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Biotecnologie della riproduzione completo

Appunti di biotecnologie della riproduzione basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Carnevali dell’università degli Studi del Politecnico delle Marche - Univpm, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biotecnologie della riproduzione docente Prof. O. Carnevali

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ESTRATTO DOCUMENTO

Gli autosomi sono costituiti da 22 coppie che codificano le caratteristiche umane generali e i tratti

specifici come il colore degli occhi, mentre i cromosomi sessuali possono essere di due tipi diversi

geneticamente: Cromosoma X, più grande, e Cromosoma Y, più piccolo.

Ci sono tre livelli di differenze tra maschi e femmine:

1) Genetico: Dipende dalla combinazione di cromosomi sessuali al momento del concepimento.

2) Gonadale: sviluppo dei testicoli o sviluppo delle ovaie; Presenza o assenza di cromosomi Y e

soprattutto del gene SRY, che determina la differenziazione gonadica , coadiuvato da geni

autosomici come Sox9.

3) Fenotipico: Sesso anatomico apparente dell'individuo e determinato dal sesso gonadico tramite

la produzione di ormoni steroidei. Originariamente infatti si ha una gonade indifferenziata, provvista

sia di un dotto di Muller che di un dotto di Wolf. Questa condizione è sovvertita grazie al controllo

genetico ed ormonale, che condurrà nel maschio, al differenziamento di un dotto deferente, a

partire dal dotto di Wolf, guidata dalla produzione di androgeni, oppure nella femmina, attraverso la

produzione di estrogeni che hanno come target il dotto di Muller, il differenziamento di questo, nelle

tube.

Il colesterolo è il progenitore di tutti gli ormoni steroidei. La sequenza nelle sintesi è:

COLESTEROLO -> PREGNENOLONE -> PROGESTERONE -> ANDROGENI

(testosterone e

deidrotestosterone)

Effetti del testosterone​ :

A) Prima della nascita sia l'effetto della mascolinizzazione del tratto riproduttivo e dei genitali

esterni e la promozione della discesa dei testicoli nello scroto.

B) A livello dei tessuti sessuali, promuove la crescita e la maturazione del sistema riproduttivo

al momento della pubertà e risulta di fondamentale importanza nei processi di

spermatogenesi e mantenimento del tratto riproduttivo per tutta l'età adulta.

C) Altri effetti riproduttivi, riguardano lo sviluppo dell'orientamento sessuale in pubertà ed il

controllo della secrezione delle gonadotropine.

D) Espressione dei caratteri sessuali secondari, come la crescita dei peli corporei e della

barba, il cambiamento di voce in adolescenza e la maggiore crescita della muscolatura,

che è responsabile della configurazione della corporatura maschile.

E) Azioni indipendenti dal comportamento riproduttivo riguardano un effetto anabolizzante, in

quanto aiuta a bruciare grassi, la promozione della crescita ossea al momento della pubertà

e, talvolta, l’induzione a comportamenti aggressivi.

Struttura e maturazione degli spermatozoi

La spermatogenesi​ consta di tre fasi principali:

1) Proliferazione mitotica: Le cellule figlie che formano lo sperma si dividono mitoticamente per

formare quattro spermatociti primari identici

2) Meiosi: Ogni spermatocito primario forma due spermatociti secondari, che producono quattro

spermatidi dopo la seconda divisione meiotica. Teoricamente, sedici spermatozoi derivano da ogni

spermatogonio che passa attraverso il processo.

3) Packaging degli spermatozoi

Le cellule del sertoli sono di difficile individuazione istologica.

NB. A livello della prima divisione meiotica, le cellule figlie conservano un ponte citoplasmatico che

fa da ponte tra le cellule sorelle e si mantiene fino alla seconda divisione meiotica, mettendo in

comunicazione quattro cellule.

Al contrario della cellula uovo, che tende all’accumulo, lo spermatozoo tende a ridurre al minimo la

quantità del citoplasma.

Ovogenesi

Una coorte di ovogoni inizia a migrare. Il meccanismo di controllo locale consente di scaglionare le

cellule riproduttive lungo tutta la durata del periodo fertile della donna. Avviene il differenziamento

in ovocita primario che avvia il processo di meiosi, originando un ovocita secondario ed un corpo

polare, la cui espulsione ha come obiettivo quello di segregare la maggior parte del citoplasma in

quello che diverrà poi l’ovocita secondario.

Nella seconda divisione meiotica l’ovocita da origine all’uovo maturo e ad un secondo globulo

polare con lo stesso obiettivo. Allo scoppio del follicolo resta il corpo luteo, che si comporta a tutti

gli effetti come una ghiandola endocrina in quanto incaricata di produrre la maggior parte del

progesterone che predisporrà l’utero all’accoglimento dell’embrione.

NB. Il bilancio energetico della produzione gametica è molto favorevole per gli spermatozoi, ma

non per la cellula uovo, in quanto per ogni ovogonio abbiamo la produzione di tre corpuscoli polari

“inutili” ed una sola cellula fertile.

Dal confronto tra spermatogenesi ed ovogenesi risulta che:

● La spermatogenesi è molto veloce: in due mesi si completa, mentre l’ovogenesi può durare

indicativamente dai 12 ai 50 anni.

● il maschio dalla pubertà produce milioni di spermatozoi al giorno mentre la femmina ha un

numero limitato e prestabilito di cellule da distribuire lungo tutta la vita sessuale.

● da ogni spermatocita primario si formano 4 spermatozoi, dall’ovogonio si forma una cellula

uovo.

Fecondazione

Le fasi iniziali della fecondazione dipendono principalmente da due strutture: l' acrosoma dello

spermatozoo e la zona pellucida dell'ovocita. Tre eventi principali sono coinvolti nell'interazione tra

spermatozoi e ovociti:

1. Lo spermatozoo va incontro a capacitazione, un processo che riguarda prevalentemente la

variazione della componente lipidica nella membrana plasmatica. Dopo di che, si attacca

alla zona pellucida. Questo legame avviene grazie al riconoscimento da parte di una delle

tre componenti della zona pellucida, zp3, della membrana citoplasmatica dello spermatozoo

(la matrice glicoproteica è composta da zp3 e zp2, che sono polimeri, mentre zp1 è la

componente che lega le altre due catene). Il numero di siti di legame per lo spermatozoo

sulla cellula uovo è limitato, infatti la sua superficie non viene completamente ricoperta.

2. Lo spermatozoo subisce la reazione acrosomiale​ , fonde ovvero la sua membrana

plasmatica con la vescicola acrosomiale e rilascia enzimi digestivi, funzionali alla digestione

della membrana plasmatica della cellula uovo.

3. Questa membrana dello spermatozoo altamente fusogenica entra in contatto con la

membrana plasmatica dell'ovocita e le due membrane si fondono insieme consentendo il

rilascio del materiale genetico e del centriolo maschile, e promuovendo la riattivazione del

metabolismo cellulare della cellula uovo.

Questo comporta la trascrizione e la traduzione di mRNA e la sintesi del DNA a livello della cellula

uovo. I granuli corticali sono componenti citoplasmatiche della cellula uovo che nel momento della

fusione con lo spermatozoo, conseguentemente al rilascio di ioni calcio​

, si fondono con la

membrana plasmatica e consentono la formazione della zona pellucida (mediante la cosiddetta

reazione corticale​ ). Questa membrana è di diversa composizione, risulta più resistente ed è

funzionale alla protezione della cellula durante il percorso nelle tube fino all’utero, senza legarsi

lungo il percorso​ , altrimenti si avvierebbe una gravidanza extrauterina che potrebbe essere fatale.

Dopo l’ingresso nella cellula uovo del pronucleo maschile, il DNA dello spermatozoo deve essere

decondensato​ , per questo motivo le proteine legate ad esso, che lo tenevano “compattato”, sono

sostituite con istoni provenienti dalla cellula uovo.

​ ​

La blastula è lo stadio embrionale maggiormente utilizzato per l’impianto sia di materiale fresco che

di materiale congelato. Lo sviluppo embrionale, fino allo stadio di blastocisti, ovvero la

segmentazione, avviene lungo le tube. A livello di blastocisti la membrana prende contatto col

tessuto uterino per la prima volta: inizialmente avviene un riconoscimento (assente durante il

percorso nelle

tube), a seguito

del quale

l’embrione

comincerà a

muoversi sulla

parete dell’utero

per dare avvio al

processo di

placentazione​ .

La blastocisti

risulta composta

da cellule esterne

del trofoblasto,

che daranno

origine alla parte

embrionale della

placenta e dalla

massa cellulare

interna​ , una parte

delle quali formerà

l’embrione.

L’impianto della

blastocisti : in

questa fase le

cellule del

trofoblasto sono le

protagoniste

perchè

possiedono tutta

una serie di

segnali per

iniziare l’impianto nella parete uterina. Queste iniziano a proliferare formando una serie di cordoni.

Il trofoblasto produce enzimi litici che consentono lo sprofondamento dell’embrione all’interno

dell’endometrio. In questa fase l’embrione si sposta via via avanzando nell’endometrio. Inttorno

​ ​

all’embrione sono presenti importanti capillari funzionali agli scambi nutritivi e gassosi tra

l’embrione e la madre.

Endometrio

Le cellule dell’endometrio in questa fase cambiano profondamente nella loro struttura in quanto

avviano il processo di deciduazione (o compattazione). Questo consente di ottenere uno strato

superiore più compatto e a livello sottostante uno strato spugnoso.

I cambiamenti che avvengono a livello dell’endometrio sono legati alle fasi del ciclo riproduttivo:

1) Regola il ciclo mestruale, che nella

donna dura circa 28 giorni. La prima

fase è detta follicolare, poi c’è

l’ovulazione e segue la fase luteale.

Nel corso del ciclo il tessuto si

inspessisce fino ad una condizione

ideale per accogliere l’embrione. Se

queste fasi sono alterate, è

necessario fornire dei segnali esterni

per ricreare le condizioni idonee alla

fecondazione ed all’impianto

(preparazione), perchè quando il

controllo su questo processo

(produzione di una serie di segnali

attivi) viene meno l’embrione non si

impianta, oppure si verifica aborto

spontaneo.

