Biotecnologie genetico-molecolare

SEQUENZIAMENTO

Il principio su cui si basa il sequenziamento è semplice, prevede in primo luogo di sequenziare un solofilamento dei due complementari. Quindi in funzione del gene che voglio sequenziare, con la PCR siottiene l'amplicone di quel gene che viene purificato e poi si prepara un'altra PCR di sequenziamentodove viene introdotto un solo primer in modo che lavora su un solo filamento. La miscela di PCR prevedel'impiego dell'amplicone, del primer, della DNA polimerasi, dei nucleotidi trifosfato e a questi vengonoaggiunti delle opportune concentrazioni dei nucleotidi terminator, ovvero adenina, timina, guanina ecitosina che sono modificati nel 3'OH del ribosio che è il punto in cui si lega il nucleotide successivodurante l'azione della DNA polimerasi, in modo tale che quando uno dei nucleotidi trifosfato va a legarsiper la sintesi dell'amplicone, si ha un blocco dell'amplificazione perché il nucleotide terminator.modificazione 3' non consente più il legame con il nucleotide successivo. Quindi bisogna avere a disposizione per il sequenziamento i 4 nucleotidi trifosfato terminator che sono stati modificati in 3' insieme ai nucleotidi trifosfato normali, da inserire nella miscela di reazione. Il sequenziamento può essere di due tipi: manuale o automatico. Nel sequenziamento manuale bisogna preparare 4 provette per la PCR di sequenziamento, all'interno di ciascuna delle quali viene posta tutta la miscela di reazione e uno dei 4 nucleotidi terminator. In questo modo la sintesi dei vari ampliconi si blocca là dove l'adenina terminator ad esempio si lega alla catena nascente e blocca l'azione della DNA polimerasi. Il fatto che ci siano oltre nucleotidi trifosfato normale anche nucleotidi terminator implica che durante i vari cicli di amplificazione si ottengano degli ampliconi di lunghezza diversa a seconda di dove si è legato il nucleotide terminator; ladeterminata base nucleotidica. Durante l'elettroforesi, i frammenti di DNA migrano attraverso il gel in base al loro peso molecolare, con i frammenti più piccoli che si spostano più velocemente rispetto ai frammenti più grandi. Una volta completata l'elettroforesi, i frammenti di DNA vengono visualizzati utilizzando una colorazione specifica o una sonda fluorescente. In questo modo è possibile determinare la presenza e la dimensione degli ampliconi di DNA ottenuti dalla reazione di amplificazione. Questa tecnica, chiamata PCR (Polymerase Chain Reaction), è ampiamente utilizzata in biologia molecolare per amplificare specifiche sequenze di DNA e permette di ottenere una grande quantità di DNA a partire da una quantità molto ridotta di materiale di partenza.

basenucleotidica in quanto l'agarosio non è in grado di separare frammenti con minima differenza di pesomolecolare. Per cui bisogna utilizzare il gel di acrilammide ad elevata concentrazione che abbia una lunghezza di almeno 40cm per permettere la separazione di frammenti che differenziano tra di loro per poche paia di basi. Dopo la corsa si va a colorare i vari frammenti di DNA che ci sono disposti nel gel. Per leggere la sequenza, si procede dal basso verso l'alto, considerando che il frammento più piccolo è quello più legato al primer, quindi è l'inizio della determinazione della sequenza. Quindi si va a leggere contemporaneamente in tutte e 4 le linee di corsa e si andrà a valutare la banda più bassa. Dal peso molecolare più piccolo a quello più alto, si vanno a vedere quali sono i nucleotidi terminator che caratterizzano la banda. A noi non interessa l'intensità, ma solo come sono disposti in

amplificazione una probabilità equilibrata di incorporazione di ciascun nucleotide terminator. Dopo l'amplificazione, i prodotti vengono separati in base alla lunghezza utilizzando una tecnica di elettroforesi su gel. Durante l'elettroforesi, i fluorocromi legati ai nucleotidi terminator emettono una luce di diversa lunghezza d'onda, che viene rilevata da un rilevatore ottico. In questo modo, è possibile determinare la sequenza dell'amplicone in base alla lunghezza dei frammenti separati sul gel. Il sequenziamento automatico è uno strumento fondamentale per la ricerca scientifica e ha rivoluzionato il campo della genetica, consentendo di studiare in modo rapido e preciso la sequenza del DNA.amplificazione tutte le possibili combinazioni di ampliconi che terminano tutti con il nucleotide marcato. Al termine della PCR di amplificazione, i vari prodotti vengono inseriti nel sequenziatore che si basa su un'elettroforesi capillare utilizzando un capillare lungo contenente una resina aspecifica che permette di separare i vari ampliconi di lunghezza diversa in funzione del loro peso molecolare. Lungo il capillare si andranno a separare i vari ampliconi e verranno eluiti prima quelli con più basso peso molecolare. Lungo il capillare l'eluizione viene registrata attraverso l'emissione di un raggio laser che va ad eccitare i fluorocromi legati ai 4 nucleotidi differenti che emetteranno una fluorescenza diversa a seconda del tipo di nucleotide, quindi un detector è in grado di rilevare via via gli ampliconi eluiti lungo il capillare e fornisce i dati con una serie di picchi di colori diversi (4 colori) che corrispondono ai 4 nucleotidi marcati e ad ognicolore corrisponde un particolare nucleotide. La sequenza viene fornita quindi sotto forma di elettroferogramma, dove non conta la grandezza e l'area dei vari picchi ottenuti, ma conta il vertice dei picchi. In alcuni casi la sequenza non è perfetta e quindi ci sono dei picchi che sono spalle di altri e quindi il sequenziatore non è in grado di dire esattamente a quale nucleotide corrisponde ed è probabile che nell'amplificazione di un amplicone molto lungo ci siano dei buchi (gap) dove non è noto quale dei 4 nucleotidi possa essere presente in quella posizione. Il fatto di avere uno o più gap (buchi) può incidere sulla sequenza. Se si ritiene che un nucleotide non è stato determinato in modo corretto su una serie elevata di paia di basi, la cosa può non interferire ma se ci sono più gap in una zona in cui si vuole costruire ad esempio il primer, l'analisi dovrà essere rifatta facendo attenzione alla

