tale che la cellula che stiamo studiando possa attivare tutte le proteine e gli enzimi che serviranno per l’acquisizione del DNA esogeno. Per alcuni gram+ è sufficiente farli crescere in presenza di un’elevata concentrazione di cloruro di calcio che sembra attivare una serie di segnali che possano poi attivare tutte quelle informazioni per ottenere le proteine e gli enzimi che fanno partire il processo di trasformazione. Si mette poi a contatto una miscela di cellule competenti con una miscela di DNA che vogliamo trasferire all’interno. I processi di trasformazione che vengono effettuati in vitro molte volte vengono mediati dal plasmide perché è più semplice, in quanto il plasmide può stare da solo nel citoplasma e non ha bisogno del sito di integrazione nel DNA cromosomale.

Coniugazione

La coniugazione prevede il contatto diretto tra due cellule, che nei gram negativi avviene con la formazione del ponte coniugativo mediato dal pilo F; ci sono delle cellula gram- che posseggono un plasmide F che possiede le informazioni per far produrre alla cellula un pilo sessuale F che è il vero e proprio organo di contatto tra la cellula che ha prodotto il pilo F chiamata F+ e una cellula F- che non possedendo il plasmide non è in grado di produrre il ponte coniugativo e quindi di correlarsi ad altre cellule.

Nel processo più semplice, in particolari condizioni ambientali, la cellula F+ prende contatto con un’altra cellula F- e si forma il ponte coniugativo che è un pilo cavo all’interno, attraverso il quale può passare uno dei due filamenti di cui è costituito il DNA plasmidico attraverso un particolare meccanismo chiamato meccanismo di rolling-circles, per cui quando si forma il ponte coniugativo, il plasmide F si rompe in un punto di uno dei due filamenti e attraverso un meccanismo di rotazione circolare uno dei due filamenti si srotola dal plasmide e viene mantenuto stabile e passa attraverso il ponte coniugativo e raggiunge la cellula ricevente F-; quando tutto il filamento del plasmide è entrato nella cellula F- si attivano in entrambe le cellule (donatrice e ricevente), dei meccanismi di replicazione del filamento complementare (qualsiasi DNA per essere attivo deve essere a doppio filamento). Proteine ed enzimi specifici vanno nelle due cellule (F+ e F-) a ricostituire il filamento complementare e a formare un nuovo plasmide F completo. Quindi la cellula F+ ha donato la capacità alla cellula F- di diventare F+. Questo è il processo più semplice, ma non porta la cellula ricevente ad avere grande variabilità, non ha acquisito altre informazioni.

La coniugazione diventa efficiente come meccanismo di ricombinazione quando il plasmide F è presente nella cellula donatrice sotto forma di episoma, vale a dire molte volte il plasmide F si trova incorporato nel DNA cromosomale e non è libero nel citoplasma. Il plasmide F possiede poche caratteristiche informazionali, però possiede il punto OriT che è l’origine di replicazione, che è il punto che viene tagliato per permettere al singolo filamento di passare alla cellula ricevente e possiede anche un sito che viene riconosciuto a livello del DNA cromosomale per poter essere integrato perché è un plasmide che viene integrato nel cromosoma batterico senza danneggiarlo, in quanto c’è compatibilità tra di loro.

Questi due siti possono essere presenti in punti diversi del plasmide e questo cambia poi l’esito della coniugazione perché quando il plasmide si è inserito e ha l’origine dello srotolamento in un punto diverso rispetto a quello di inserimento si integra nel DNA cromosomale in questo modo: quando la cellula F+ viene a contatto con una cellula F- e si forma il ponte coniugativo, questo induce il plasmide a srotolarsi ed essendo legato al DNA cromosomale, questo srotolamento porta a far passare attraverso il ponte coniugativo, tutto il plasmide a seconda che il sito di inserimento sia vicino o lontano al sito dello srotolamento, ma insieme al plasmide entra anche il filamento del DNA cromosomale a cui il plasmide F era legato come episoma. Questo vuol dire che se le cellule stessero in contatto per molto tempo potrebbe passare nella cellula F-, il plasmide o parte di esso e tutto un filamento del DNA cromosomale. Questo non avviene perché le cellule nel corso dell’evoluzione hanno imparato ad avere un tempo di contatto molto breve perché la cellula non è in grado di ricevere tutto il DNA di un’altra cellula. Quindi il tempo di contatto breve fa sì che nella cellula ricevente passi il plasmide o una frazione di esso e una frazione soltanto del DNA cromosomale della cellula donatrice. Questo implica che la cellula ricevente non ha acquisito solo il plasmide F ma ha anche delle informazioni che provengono dal DNA cromosomale e questo potrebbe portare ad una variabilità genetica. Queste cellule che hanno subito una variazione genetica vengono chiamate Hfr (alta frequenza di ricombinazione) perché hanno effettuato il processo di coniugazione nel momento in cui il plasmide F era presente nella cellula donatrice come episoma e come tale ha avuto la possibilità di acquisire del DNA cromosomale della cellula donatrice. Possono essere Hfr+ F+ o F- a seconda che sia riuscito ad entrare tutto il filamento del plasmide F perché i due siti, quello di integrazione del DNA e quello di origine di srotolamento erano nello stesso posto e quindi l’intero plasmide ha cominciato a srotolarsi dall’inizio fino alla fine oppure saranno delle cellule Hfr+ F- perché lo srotolamento ha iniziato quando il plasmide era inserito in modo tale che il sito di srotolamento coincideva con metà della molecola circolare che si è linearizzata per inserirsi nel cromosoma. Nei gram positivi avviene la coniugazione, ma non si ha il plasmide F e non si forma il ponte coniugativo ma avviene un contatto diretto tra la superficie cellulare del donatore e quella del ricevente e ci sono dei segnali che emettono le cellule donatrice e ricevente che sono dei feromoni che vengono sintetizzati e portati all’esterno come segnali di riconoscimento affinché si formi un canale a livello della membrana e della parete per far passare parte del contenuto genetico della cellula donatrice; in questo caso sono sempre i plasmidi che vengono trasferiti da una cellula all’altra, i quali hanno un maggior peso molecolare e che quindi non contengono solo informazioni per la propria replicazione ma contengono anche ad esempio informazioni come la resistenza agli antibiotici che viene trasferita alle altre cellule.

Trasduzione

L’ultimo processo è la trasduzione, il quale viene mediato dai fagi (virus specifici per i batteri). Il virus è un’entità dannosa per le cellule perché è un parassita intracellulare obbligato, ovvero una volta che entra nella cellula può dar luogo a due cicli: litico e lisogenico. I fagi vengono utilizzati anche nel clonaggio. Il fago poi porta alla morte cellulare, questo perché cambia spesso in funzione dei meccanismi con cui la cellula cerca di difendersi.