2) Partecipa attivamente all’impianto

dell’embrione

L’impianto artificiale si opera di solito

attorno al 5-6 giorno. Già dal secondo

giorno la segmentazione è avviata

anche se molto lenta (al quarto giorno

abbiamo ancora sole 8 cellule):

l’embrione inizia a trascrivere i suoi

geni; al quinto giorno si ha lo stadio di blastocisti precoce ed al sesto-settimo abbiamo la blastocisti

tardiva, che avvia il processo di placentazione nell’utero. All’ottavo giorno ha inizio il processo di

compattazione che porterà alla distinzione tra le cellule del trofoblasto e cellule della massa

interna. ​

Esiste una finestra temporale d’impianto che dura dai 3 ai 5 giorni, all’interno della quale ricadono

le condizioni perfette per l’attecchimento sia da parte dei fattori prodotti dall’utero, quindi a livello

dell’endometrio, che da parte dell’embrione stesso, ed in particolare dalle cellule del trofoblasto.

Essendo un lasso di tempo breve, questo costituisce il principale problema nella riproduzione

assistita. Tuttavia i segnali non sono solo locali, ma arrivano anche dalle arterie del circolo

sanguigno, perchè si tratta di segnali endocrini. Il periodo utile all’interno del quale ricade questa

finestra temporale accade solitamente tra il 16° ed il 20° giorno del ciclo.

Sistema di segnali WNT

Il segnale wnt (che in realtà è costituito da una famiglia di 14 a 19 molecole di ligando) è idrofobico

ed ha la possibilità di interagire con il recettore fizzled (anche in questo caso si parla di una

famiglia di recettori), coinvolgendo le beta catenine in una catena di segnali. Questo meccanismo

interviene nella regolazione delle attività delle cellule del trofoblasto. La beta catenina è un segnale

trascrizionale capace di agire a livello dei geni target, promuovendone l’espressione.

Canali ionici

Recentemente si è scoperta l’importanza dei canali ionici nel processo di riconoscimento, durante

la fase d’ impianto embrionale. Gli ioni di maggiore interesse sono​ Na+,K+,Ca2+,Cl-​ .

I canali ionici possiedono dei recettori capaci di captare dei segnali di apertura/chiusura per far

passare gli ioni, che sono ancora una volta estradiolo e progesterone.

A livello endoteliale i canali più rappresentativi controllati da entrambi gli ormoni, possono essere

ad esempio il CFTR​ , che regola il livello di cloro intracellulare, oppure il canale per il sodio che ne

media l’entrata.

Il flusso dei liquidi dalla cavità uterina (o verso di essa) è mediato dalle concentrazioni ioniche in

quanto queste sono le principali responsabili della regolazione osmotica​ . La pressione osmotica

alterata da inadeguati livelli ormonali, causa una secrezione o un assorbimento anomali, che

possono ripercuotersi sulla capacità d’ impianto dell’embrione (es. troppo fluido nella cavità

uterina). ​

Il Calcio invece svolge un ruolo importante nel rilascio della prostaglandina E2 che interviene nella

trasformazione delle cellule dell’endometrio in cellule deciduali (compattazione).

L’ inattivazione dei canali ionici ad opera degli ormoni steroidei sessuali, controlla in modo indiretto

anche l’espressione genica, attivando dei pathway trascrizionali che portano alla produzione degli

mRNA come ad esempio EGF binding Protein (che interviene nelle fasi successive dello sviluppo

embrionale), FOX1 (coinvolto nel controllo dello stress ossidativo e nella regolazione del ciclo

cellulare), integrine​ (segnali di membrana) ecc.

CONTROLLO ENDOCRINO

Le prime analisi prescritte alle coppie che vogliono intraprendere un percorso di fecondazione

assistita, sono quelle degli ormoni plasmatici, responsabili dei processi di spermatogenesi ed

ovogenesi, ma altrettanto coinvolti nell’impianto embrionale.

L’asse ipotalamo-ipofisi-gonade è quella maggiormente coinvolta nei casi di disfunzioni ormonali,

causa dei problemi di scarsa fertilità. Dall’ipotalamo vengono prodotti i segnali che, immessi con

meccanismi endocrini nel sistema portale, possono raggiungere l’ipofisi.

Il punto di partenza del processo coinvolge il fattore di rilascio delle gonadotropine (GnRh),

molecola di 10 aminoacidi estremamente conservata nel regno animale (lo troviamo dagli

invertebrati all’uomo con elevate percentuali di similarità). Questo, liberato dall’ipotalamo, media la

​ ​

produzione delle gonadotropine (​ follicolo stimolante e la luteinizzante​ ) a livello dell’ipofisi,

ghiandola endocrina nella cui parte anteriore, sono presenti le cellule gonadotrope​

, target del

GnRh. L’ipotalamo è una ghiandola neuroendocrina, che riceve segnali nervosi e rilascia il

decapeptide GnRh da cellule di tipo nervoso. Attraverso il circolo sanguigno portale, il segnale

arriva alle c. gonadotrope dell’ipofisi e, attraverso il legame con un recettore di membrana, stimola i

geni per la produzione delle gonadotropine. Queste ultime sono segnali endocrini, quindi viaggiano

nel sangue fino ad arrivare alle gonadi e a livello del tessuto somatico (cellule del sertoli, di leydig,

della teca e della granulosa), attivano enzimi in grado di convertire il colesterolo in ormoni sessuali.

Gli estrogeni sono gli ultimi segnali della catena di produzione (estradiolo) perchè non possono

essere ulteriormente convertiti in altre famiglie di ormoni steroidei. Il testosterone viene convertito

in estradiolo dall’enzima aromatasi, anche negli uomini, ma in piccole percentuali. Anche nella

femmina una piccola parte di androgeni viene liberata, ricoprendo un ruolo nelle funzioni

riproduttive (es. testosterone funzionale alla libido).

Quantificazione del segnale

A livello dell’ipotalamo ho GnRh in quantità di ng, quindi sono indispensabili tecniche di

quantificazione come radio-immuno-essay, che ci consentono di rilevare quantità molto basse di

segnale. Fortunatamente il segnale aumenta di diversi ordini di grandezza, amplificandosi a livello

dell’ipofisi: le gonadotropine infatti hanno un ordine di grandezza fino a mille volte superiore,

raggiungendo l’ordine dei nanogrammi. A livello delle cellule target abbiamo un’ulteriore

amplificazione del segnale, di un ordine dieci-cento volte superiore rispetto al livello precedente,

ma restiamo comunque nei micro gr. Per questo motivo è più facile dosare segnali a valle e la

maggior parte degli esami vertono sulla quantificazione ormonale.

Il segnale necessita il rispettivo recettore, perchè da solo non è sufficiente a veicolare

l’informazione. I segnali che entrano in gioco sono numerosissimi e sono interessati da tutta una

serie di controlli a feedback retro-attivo, positivo o negativo, a seconda dei livelli del segnale​ .

Entro una certa soglia di concentrazioni gli ormoni prodotti continuano a fungere da segnali positivi,

ma oltre quel limite questi funzionano da inibitori a tutti i livelli dell’asse, ipotalamico, ipofisario ed

adenoipofisario. ​ ​

Fattori di rilascio ormonali, ovvero gli RF ipotalamici sono: ​

● Fattori di rilascio per ossitocina​

, che regola le contrazioni durante il parto e vasopressina​ ,

che monitorano la pressione osmotica (bilancio idrico) dei vasi.

● GnRH (​ fattore di rilascio delle gonadotropine​ ): il triptofano è importante in associazione con

il recettore adenoipofisario.

● fattore di rilascio di somatostatina e somatotropina​ , che inibisce il rilascio dell'ormone della

crescita(GH) ed influenza il rilascio di ormone pancreatico ed altri ormoni

● CRH (​ corticotropin-releasing hormone​

) in cui è coinvolto il pathway che raggiunge le

ghiandole surrenali. Qui viene prodotto un precursore molto grande, la

proopiomelanocortina, che viene convertita in ormone adrenocorticotropo (ACTH),

impiegato nel controllo della risposta allo stress, con la produzione di cortisolo, beta

lipotrofina ed endorfine​ (queste ultime coinvolte nella riproduzione a livello del piacere).

● GRH (​ fattore di rilascio del GH​ ), il pathway coinvolto in questo caso è quello

ipotalamo-ipofisi-fegato, non a caso l’obesità risulta strettamente correlata ai problemi di

infertilità.

Per questo motivo problemi all’apparato riproduttivo possono essere legati ad una serie di variabili

multifattoriali che si devono tenere in considerazione nella formulazione di una diagnosi ed

eventuale terapia.

A questo proposito è necessario conoscere i pathway di regolazione dei vari processi, studiando

modelli sperimentali e traslando le conoscenze apprese sull’uomo, a livello di:

- DNA

- RNA, a partire da un filamento di cDNA, con metodi di studio come la real time PCR, che ci

permette di sapere se l’RNA è presente nella cellula e se viene trascritto.

- PROTEINA/ENZIMA/SEGNALE ORMONALE, che spesso non vengono prodotti come

segnali attivi, ma si presentano come “pre-pro-ormoni”, ovvero presentano dei segnali che

devono essere tagliati da enzimi proteolitici per ottenere il “pro-ormone”, ed infine l’ormone.

- MODIFICAZIONI POST TRADUZIONALI VARIE, come glicosilazione, fosforilazione, ecc.

Focus: trasmissione del segnale

1)Endocrino: una cellula del sistema endocrino produce un segnale e lo riversa nel circolo

sanguigno. Questo arriverà a tutte le cellule ma si andrà a legare solo alle cellule bersaglio che

possiedono i recettori per quello specifico segnale.

2)Paracrino: una cellula rilascia un segnale che andrà ad agire con un controllo area specifico,

legandosi a cellule limitrofe. Fondamentale nella partenza delle corti di ovogoni e spermatogoni per

il processo di maturazione (blocco di tipo paracrino su alcuni ovogoni per impedire che partano tutti

insieme)

3)Sinaptico: avviene tra cellule nervose, mediante il rilascio di neurotrasmettitori a livello delle

placche sinaptiche

.