Purificazione dell'amplicone che deve essere fatta prima di iniziare la PCR di sequenziamento. L'amplicone viene purificato utilizzando deikit con delle resine che cercano di eliminare le impurità per avere l'amplicone più puro possibile per effettuare il sequenziamento. A volte, è il capillare che magari non è stato calibrato in modo corretto e in ogni caso quando si ottiene una determinata sequenza si verificherà quanti gap si hanno e si deciderà se bisogna rifare o meno l'analisi. Bisogna essere in grado di leggere una sequenza e valutare se all'interno della sequenza ci sono potenziali ORF (open reading frame), ovvero sequenze che hanno le caratteristiche di un codone di inizio e di stop che verrà chiamato gene quando si conosce il prodotto di quella sequenza. Una volta individuato sulla sequenza un potenziale ORF, bisogna vedere se questo è potenzialmente esprimibile ovvero bisogna verificare se a monte.

Esiste un promotore, quella regione in cui si ritrovano i due box -10 e -35 alla quale si lega la RNA-polimerasi per iniziare il processo specifico della trascrizione del gene o dell'operone. La ricerca del promotore non è così semplice, se questo promotore è forte, vuol dire che si trova ad una specifica distanza dall'inizio del gene, ovvero circa -10 basi e -35 prima dell'inizio. La ricerca viene facilitata se le sequenze del box -10 e -35 sono consensus ovvero si conosce già la sequenza delle 6 basi che caratterizzano i due box; a volte poiché il gene è regolato da un promotore debole, risulta difficile andare ad individuare un possibile promotore. Per valutare realmente l'espressione del gene si può fare la real-time PCR utilizzando la retrotrascrizione del RNA per verificare se quel gene è realmente attivo, in quanto attraverso i vari processi della ricombinazione genica (mutazione, trasposizione), un

genepuò essere presente lungo il genoma, ma per i fattori di variabilità, il suo promotore potrebbe non esserci o non essere più attivo. Sui database non è presente l'intero genoma ma i contig che sono dei frammenti e quindi non tutte le informazioni sono realmente disponibili. Si può avere a disposizione il sito ncbi dove si può trovare la biotecnologia più recente, si può valutare se per quel momento è già presente la sequenza di un determinato gene e può essere confrontata.

INGEGNERIA GENETICA

L'ingegneria genetica ha rivoluzionato in campo medico le ricerche perché l'insulina è stato ad esempio il primo prodotto ottenuto con la tecnologia del DNA ricombinante. Si dispone quindi di insulina perché si è riusciti a farla produrre da un batterio, in particolare da E.coli, con grandi vantaggi rispetto all'impiego di un animale o un vegetale. Un batterio rispetto ad un animale o un vegetale.Il vegetale cresce e si riproduce nell'arco di circa 20-30 minuti e in una notte diventano miliardi.

L'ingegneria genetica si basa sul fatto di riuscire a trasferire un gene che codifica per un prodotto utile da una cellula animale o vegetale all'interno di una cellula microbica, superando le barriere dei vari regni. Le cellule che sono in grado di ricevere questo gene e di esprimerlo vengono chiamate cellule ricombinanti.

Il fine è quello di esprimere una proteina che proviene da un determinato organismo in un altro che sia più facile da coltivare e che dia una resa maggiore del prodotto stesso; questa viene chiamata espressione eterologa. L'esempio più noto è infatti l'insulina, oppure vi sono ad esempio l'interferone o anche i microrganismi geneticamente modificati.

Questa possibilità di trasferire un gene avviene attraverso un processo noto come clonaggio molecolare. Il clonaggio molecolare prevede in primo luogo la

disponibilità di specifici enzimi di restrizione (endodesossinucleasi di restrizione), ovvero enzimi specifici prodotti da alcuni batteri sono in grado di riconoscere il DNA a doppio filamento in uno specifico punto e tagliare all'interno di questa sequenza specifica; si conosce a priori le se