Al momento della maturità sessuale il sistema nervoso centrale inizia a produrre il GnRH, che

raggiungerà la parte anteriore dell’ipofisi (adenoipofisi), dove risiedono le cellule gonadotrope, e si

avrà il rilascio di ormoni che hanno come target le cellule somatiche delle gonadi.

Il target dell’FSH sono:

1)cellule del sertoli, nell’uomo, dove stimola la produzione di estradiolo e dell’ androgen binding

protein, che consentirà di creare un gradiente di testosterone minimo verso la parte basale e

massimo verso il lume del testicolo, funzionale alla maturazione degli spermatozoi. Il feedback

negativo interviene quando la maturazione è a buon punto ed è rappresentato dalla produzione di

inibina.

2)cellule della granulosa, nella donna, dove stimola la produzione di estradiolo (e di una minima

parte di androgeni) ed activina, un segnale positivo per l’asse, in quanto stimola a livello ipofisario il

rilascio di ormoni. Questo accade nelle prime fasi. Superata una certa concentrazione il sistema

viene bloccato dallo stesso segnale degli estrogeni ed, anche in questo caso, dall’ inibina.

Il target dell’LH sono:

1)cellule di Lyeding, nell’uomo, dove stimola la produzione di androgeni, a partire dai quali si

otterranno gli estrogeni, prodotti sotto stimolo dell’FSH nelle cellule del sertoli, e si avrà induzione

della spermatogenesi.

2)cellule della teca, nella donna, dove stimola la steroidogenesi, ovvero inizia il processo di

conversione del colesterolo in pregnenolone e progesterone, il quale sarà convertito in androgeni

e, per assenza dell’enzima aromatasi a livello di queste cellule, si interromperà il processo, senza

possibilità di un’ulteriore interconversione in estrogeni. A questo livello, l’ormone LH stimola anche

la produzione di progestinici, che inducono la formazione del corpo luteo. Inizialmente questo

segnale ha un comportamento stimolante sull’ipofisi, ma anche in questo caso, come i livelli di

progesterone salgono, questo diventa un segnale di feedback negativo ed inibisce il processo a

livello ipotalamico.

Il GnRH è una piccola molecola idrofila che non riesce ad oltrepassare la membrana cellulare. Il

suo recettore, situato sulle cellule gonadotrope dell’adenoipofisi, è una classica proteina 7-pass di

membrana, associato a proteine G​ . E’ caratterizzato da una porzione di riconoscimento per il

GnRH all’N-terminale ed una porzione intracellulare per il legame con la proteina G, prossima al

C-terminale. L’ormone GnRH è un decapeptide altamente conservato in numerose specie, dalla

lampreda agli esseri umani. Le variazioni aminoacidiche riscontrate nelle varianti, si trovano

sempre in corrispondenza del 5, 7 e 8 aminoacido, il chè fa supporre che queste posizioni siano

occupate da aminoacidi che non hanno importanza cruciale per il riconoscimento della molecola da

parte del recettore o per la sua attività biologica. Tuttavia, considerata l’emivita estremamente

breve di questo peptide, le ditte farmaceutiche hanno provato a lavorare con delle sostituzioni

aminoacidiche a livello di queste posizioni non essenziali (in particolare la 7 e la 8), creando

molecole chiamate analoghi del GnRH, allo scopo di prolungarne l’emivita. La dislocazione e la

concentrazione di GnRH prodotto non sono omogenee tra i sessi: si parla di dimorfismo del

segnale, o gender specificity.

L’mRNA del GnRH ci è utile per la quantificazione e lo studio di questo segnale. La sua

dimensione insolitamente lunga è

dovuta al fatto che sono presenti: un

peptide segnale, la sequenza che

codifica per l’ormone, un punto di

processamento del peptide (passaggio

obbligato dalla produzione di un pre-pro ormone) ed una sequenza che codifica per il peptide

GAP(GnRH-associated peptide). Spesso la quantificazione dell’ormone è fatta proprio misurando

la quantità di questa proteina in quanto generalmente sono presenti più forme di GnRH​ (mammalia,

chicken, salmon… nomi di fantasia che spesso corrispondono a dove è stato individuato quel tipo

di GnRH per la prima volta).

Nell’ipotalamo sono presenti delle cellule chiamate

neuroni kiss, sui quali agiscono i fattori molteplici:

1) Ambientali, come la melatonina, che regola il

fotoperiodo, in quanto molecola responsabile del ritmo

circadiano e circannuale.

2) Psicologici, come lo stress e la nutrizione.

Questi segnali agiscono in modo sia positivo che

negativo. I neuroni Kiss rilasciano kisspeptina​ , un

peptide che si lega a recettori specifici presenti sui

neuroni a GnRH, fornendo il segnale di rilascio ormonale

nel circolo sanguigno. I neuroni kiss si trovano dislocati

nell’ipotalamo secondo una geografia precisa, funzionale

alla loro regolazione, ovvero sia nel nucleo arcuato che

nella regione AVPV (antero ventral peri ventricular).

Questa separazione serve per ricevere segnali differenti:

i feedback ormonali di estradiolo e progesterone prodotti

dall’ovario, raggiungeranno l’uno o l’altro locus

ipotalamico per regolare in modo rispettivamente

negativo e positivo, il rilascio di GnRH. Quindi il

medesimo

segnale diventa

positivo o negativo a seconda dell’area che raggiunge e per

forza di cose il neurone a GnRH possiede numerosi

recettori per segnali steroidei.

Le gonadotropine, LH ed FSH, sono segnali di natura

glicoproteica (subiscono glicosilazione post traduzionale

che conferisce complessità alla molecola) e necessitano di

un recettore di membrana 7-pass associato a proteine G, al

quale legarsi per portare a termine la loro funzione

biologica: ancora una volta il segnale resta all’esterno della

cellula ed induce la produzione di secondi messaggeri a

livello intracellulare. Inoltre le gonadotropine hanno una

s​ truttura dimerica in cui la subunità alfa è maggiormente

conservata mentre la beta varia e conferisce specificità

all’ormone.

Sintesi di gonadotropine

Le proteine G associate al recettore 7-pass per il GnRH sono di tipo Gs, ovvero attivano l’enzima

adenilico ciclasi per la conversione di ATP in cAMP, uno dei due principali messaggeri intracellulari

(l’altro è il Ca2+ -> modulando i livelli di questi due messaggeri si ottengono effetti fisiologici

diversi). Il cAMP attiva delle chinasi coinvolte nella via delle map kinasi ovvero una via fosforilativa

che porta all’attivazione di fattori di trascrizione che legano il gene per la trascrizione delle subunità

beta dell’FSH. Se da un lato la via del Gs attiva le map-chinasi, dall’altro attiva anche la proteina

CREB, che lega il cAMP sul sito CRE presente a livello del gene codificante la subunità beta

dell’FSH, attivando definitivamente la sua trascrizione.

L'altra proteina g legata al recettore per il GnRH è una proteina Gq che, mediante l'attivazione

della fosfolipasi C (proteina di membrana che usa come substrato il fosfatidil-inositolo 4-5

bisfosfato) per produrre inositolo

trifosfato, associato al rilascio di

Ca2+. La fosfolipasi C produce

anche diacilglicerolo, che funziona

da attivatore per la via delle map

chinasi e di ulteriori fattori di

trascrizione, che saranno poi

fosforilati per entrare nel nucleo e

trascrivere i geni codificanti le

subunità alfa generiche e le beta

dell’LH. Queste informazioni si

possono ottenere mediante DNA

deep sequencing oppure usando la

tecnica del DNA microerray che ci

consentono di costruire un grafico

rappresentativo del pathway di

sintesi ed espressione di un

particolare gene. L’analisi

computazionale di questi pathway ci

consente di capire la fisiologia

cellulare relativa al processo.

I fattori neuroendocrini che regolano

l’espressione delle gonadotropine a

livello della cellula gonadotropa è legata alla dopamina, che ha un effetto inibente. Il rilascio di

GnRH è di tipo pulsato: in seguito alla trascrizione del gene nel suo RNA messaggero, si ha la

traduzione dell'ormone che, passando

attraverso il reticolo endoplasmatico, a

livello del quale abbiamo il taglio che mi

converte il pre-pro-ormone in pro-ormone,

arriva all’apparato del Golgi, sfruttando un

sistema di vescicole di trasporto. Qui in

seguito ad ulteriori modificazioni post

traduzionali, diventa ormone attivo nella

sua forma definitiva, per poi fuoriuscire per

esocitosi dalla cellula, con la fusione della

vescicola con la membrana cellulare ed il

rilascio del segnale nel torrente circolatorio.

Oltre a questo meccanismo di tipo

endocrino, possiamo avere anche meccanismi di tipo paracrino, emissione di segnali proteici

idrofilici che hanno il recettore su cellule adiacenti (per contatto) e segnali di tipo sinaptico, che

vengono sfruttati maggiormente per le comunicazioni tra le cellule nervose, a livello delle sinapsi

neuronali.

tipi di segnale:

1) idrofilici (GNRH), sono proteici e legano recettori di membrana.

2) idrofobici (ormoni steroidei sessuali) entrano all’interno della cellula, dove trovano il loro

recettore a livello nucleare. ​

C’è una significativa differenza nella velocità di risposta cellulare tra i due segnali, perchè il segnale

idrofilico si ferma a livello della cellula target solo se trova il suo recettore, mentre l’ idrofobico si

propaga indistintamente in tutte le cellule che incontra, finchè non trova la cellula con il recettore

all’interno. In questa seconda condizione è molto più difficile muoversi per il segnale, a causa ad

esempio della densità del citoplasma.

Un’ulteriore differenza sta nel fatto che il segnale idrofobico, una volta legato al recettore nucleare,

lega il DNA e si comporta come fattore di trascrizione. A questo livello è più difficile avere una

qualsiasi forma di regolazione perchè ormai la trascrizione è avviata, al contrario di quanto accade

per un segnale idrofilico, che attiva tutta una cascata di segnali in seguito al suo legame col

recettore di membrana, a livello dei quali è ancora possibile avere degli step regolatori​ .

Un recettore di membrana di solito è una proteina 7-pass legata a una proteina G​ . Uno dei

pathway più comuni è quello in cui il legame di un segnale con il rispettivo recettore, attiva la

subunità Alfa della proteina G associata, capace di legarsi con una molecola di GTP e di muoversi

lungo la membrana per incontrare l’enzima adenilico ciclasi​ , anch’esso trans-membrana, di

attivarlo, e consentire la conversione di una molecola di ATP in una di cAMP. Quest’ultimo è un

comune secondo messaggero intracellulare, in grado di attivare a sua volta proteine chinasi

impiegate in vari processi fisiologici. Per questo motivo ci aspettiamo un aumento di cAMP in

corrispondenza del rilascio di segnali come FS, LH, TSH etc. ​

Un’altra comune via in cui sono implicati segnali idrofilici è quella che vede coinvolta la clatrina​ ,

proteina caratterizzata da due forme fondamentali: la forma pentamerica e quella esamerica. La

prima occupa meno superficie mentre la seconda, aumentando la superficie, forma una struttura

tipica detta a canestro. Le regioni della membrana plasmatica in cui troviamo la clatrina sono dette

coated pits e sono capaci di invaginarsi. In questo caso abbiamo un segnale che lega il suo

recettore in prossimità di una coated pit e comporta la transizione dall’una all’altra forma della

clatrina, e la chiusura del segnale all’interno della cellula dove andrà ad esercitare la sua funzione.

Nel caso in cui ci sia un segnale

idrofobico, come per esempio un

estrogeno che deriva dal

colesterolo, il recettore si troverà

sulla membrana nucleare o a

livello del citosol, complessato a

proteine chaperone con funzione

di aiutare il trasporto in seguito al

legame col ligando.Avvenuto il

legame, il complesso entra nel

nucleo e riconosce la porzione di

DNA contenente il suo gene target

per stimolarne la trascrizione. Per questa ragione il recettore deve avere oltre ai domini C-term ed

N-term, anche un dominio legante l’ormone ed un dominio che lega il DNA.

I recettori nucleari sono sempre associati a complessi che attivano o reprimono la trascrizione

genica. Per attivare o disattivare la trascrizione si può anche agire a livello di condensazione e di

decondensazione della cromatina, mediante processi di de/acetilazione​ , per renderla più o meno

accessibile alla DNA polimerasi. I fattori coinvolti in questo caso sono l’Istone acetilasi e deacetilasi

con i loro cofattori, che rispettivamente attivano o reprimono la trascrizione, agendo a livello della

tata box.

I recettori nucleari sono una grande famiglia di oltre 60 proteine, alle quali si legano ormoni

steroidei, vitamina D3, acido retinoico ed ormoni tiroidei. Sono caratterizzati da un dominio centrale

che lega il complesso ligando-recettore alla porzione di DNA target. Nei vertebrati sono presenti

due distinte isoforme di recettori nucleari per gli estrogeni, alfa e beta (fino al 1996 si credeva che

esistesse solo l’isoforma Alfa), coinvolte separatamente nei vari processi, mentre nei pesci

(zebrafish è un modello di studio molto adoperato) ne sono presenti 3. La caratterizzazione dei vari

domini di questi recettori è stata ampiamente completata anche grazie agli attuali sistemi

bioinformatici.

La distribuzione dei recettori per gli estrogeni parte dalle gonadi, dove questi sono prodotti,

passano attraverso il circolo sanguigno e raggiungono una serie di distretti corporei come:

● il cervello, per il controllo a feedback sul rilascio,

● il sistema cardio-vascolare,

● la ghiandola mammaria,

● il fegato,

● i polmoni,

● il tratto gastrointestinale,

● il tratto uro-genitale

● le ossa, infatti con la menopausa si può soffrire di osteoporosi,

● l’utero nelle donne

● la prostata negli uomini.

Uno studio molto recente ha evidenziato la presenza di recettori per gli estrogeni anche sulla

membrana plasmatica.In realtà analizzando più in dettaglio la struttura di questo recettore si è

osservato che è esattamente identica a quella del recettore nucleare e per questo motivo si è

ipotizzato un fenomeno di traslocazione del recettore nucleare tipo ERα, sulla membrana cellulare.

Tuttavia come tutti i recettori di membrana anche in questo caso abbiamo l'associazione con

“proteine integrate”, che attivano una cascata di secondi messaggeri intracellulari, capaci di

reclutare i fattori di trascrizione per i geni target. In particolare ERα si lega alla proteina Shc​ , che ha

una fondamentale importanza per il processo. Il complesso ERα-Shc si lega infatti, a diversi

recettori presenti sulla membrana plasmatica, come i recettori dei fattori di crescita, o il recettore

per il fattore di crescita insulino-simile. Quindi la formazione del complesso

ERα/Shc/recettore_vario è promossa dall’estrogeno. Proprio grazie a questi eventi, il recettore per

l’estrogeno si va a posizionare in una piccola invaginazione della membrana plasmatica detta

caveola.

Riassumendo, possiamo avere 4 percorsi distinti:

1. Il percorso diretto include l'attivazione dell’ER mediante legame col suo ligando e un legame

diretto col DNA a livello degli elementi di risposta degli estrogeni (ERE).

2. Il percorso “vincolato”(a TF) include

l'interazione proteina-proteina con altri

fattori di trascrizione dopo l'attivazione

dei ligandi, e quindi la regolazione

genica è influenzata da un legame

indiretto con il DNA (perchè i fattori di

trascrizione veri e propri sono

interposti tra il complesso

recettore-ligando e l’ERE).

3. Il meccanismo non genomico​ : il

legante attiva un recettore,

eventualmente associato alla

membrana; un ER classico localizzato

nel citoplasma viene attivato, quindi

inizia la cascata di segnale tramite

secondi messaggeri che influenzano

per esempio i canali ionici, o

aumentano i livelli di ossido nitrico nel

citoplasma, e questo in definitiva porta ad una rapida risposta fisiologica senza coinvolgere la

regolazione genica. ​

Un ulteriore meccanismo non genomico è quello in cui è coinvolta la proteina 7-pass GPR30​ , che,

legando l’estrogeno, attiva una serie di metallo proteine localizzate a livello della membrana. A

questo punto interviene il recettore per l’epidermal growth factor, responsabile dell’attivazione di

una serie di chinasi, che agiranno a livello nucleare con la trascrizione di geni target. Legato al

gpr30 e anche un pathway metabolico che conduce la cellula all’ apoptosi. Questo processo è di

fondamentale importanza a livello dell'ovario, dove, al momento della formazione dell'ovocita, parte

una corte di ovociti primari dei quali solo uno, il dominante, si andrà a sviluppare e raggiungerà le

dimensioni idonee, mentre gli altri andranno incontro, appunto, ad apoptosi.

4. Il percorso indipendente dal ligando include l'attivazione attraverso altri percorsi di segnalazione.

In questo caso, le chinasi attivano mediante fosforilazione gli ERs per far avvenire la trascrizione.

Tutte le vie ed anche sistemi di segnalazione idrofilica ed idrofobica, possono alla fine andare a

confluire all’interno della cellula, intrecciandosi tra loro. Nell’immagine a lato vediamo due

diversi pathway in cui sono coinvolti

recettori steroidei: nel pathway 1

avviene la traslocazione dell’ormone

all’interno della cellula attraverso la

membrana plasmatica, arrivando alla

membrana nucleare, dove è presente

il suo recettore. Il legame in questo

caso, scatena una risposta a livello

del nucleo , causando una lenta

attivazione dei geni mediante la

sintesi di fattori di trascrizione. Nel pathway 2 invece, il recettore per l’ormone steroideo è presente

a livello della membrana plasmatica, ed il legame causa una veloce attivazione di secondi

messaggeri​ , anche non genomici, che andranno ad agire solo alla fine, con un meccanismo a

cascata, sui geni nucleari (attivando fattori di trascrizione). Non si può escludere che ci sia

passaggio di informazioni tra una via e l’altra.

Traslocazione sulla membrana plasmatica del recettore per l’estradiolo ER

(​ Thomas,​ P et al. 2005) ​

La proteina Shc ha un ruolo fondamentale nella

traslocazione del recettore per l’estradiolo, dalla

membrana nucleare, ad una piccola invaginazione

della membrana plasmatica, detta caveola​ .

Il recettore ERα lega, infatti, una proteina di

membrana chiamata caveolina, che, con una tipica

forma a fiasco, è il principale costituente delle

caveole​ . Il legame del recettore con una proteina

Shc, poi, garantisce la formazione del complesso

ERα-Shc, capace di legare a sua volta diversi

recettori presenti sulla membrana plasmatica,

come i recettori dei fattori di crescita EGFR o il

recettore per il fattore di crescita insulina simile

IGF-1R​ . La caveolina inoltre, interagisce con le

proteine G, indicando il coinvolgimento in un

meccanismo a cascata di segnale.

Un altro meccanismo non

genomico vede coinvolto il

recettore 7-pass per l’estradiolo,

gpr30. Ancora una volta la

segnalazione passa per il recettore

per l' epidermal growth Factor, il

quale lega una serie di

metallo-proteine presenti a livello

della membrana nucleare. La

cascata di segnale causa

l'attivazione di fattori di trascrizione.

In questa particolare via di

segnalazione si attivano delle

proteine chinasi che possono

comportare o una proliferazione o

un inibizione dei fattori di

trascrizione che andranno ad agire a livello nucleare. Inoltre è stato osservato che l'attivazione di

particolari segnali intracellulari può condurre anche a processi di apoptosi in cui sono coinvolti

segnali come citocromo C e cas3. Bisogna ricordare che il processo apoptotico è attivo a livello

dell'ovogenesi: quando parte la corte di ovociti primari tra i quali solo uno andrà a formare l’ovocita

maturo, gli altri andranno incontro a processi apoptotici. Per questo è possibile supporre che a

livello dell’ovocita che si andrà a sviluppare ci sono dei meccanismi legati strettamente alla

ricezione di ormoni steroidei, in grado di invertire i segnali di morte correlati ai processi apoptotici.

L’altro segnale fondamentale, oltre l’estradiolo è il progesterone​ , che interviene soprattutto nella

​ ​

fase di maturazione dell’ovocita e nel mantenimento dell’epitelio dell’utero attivo e secernente nel

caso della fecondazione, durante le prime fasi di sviluppo dell’embrione. Anche in questo caso, i

recettori per il progesterone sono dislocati sia a livello della membrana nucleare, sia a livello di

quella plasmatica, associati a proteine Gi. Questo recettore è un classico 7-pass, ma sembra

essere coinvolto anche nella rottura del nucleo dell’ovocita che coincide con la prima divisione

meiotica. L’associazione con proteine Gi capaci di inibire l’enzima adenilico ciclasi​ , consente di

alterare la segnalazione intracellulare (e la ripresa della meiosi), inibendo la produzione di cAMP.

Biochimica della Steroidogenesi

A livello della gonade, la steroidogenesi avviene a partire dal colesterolo, nelle cellule in cui sono

presenti gli enzimi capaci di convertirlo nei suoi vari derivati. Il primo enzima implicato, converte il

colesterolo in pregnenolone e si chiama p450. Da questo momento il pregnenolone può essere

convertito in progesterone da una idrossideidrogenasi, oppure in 17-OH-progesterone​ , passando

prima per una idrossilasi. L’efficienza dell’una o dell’altra forma di progesterone, cambia da

organismo ad organismo: in zebrafish, ad esempio, si preferisce usare il 17-OH-Pr.

L’enzima idrossilasi agisce a livello del pregnenolone trasformandolo in 17-OH-pregnenolone, che

potrà, da un lato, formare 17-OH-pr, dall'altro, formare androstenedione​ .

L'androstenedione rappresenta il punto di partenza per la sintesi di testosterone e questi due

ormoni sono i principali androgeni che troviamo nel maschio livello delle cellule del leydig.

Nella femmina grazie all'enzima aromatasi,

l'androstenedione porterà alla formazione di

estrone (ovvero estrogeno) mentre il

testosterone sarà convertito in gran parte in

estradiolo. Entrambi questi ormoni sono i

principali estrogeni femminili.

Riassumendo, nella donna: ​

1) LH stimola le cellule della teca per

convertire il colesterolo in androgeni

2) Gli androgeni si diffondono nelle cellule

della granulosa attraverso la membrana basale.

3) FSH stimola le cellule della granulosa​ a:

- produrre progesterone, che si diffonde

nelle cellule della teca, trasformandosi in

androgeni.

- convertire gli androgeni in estrogeni:

questi vengono in parte rilasciati nel sangue e in

parte mantenuti nel follicolo.

Maturazione del follicolo

Partendo dal follicolo primario il segnale che avvia all'inizio della maturazione è l’ FSH che stimola

la produzione di estrogeni. A questo punto parte una corte di follicoli primordiali, che matureranno

in follicoli primari. Solo uno tra gli ovociti è destinato a maturare, distinguendosi dagli altri per

dimensioni maggiori, e dal suo follicolo primario, si svilupperà il follicolo secondario. A questo

stadio distinguiamo già una zona pellucida è un piccolo antro attorno alle cellule della corona

radiata. Procedendo nella maturazione otterremo un follicolo vesculare, nel quale l'antro avrà

dimensioni maggiori e l’ovocita secondario sarà circondato da una spessa zona pellucida. A

maturazione ultimata si avrà lo scoppio del follicolo con la fuoriuscita del dell'ovocita secondario,

ancora circondato (dalla zona pellucida) dalla corona radiata di cellule della granulosa. Quello che

resta a livello dell'ovario costituisce il corpo luteo, che si comporta a tutti gli effetti come una

ghiandola endocrina capace di secernere progesterone, e a mano a mano che procederà nella suo

sviluppo potrà degenerare in corpo albicante. Contemporaneamente, a livello dell’utero,

aumenterà il livello di prostaglandina 2alfa, con il ruolo tonico di stimolare, assieme all’LH il corpo

luteo.

Un'altro importante segnale per

la via riproduttiva appartiene alla

via metabolica interna ed è la

​ ​

leptina, prodotta dagli adipociti​ , a

segnalare all’organismo il “livello

di energia” presente. Questo è

un segnale positivo, di avvio

dello sviluppo per il

raggiungimento della maturità

sessuale (il primo menarca arriva

anche grazie allo stimolo da

parte della leptina). Questo

segnale viene trasportato

attraverso il flusso sanguigno,

fino ai suoi recettori, presenti:

1) a livello dei neuroni kiss,

dove il legame causa il rilascio di kisspeptina

2) a livello dei neuroni del peptide Y​ , che controllano l’appetito: se la leptina è bassa, l’NPY

(neuropeptide Y) prodotto dallo stimolo di questi neuroni, sarà alto e causerà una

sensazione di fame.

Il senso di questo meccanismo è di stimolare l’organismo a mangiare fino a raggiungere una taglia

adeguata per la riproduzione. In modo indiretto quindi la leptina controlla l’attivazione del GnRH a

livello dell’ipotalamo. A contrastare la leptina, è presente una molecola chiamata agrellina​ , che

agisce invece sull’asse adenoipofisi-fegato-tessuti target; questa viene prodotta dallo stomaco, che

stimola l’appetito attraverso l’attivazione dell’ipofisi, che comincerà a produrre ormone della

crescita. Questo sarà rilasciato a livello del fegato ed attiverà il fattore di crescita insulino simile,

stimolante la mitosi, quindi la crescita dell’organismo. Il tessuto adiposo produce anche tutta una

serie di ormoni lipidici, gli FFA​ , che inibiscono l’asse della crescita. FASI DEL CICLO

MESTRUALE

Ii picco di LH nel momento

dell’ovulazione determina:

1. Interruzione nella

sintesi degli estrogeni

2. Riattivazione della

meiosi nell'ovocita

3. Induzione della

differenziazione delle

cellule follicolari

La fuoriuscita dell’ovocita secondario assieme al primo corpo polare (ed al suo cumulo) è quindi

accompagnata da una serie di stimoli positivi: l’attivatore del plasminogeno , sotto stimolo dell’FSH,

stimola la produzione di plasminogeno e plasmina per indurre il rilascio degli enzimi lisosomiali che

apriranno un varco nel follicolo, lo stigma, consentendo la fuoriuscita dell’ovocita secondario. Al

contempo l’FSH stimola anche l’espansione del cumulo ooforo attorno all’ovocita, mentre l’LH

causa da un lato il rilascio di prostaglandine, utili anche loro alla formazione dello stigma, dall’altro

il ri-avvio della mitosi dell’ovocita. Una volta fuoriuscito come ovocita secondario, col suo

corpuscolo polare, lo stesso LH stimola la luteinizzazione delle cellule della teca e della granulosa.

Corpo luteo dura circa 2 settimane: se non si verifica fecondazione, degenera. Con la

degenerazione, la concentrazione di estrogeni e progesterone diminuisce rapidamente: l’ipotalamo

non viene più inibito, ed FSH ed LH possono essere normalmente rilasciati di nuovo.

Riassumendo:

Il follicolo dominante possiederà tutti quei segnali intracellulari capaci di contrastare il processo

apoptotico al quale invece vanno incontro gli altri follicoli, detti atresici.

Tutti questi segnali vengono espressi nelle diverse fasi di maturazione e possono essere utilizzati

in laboratorio come dei potenziali biomarker per poter individuare la fase in cui si trova l’ovocita

dominante. Es. FGF per lo sviluppo precoce, IGF-I nella fase antrale follicolare etc. Il mezzo per

l’analisi di questi segnali, è sicuramente la real time PCR, che ci permette di sapere cosa viene

espresso in un dato momento nella cellula. Esami più comuni sono effettuati su: GnRH,

gonadotropine, ormoni tiroidei, la prolattina.

Il follicolo maturo avrà nettamente distinguibili agli occhi del ginecologo e anche del biologo che ci

lavorerà, un antro ampio con da una parte un cumulo ooforo, dall'altra cellule della corona radiata

attorno al ovocita pronto per la fecondazione. Nel caso in cui la si debba ricorrere a metodi di

fecondazione assistita del follicolo dovrà essere prelevato a questo stadio e se non si hanno

problemi a livello spermatico, bisognerà avere diversi rapporti sessuali per la fecondazione,

altrimenti, previa asportazione del follicolo in laparoscopia, si andrà a fecondare in vitro e poi a

re-impiantare l’embrione nella madre.

Il controllo sul ciclo ovarico non è solo di tipo endocrino ma anche di tipo paracrino. Considerato

che l'ovario è un organo pari, un mese partirà una corte di ovociti dall'ovaio destro e il mese

successivo dall' ovaio sinistro. Questo fattore non è trascurabile in quanto lo spermatozoo che

viene rilasciato a livello della vagina deve capire da che parte andare per raggiungere la cellula

uovo. Da ciò deduciamo che i segnali (ormoni) necessari si estendono anche a livello delle tube, in

modo tale da dare indicazioni allo spermatozoo su dove dirigersi per la fecondazione.

Oltre al ciclo ovarico, si compie parallelamente un ciclo uterino, caratterizzato da:

1. fase mestruale (5 giorni): caratterizzata dall'eliminazione del sangue, delle cellule morte

(corpi apoptotici) e dei detriti endometriali dalla vagina. Il primo giorno di mestruazione è

considerato l'inizio di un nuovo ciclo, in quanto è coincidente con l'inizio della fase follicolare

del ciclo ovarico.

2. fase proliferativa: nella fase precoce si ha una pseudostratificazione dell'epitelio

ghiandolare, mentre, nella fase tardiva, l'endometrio inizia a ripararsi e a proliferare sotto

l'influenza degli estrogeni secreti dai nuovi follicoli in crescita.

3. fase secretoria: in questa fase viene eventualmente accolto l’embrione ed avrà inizio la

placentazione. La finestra di sensibilità dura solo pochi giorni.

L'utero è diviso in diversi livelli che hanno distinte caratteristiche strutturali e funzionali. La

classificazione più semplice di questi livelli è la loro divisione in mucosa uterina o endometrio,

livello muscolare o miometrio e livello sieroso o perimetrio. L’endometrio è a sua volta diviso in due

livelli: lo strato basale e lo strato funzionale. Durante il ciclo mestruale lo strato funzionale si

espande e si vascolarizza, per essere poi disgregato durante il processo di mestruazione, mentre,

lo strato basale rimane relativamente costante. Il miometrio permette l'espansione la

concentrazione delle cavità uterine e risponde all’ ormone ossitocina. Invece gli estrogeni

stimolano la crescita del miometrio e dell'endometrio ed in quest’ultimo, inducono anche la sintesi

del recettore del progesterone. L’endometrio dell’utero è un tessuto ricco di lacune, funzionali agli

scambi nutritivi e gassosi che avvengono grazie al circolo sanguigno, tra la madre ed il feto.

Chapter 3: Alteraxion axis

La sterilità è "una malattia del

sistema riproduttivo definita dal

mancato raggiungimento di una

gravidanza clinica dopo 12 mesi

o più di rapporti sessuali

regolari non protetti".

Quando una donna non è in

grado di avere un figlio, sia a

causa dell'incapacità di

rimanere incinta o l'incapacità di

portare una gravidanza a un

parto, viene classificata come

avente infertilità primaria​ .

Quando una donna non è in

grado di partorire, sia a causa

dell'incapacità di rimanere

incinta o l'incapacità di portare

una gravidanza a un parto dopo

una gravidanza precedente​ ,

viene classificata come avente

infertilità secondaria​ .

Nell’immagine a fianco sono

mostrate riassuntivamente

alcune delle principali

alterazioni del sistema

riproduttivo a vari livelli. Spesso

la terapia consiste nel fornire

analoghi dell’ormone indicato,

ma se la diagnosi non è chiara

perchè per es. il paziente ha gli

ormoni con valori tutti sballati si può anche agire col sistema opposto, ovvero somministrando degli

antagonisti per silenziare l’attività (si lega al recettore dell’ormone ma non causa la ncascata di

segnale). Dopo somministrazione degli antagonisti si forniscono al paziente le corrette dosi degli

ormoni “silenziati” per ripristinare una condizione simile alla normalità. Questa situazione si può

correggere solo se il problema non riguarda il recettore del GnRH, altrimenti sia gli analoghi che gli

antagonisti non funzionerebbero. Per capire se il recettore viene sintetizzato correttamente l’analisi

del sequenziamento della sua sequenza è un valido primo approccio per individuare eventuali

mutazioni geniche. Un’alternativa plausibile è la somministrazione di gonadotropine corioniche

(hCG), che hanno un’attività molto simile alle gonadotropine classiche (FSH ed LH), in quanto la

subunità alfa è la stessa. Somministrando questo farmaco, al pari degli analoghi del GnRH, si

induce la steroidogenesi gonadica.

PCOS: Polycystic ovary syndrome

PFO: premature ovarian failure

Infertilità maschile

Possiamo classificare l'infertilità maschile in:

1. pre-testicolare o secretoria (riguardante l’asse ipotalamo-ipofisaria)

2. testicolare (problemi a ghiandole annesse, problemi di assenza od occlusione di vasi

deferenti, vasectomia)

3. post-testicolare o escretoria (cause genetiche, mancata discesa del testicolo a livello dello

scroto, infezioni, varicocele, chemio/radioterapia, malattie autoimmuni, traumi post

interventi chirurgici)

1) Cause pre testicolari

Le cause pre testicolari vengono diagnosticate sulla base dell’analisi di fattore di rilascio

ipotalamico, gonadotropine, inibina. Le analisi sono da fare a livello plasmatico.

Il risultato di situazioni di questo tipo può essere un ipogonadismo primario, o ipergonadotropo​ . In

questa condizione si possono distinguere:

● cause acquisite​ :Le gonadi sono inizialmente normali, ma poi danneggiate da cause

esterne. es: Post-orchite, Post-traumi, Immunologiche,età.

● cause congenite​ : Problemi nello sviluppo e nella formazione di gonadi e/o di organi genitali

esterni o alterazioni delle gonadi e dei genitali, ad es. ermafroditismo vero e falso.

Alterazioni delle gonadi: ad es. sindrome di Klinefelter, sindrome di Turner (femmine),

sindrome di Noonan (detta anche turner maschile), sindrome di Down.

Focus: Sindrome di Klinefelter

Il soggetto è maschio ed ha 47 cromosomi, con genotipo

XXY. 1 individuo su 500 ne è affetto. Caratteristiche:

Ipogonadismo (dimensioni ridotte dei testicoli)

➔ Bassi livelli di testosterone

➔ Livelli di FSH ed LH molto elevati

➔ Assenza di produzione di spermatozoi (l’azoospermia

➔ è valutabile con uno spermiogramma)

Sterilità

Avendo due X, ha anche due corpi di barr nelle cellule.

Terapia: somministrazione di testosterone.

Le cause sono rintracciabili o nella non disgiunzione dei

cromosomi sessuali a livello dello spermatozoo prima della

fecondazione, oppure nella non disgiunzione delle X

appartenenti alla cellula uovo.

Un altro possibile risultato è l​ ’ipogonadismo ipogonadotropo, ​

o secondario​ , in cui, alterazioni delle funzioni ipotalamiche o ipofisarie, determinano un deficit nella

secrezione di gonadotropine​ . Anche in questo caso, possiamo distinguere:

● Cause acquisite: Secrezione alterata di gonadotropine e/o GnRH. Questa condizione può

essere determinata da: Tumori nella regione ipotalamo-pituitaria, malattie infiltranti (ad es.

sarcoidosi), infezioni (ad es. meningite cronica), traumi, malattie croniche (ad es. cirrosi,

insufficienza renale), terapia cortisonica, terapia GnRH o di analoghi.

● Cause congenite: 80% cause non proprie, 20% mutazioni geniche a livello del cromosoma

X​ : ad es. gene KAL, gene del recettore GnRH: Sindrome di KALLMAN

Focus: Sindrome di Kallman

Il gene kal si trova sul braccio corto del cromosoma X e codifica per ANOSMINA, una proteina il cui

ruolo è coinvolto nel processo di migrazione degli assoni olfattivi e dei neuroni secretori della

GnRH. La migrazione dal placoide olfattivo verso l’ipotalamo porterà alla formazione di quella

regione ipotalamica che produce GnRH. Un’assenza di anosmina comporta quindi la mancata

formazione di questa regione e conseguentemente anche della produzione di quel fattore.

Possiamo confermare una diagnosi non solo valutando la produzione di GnRH ma anche

valutando quella di geni associati.

Questa sindrome può colpire sia i maschi che le femmine e, agendo ad un livello così “in alto”

dell’asse, comporta sterilità per mancata produzione di qualsiasi ormone derivato dallo stimolo del

GnRH.

2)Cause testicolari

Le alterazioni possono

influenzare la morfologia

testicolare. Queste

alterazioni possono essere

causate da diverse

patologie, quali:

criptorchidismo, orchite

infettiva o post-traumatica

(mancata discesa a livello

dello scroto), flogosi o

infezioni del tratto genitale,

varicocele, radiazioni,

immunità

antispermatozoica,

metabolismo, malattie

neoplasia, stress ossidativo.

Focus: varicocele

Il varicocele è una patologia varicosa che interessa il sistema vascolare del testicolo, caratterizzata

da dilatazione ed incontinenza delle vene testicolari che hanno il compito di drenare il sangue dal

testicolo (di solito i dotti deferenti).

Focus: orchidismo

Normalmente la discesa del testicolo comincia tra la decima e la

quindicesima settimana di gestazione e la prima fase è un processo

già programmato nello sviluppo embrionale, indipendente da ormoni.

La seconda fase avviene invece con una decina di settimane di

ritardo, a partire dalla ventiseiesima fino alla quarantesima ed è

ormoni-dipendente: il testicolo produce testosterone e stimola la

discesa finale a livello dello scroto. Se ciò non avviene, o

unilateralmente o bilateralmente, è sempre meglio intervenire in

adolescenza, chirurgicamente piuttosto che più avanti.

Focus: torsione testicolare

La torsione testicolare si verifica quando il cordone

spermatico si attorciglia, interrompendo l'afflusso di sangue al

testicolo. Il sintomo principale è il dolore testicolare. Si tratta

di una circostanza drammatica, che richiede un intervento

chirurgico non appena compaiono i sintomi. L'alterazione

della fertilità dipende dalla prontezza con cui il problema

viene risolto.

Possono esserci anche fattori genetici che causano infertilità maschile, di solito legate ad

alterazioni genetiche a livello del cromosoma Y. Un esempio è l’eliminazione del fattore AZF

(Fattore Azosferico) sul cromosoma Y. Di questo esistono tre isoforme: A,B e C e, a seconda di

dove avvenga la delezione ci sono diverse conseguenze sulla fertilità.

In particolare, i fattori azoospermici (AZFa, AZFb e AZFc) presenti nel braccio lungo del

cromosoma Y sono i più importanti per il processo di spermatogenesi.

(il gene SRY è sul braccio corto)

La loro cancellazione può indurre l'arresto spermatogenico e di conseguenza la sterilità maschile.

Diverse delezioni della AZF portano a diversi fenotipi. L'eliminazione AZFc rappresenta il tipo più

comune.

3)Cause post testicolari

Le cause post-testicolari sono per lo più

ostruzioni congenite del tratto seminale,

riguardanti, cioè, i dotti deferenti e l’epididimo.

Possono essere divisi in prossimali e distali.

1) Prossimali: colpiscono in tutto o in parte

l'epididimo e/o le difese del dotto; ostruzioni

complete determinano l'azoospermia​ , mentre

un'ostruzione parziale porta l'oligozoospermia​ .

L'ostruzione prossimale può essere indotta da processi infiammatori, alterazioni funzionali o

malformazioni.

2) Distali: colpiscono i dotti eiaculatori e, raramente, i dotti delle vescicole seminali. In tal caso

l’ostruzione può essere parziale o totale. Essi rappresentano solo l'1% delle cause di sterilità.

Focus:sindrome della fibrosi cistica

Le mutazioni nel gene del regolatore che determina la sindrome della fibrosi cistica transmembrana

(CFTR) sono una causa relativamente frequente di sterilità maschile.

Queste infatti possono sia causare la tipica fibrosi cistica (CF) sia la sterilità maschile, per esempio

a causa di azoospermia ostruttiva, o forme atipiche (spesso monosintomatiche) di CF, come

l'assenza congenita di dotti deferenti, ostruzione bilaterale del dotto eiaculatore o ostruzioni

bilaterali all'interno dell’ epididimo.

Approccio

diagnostico

Infertilità femminile

Il sintomo più tipico della sterilità femminile, soprattutto a causa di un'alterazione ipotalamica

dell'asse riproduttivo, è l’ amenorrea. L’ amenorrea è definita come l'assenza di un periodo

mestruale in una donna in età riproduttiva (prima dei 40 anni) e può essere diviso in base al

meccanismo eziopatologico che causa la sindrome in:

1. Ipotalamico

2. Pituitaria

3. Ovaria

Classificazione dell’amenorrea

1) Cause ipotalamiche:

a) Disfunzionali:

- Anoressia nervosa

- Perdita di peso

- Esercizio fisico eccessivo

- Stress

- Sospensione della terapia estroprogestinica (pillola)

b) Genetiche:

- Mutazione del gene GnRH

- Mutazione del gene recettore GnRH (sindrome di Kallman)

c) Risultato dei processi intracerebrali espansivi:

- Tumori (craniofaringioma, germinoma, teratoma...)

- Infezioni (tubercolosi)

- traumi ​

2) Cause ipofisarie:

a) Tumore:

- Prolattinoma (tumore delle cellule secernenti prolattina)

- Altri tumori che secernono altri ormoni pituitari (ACTH, TSH, GH, gonadotropine)

b) Genetico:

- Mutazioni dei geni dei recettori FSH e LH

- Mutazioni dei geni della gonadotropina

- Sindrome X fragile (o Martin -Bell)

- Galattosemia

- Sindrome di Lawrence

- Sindrome di Prader-Willi (fenotipo distinguibile: bassi, grassi, con mani e piedi molto piccoli)

c) Patologie autoimmuni (ASA) maschili e femminili

3) Cause ovariche​ :

a)​ Sindrome dell’ovaio policistico

b)​ Disgenesi gonadica

- Cariotipo anormale (sindrome di Turner, mosaicismo)

-cariotipo normale [disgenesi gonadiana pura con cariotipo 46,XY (sindrome di Swyer)], o 46,XX

c) Agenesia gonadica

e) Insufficienza ovarica precoce​ (chiamata anche insufficienza ovarica primaria):

- genetica, causata da mosaicismi con linee cellulari 45,X

- Risultato di radio o chemioterapie, processi infiammatori o autoimmuni

f) sindrome ovarica resistente (sindrome di Savage)

g) Risultato di tumori ovarici primari o metastatici

Anomalie nel distretto uterino e vaginale:

a) Congenito:

-Agenesia dei dotti mulleriani (sindrome di Rokitansky-KusterMayer)

-Anomalie ostruttive del segmento mariano

-​ Resistenza congenita agli androgeni (sindrome da femminilizzazione testicolare:aspetto di

donna ma cariotipo maschile, non ci sono i testicoli esterni ma sono all’interno)

-Imeni imperforati

-Agenesia della cervice o della vagina

-Aplasia o ipoplasia endometriale

b) Acquisite:

-sinechie uterine (sindrome di Asherman)

-stenosi cervicale

​ 4)Altre cause​ :

a) Risultato di disfunzione delle ghiandole endocrine:

-​ Ghiandole surrenali:​ iperplasia surrenale, sindrome di Cushing

-Tiroide: iper/ipotiroidismo

b) Risultato di malattie croniche debilitanti

c) Risultato delle patologie sistemiche

Amenorrea ipotalamica

Può essere diviso in Primario e Secondario.

La primaria​ può essere:

1. Forme idiopatiche:

-Sindrome di Kallman​ : alterazioni a livello del cromosoma X, quindi colpisce ambo i sessi **già

approfondita**

-Sindrome di Prader-Willi​ : causata da mutazioni dei geni nel braccio prossimale del cromosoma 15;

determina ipogonadismo ipogonadico, ovvero un’alterazione dei livelli normali delle gonadotropine,

che causa obesità, ritardo mentale, bassa statura, strabismo e piccole mani e piedi

- Ritardo costituzionale della pubertà: la forma più rara di ipogonadismo ipogonadotropo; è causata

da una attivazione ritardata dell'asse riproduttivo.

2. Forme organiche: processi infiammatori o, più frequentemente, neoplastici.

La secondaria può essere:

1. Forme funzionali:

-Disfunzione ipotalamico-psicogena: malattia neurologica dovuta a fattori psico-emotivi, che

determina una disfunzione nella regolazione della GnRH. Questa condizione porta ad una

insufficienza di gonadotropina e amenorrea.

-anoressia nervosa: sindrome clinica che comprende l'amenorrea, insieme ad altri sintomi generali

e psichiatrici.

-Attività fisica eccessiva

- Abuso di droghe

2. Forme organiche: risultato di processi espansivi, infiammatori e traumatici

Schema diagnostico dell’amenorrea primaria

Schema diagnostico dell’amenorrea secondaria

Amenorrea ipofisaria

Può essere causato da meccanismi neoplastici o non neoplastici. Un esempio di quest'ultimo è

costituito dalla sindrome di Sheehan​ : cedimento dell'ipofisi causato da una necrosi di massa, che

può seguire ad un'emorragia post-partum. I sintomi si manifestano quando almeno il 70% del

parenchima ghiandolare è affetto (morto).

Focus amenorrea primaria: sindrome di Turner​ , dal cariotipo 45,X0, è la forma più frequente di

ipogonadismo congenito, con una frequenza di 1/5000 femmine. Il cariotipo 45,X0 è determinato

dalla perdita del cromosoma X paterno (75%), o dalla perdita di quello materno (25%). L’analisi

ormonale vede livelli di FSH ed LH molto elevati (ipogonadismo ipergonadotropo), insieme a livelli

di estradiolo bassi. All’ecografia le ovaie presentano fibromi ed il trattamento prevede la

somministrazione di estro-progestinici.

Amenorrea ovarica

Focus: sindrome dell’ovaio policistico

Si tratta di una sindrome che colpisce l'uno per cento delle donne, quindi estremamente diffusa. Ed

inoltre costituisce il 20% delle cause di infertilità femminile. In una condizione normale da una corte

di ovociti che parte se ne distingue uno dominante per maggiori dimensioni che andrà incontro allo

sviluppo completo Mentre gli altri degenerano.

In una condizione patologica dell'individuo affetto da sindrome dell'ovaio policistico non c'è la

distinzione dell'ovocita dominante. Per questo motivo gli ovociti crescono tutti più o meno delle

stesse dimensioni, ma nessun follicolo scoppia per consentirne la fuoriuscita, in quanto restano

tutti bloccati in fase antrale.

Non è facile capire cosa provochi questa sindrome, in quanto si tratta di una condizione

multifattoriale, che interessa segnalazioni di tipo locale e segnalazioni endocrine. Alcuni dei fattori

coinvolti sono di origine genetica altri invece sono di origine ambientale. Sicuramente tra i fattori

chiave abbiamo degli elevati livelli di androgeni, livelli pressoché triplicati di LH, ma anche livelli

anomali di insulina (iperinsulinemia o resistenza all’insulina). In parte gli androgeni in eccesso

derivano dall’ ovario, perché non c'è la conversione mediante l'enzima aromatasi in estrogeni a

livello delle cellule della granulosa, in parte dalla ghiandola renale, che normalmente riarrangia il

colesterolo producendo corticosteroidi, ma in questo caso porta alla steroidogenesi ed in

particolare alla produzione di androgeni. Infine il tessuto adiposo, che ha una funzione endocrina, è

responsabile della produzione di ulteriori androgeni (oltre alla leptina). Non si sa ancora bene come

l’eccesso di questi ormoni, unito alle altre concause, porti all’accumulo e conseguente atresia

follicolare tipica dell’ovaio policistico. Se facessimo un tunel test (esame che colora i frammenti di

DNA per individuare anomalie nell’organizzazione della cromatina) su cellule della granulosa di

topo in cui è simulata la condizione di PCOS, sapendo che le cellule in atresia (apoptosi) hanno il

DNA frammentato in pezzetti da circa 180 paia di basi, vedremo che queste cellule si

colorerebbero intensamente a livello del nucleo, evidenziando DNA frammentato.

I sintomi della PCOS sono:

Anovulazione: Oligomenorrea (60%), Amenorrea (30%) o Infertilità (70%)

Iperandrogenismo: Acne (20%), Irsutismo (70%), Obesità (50%)

Alterazioni nella composizione lipidica

● Alti livelli di colesterolo LDL

● Alti livelli di trigliceridi

● Bassi livelli di colesterolo HDL

● Bassi livelli di lipoproteine A1

● Ridotta attività fibrinolitica

Alterazioni ormonali comuni nei PCOS

● Alti livelli di LH

● Aumento del rapporto LH/FSH

● Alti livelli di estrogeni

● Bassi livelli di SHBG (globulina che si lega all'ormone sessuale)

Alterazioni metaboliche comuni nei PCOS

● Iperinsulinemia e resistenza all'insulina

● La resistenza all'insulina può essere indipendente dall'obesità

● Riduzione della sensibilità periferica all'insulina (può anche essere una causa)

Terapia: A seconda che si desideri o meno una gravidanza, si può trattare la sindrome dell'ovaio

policistico in differenti modi. Se non si desidera avere una gravidanza bisogna fare una distinzione

tra i pazienti che hanno insulino-resistenza, e quelli che non ce l’hanno. Nel primo caso, sono

necessarie una dieta appropriata, moderata attività fisica e metformina (farmaco che riduce

l'insulino-resistenza). I pazienti possono Rispondere alla cura in maniera positiva Oppure fai cattiva

ed in questo caso (negativo), è necessario integrare la terapia con la medesima soluzione adottata

dai pazienti che non hanno (o hanno una bassa) insulino-resistenza, ovvero fornire

estroprogestinici ed antiandrogeni. Se invece si desidera avere una gravidanza si può agire

inducendo l’ovulazione, mediante somministrazione di gonadotropine o clomiphene.

Focus: POF: Premature ovarian failure (menopausa precoce)

POF è descritta come amenorrea a causa della perdita di funzione ovarica prima dei 40 anni. Si

tratta di uno stato di ipogonadismo ipergonadotropo femminile. Può manifestarsi come amenorrea

primaria, con insorgenza del menarca, o amenorrea secondaria ed è presente nell'1% delle donne.

Le cause conosciute includono:

1. Aberrazioni genetiche, che coinvolgono il cromosoma X (94%) o autosomi; sebbene un gran

numero di geni sia stato sottoposto a screening, sono state identificate poche mutazioni causali

evidenti​ .

2. Danno ovarico autoimmune (POF associata con altri disturbi autoimmuni).

3. Interventi chirurgici, radioterapeutici o chemioterapici come nelle neoplasie maligne.

4. Fattori ambientali come le infezioni virali e le tossine per le quali non si conosce un meccanismo

chiaro. La diagnosi si basa

sull'individuazione di

oligo/amenorrea almeno 4 mesi

prima dei 40 anni, associata a

livelli di FSH nel range della

menopausa (>25 Unità/mI in due

occasioni a distanza di 4

settimane). A livelli elevati di

FSH si osserva anche una ridotta

produzione di inibina​ , con

conseguente non maturazione

degli ovociti. Il biologo va a

misurare essenzialmente livelli

ormonali per poter diagnosticare

quanto prima possibile una

condizione patologica di questo genere. Nei numerosi test, vengono presi in esame anche tutta

una serie di anticorpi presenti nel plasma, per esempio contro gli ormoni adrenocorticotropici, o

contro la tiroide perossidasi.

La gestione di questa sindrome essenzialmente coinvolge una terapia ormonale per il trattamento

di sterilità ed è volta a migliorare soprattutto i sintomi di una menopausa precoce, come per

esempio la tachicardia, i cambiamenti di umore, l'abbassamento del desiderio sessuale (androgeni)

e l’ insonnia. Si tratta di una terapia fortemente personalizzata in base ai livelli ormonali della

paziente. I bassi livelli di estrogeni che caratterizzano questa sindrome possono causare anche

altri tipi di patologie come per esempio l'osteoporosi, quindi il trattamento ormonale sostitutivo mira

anche alla prevenzione alla cura di questa condizione, migliorando globalmente la qualità della vita

della donna.

La crioconservazione degli embrioni, la crioconservazione del tessuto ovarico e la

crioconservazione degli ovociti sono promettenti nei casi in cui l'insufficienza ovarica è prevedibile,

come nelle donne in trattamento per il cancro.

Se la donna ha risposto bene al trattamento e desidera rimanere incinta a circa il 5% delle

possibilità di ottenere una gravidanza naturale. Per aumentare le possibilità si può effettuare un

trattamento ormonale oppure ci si deve organizzare per poter adoperare gli ovociti in donazione (In

questa patologia si hanno problemi solamente a livello dell'ovario ma il resto delle vie genitali non

sono compromesse).

Endometriosi

L'endometriosi è definita come la presenza di

tessuto endometriale al di fuori dell'utero, che induce

una reazione infiammatoria cronica. Mentre alcune

donne con endometriosi sperimentano sintomi

dolorosi e/o infertilità, altre non hanno alcun sintomo.

L'esatta prevalenza dell'endometriosi non è nota, ma

le stime vanno dal 2 al 10% nella popolazione

femminile generale, ma fino al 50% nelle donne

sterili.

Pur essendo ancora sconosciute le cause vere di

questa malattia sono state formulate due distinte

teorie:

1) Teoria mulleriana

Questa teoria prende in considerazione l'origine

delle vie genitali femminili. Il dotto di Muller è un dotto primitivo presente insieme al dotto di wolf

quando questi sono presenti contemporaneamente rappresentano lo stadio di gonade bipotente

indifferenziata. Nel caso in cui si ha genotipo XY, si andrà verso la differenziazione della gonade

maschile: le cellule del Sertoli inizieranno a produrre un fattore anti-dotto di Muller, causandone la

degenerazione. Se invece il controllo cromosomico è di tipo xx, il dotto di Muller andrà incontro a

modificazioni, sotto un controllo di tipo ormonale (estrogeni), e darà origine alle vie genitali

femminili. Dal momento che entrambi i dotti ovarico e mulleriano derivano dal mesotelio

celomatico, secondo questa teoria l'epitelio germinale ovarico può anche differenziare nel tessuto

dell'endometrio.

2) Teoria dell'impianto e della diffusione metastatica (più accreditata):

L'endometriosi è stata attribuita al riflusso di mestruazioni (endometrio) attraverso le tube di

Falloppio. Inoltre, frammenti trovati in canali vascolari o linfatici, spiegano la sua presenza in siti

meno accessibili come il ombelico, linfonodi pelvici, uretere, setto rettovaginale, parete intestinale e

siti remoti come il polmone, pleura, endocardio e le estremità.

Endometriosi ovarica

La diagnosi di endometriosi ovarica è effettuata mediante un'attenta ispezione di tutti i lati di

entrambe le ovaie. Con l'endometriosi ovarica superficiale, le lesioni possono essere sia tipiche

che sottili. Le cisti endometriosiche ovariche più grandi (ENDOMETRIOMA) si trovano solitamente

sulla superficie anteriore dell'ovaio e sono associate a retrazione, pigmentazione e aderenze al

peritoneo posteriore. Queste cisti endometriosiche ovariche contengono spesso un fluido denso e

viscoso di colore bruno scuro ("fluido di cioccolato") composto da emosiderina derivata da

precedenti emorragie intra-ovariche.

Endometriosi rettovaginale

L'endometriosi rettovaginale è la forma più grave di

endometriosi. Clinicamente, si presenta con una serie di

sintomi tra cui dolore pelvico cronico, dismenorrea,

dispareunia profonda, dischezia e sanguinamento

rettale. Il metodo gold standard per la diagnosi è la

laparoscopia con conferma istologica; tuttavia, esistono

diverse opzioni per la diagnosi pre-chirurgica, tra cui

esame clinico, ultrasuoni transvaginali/transrectali,

risonanza magnetica, colonscopia.

L’endometriosi è una malattia che ha a che fare con cause congenite ereditabili. Il rischio di

endometriosi è sette volte maggiore se un parente di primo grado è stato colpito da endometriosi.

Studi sui gemelli monozigoti hanno ampiamente confermato la teoria secondo la quale si tratti di

un’ eredità multifattoriale. Tra i geni coinvolti troviamo:

1. NAT2 (N-acetiltransferasi) è un enzima normalmente implicato nel processo di detossificazione,

idrolizzando composti aromatici attraverso il trasferimento di un gruppo acetile dall'acetil-CoA

all'azoto del substrato. Un polimorfismo del gene NAT2 determina un fenotipo in cui l'acetilazione

è più lenta

: questo fenotipo è più comune tra i pazienti affetti da endometriosi.

2. Recettori steroidei​ : l'endometriosi è una patologia estrogeno-dipendente e che gli estrogeni sono

essenziali lo sviluppo delle lesioni endometriotiche.

Alcuni studi hanno mostrato la presenza di molti polimorfismi del recettore degli estrogeni ER α,

che sembrano essere correlati all'endometriosi. ​

3. Resistenza al progesterone​ :

L'endometriosi sembra essere

caratterizzata da una

resistenza al progesterone: c'è

una forte riduzione dei livelli di

progesterone e della perdita

totale del suo recettore PR-B.

PR-B è il vero attivatore dei

geni bersaglio del

progesterone, tuttavia esiste

un altra isoforma del recettore

chiamata PR-A, che agisce come un inibitore della PR-B. Quindi, l'alterazione del corretto rapporto

PR-A /PR-B, potrebbe essere la causa del malfunzionamento: un eccesso di PR-A causa

l’inibizione di PR-B e quindi della captazione vera e propria del progesterone.

In condizioni normali l’aromatasi viene bloccata consentendo un ciclo di proliferazione ed apoptosi.

In endometriosi non avviene il blocco dell’aromatasi a causa della mancata conversione

dell’estrone in estradiolo (dovuta a sua volta alla resistenza al progesterone). Essendo l’aromatasi

responsabile della conversione degli androgeni in estrogeni, questo causa un incremento dei livelli

di estradiolo. Questo comporta una mancata apoptosi dei tessuti proliferati.

L'​ attivazione del sistema immunitario sembra avere un ruolo essenziale nella determinazione della

malattia. Questo riguarda principalmente l'immunità mediata da cellule, quindi monociti, macrofagi,

linfociti T, cellule natural killer.

Il liquido peritoneale, nell'endometriosi, mostra la presenza di macrofagi e cellule natural killer.

Un'alterazione della risposta immunitaria cellulo-mediata, può determinare una tolleranza agli

antigeni dell'endometrio, consentendo quindi il loro impianto ectopico.

Normalmente le cellule NK riconoscono e lisano le cellule infettate da tumori e virus anche nella

cavità peritoneale, dove sono in grado di limitare la crescita delle cellule endometriali che si

riversano in questo distretto; è stato osservato la loro popolazione è normale in termini di numero

nei pazienti affetti da endometriosi, quindi, il difetto è solo funzionale.

Una volta iniziato il processo infiammatorio, si possono analizzare numerosi dati. Un approccio può

essere quello di effettuare una piccola biopsia, estrarre gli RNA totali ed effettuare una

retrotrascrizione per ottenere cdna. Questo può essere utilizzato come stampo per vedere quali

sono i geni trascritti nel tessuto preso in esame. Due fattori principali permettono alle

cellule dell'endometrio di evitare la

sorveglianza del sistema immunitario:

-Espressione di antigeni HLA di classe I

-Fattori solubili in grado di inibire

l'attività delle cellule NK, come TGF-β​ ,

proteina placentare 14.

I macrofagi peritoneali sono

normalmente presenti e in grado di

eliminare eritrociti, frammenti tissutali e

probabilmente cellule endometriali

fuoriuscite dalle tube. Nell'endometriosi,

questi aumentano in termini di numero

totale, concentrazione e stato di

attivazione: questo può essere

associato ad una stimolazione cronica

da parte dei frammenti di endometrio

ectopico.

Molti fattori di crescita sono associati

con l'attività macrofagica in

endometriosi: PDGF (fattore di crescita

derivato dalle piastrine), MDGF (fattore

di crescita derivato dai macrofagi), EGF

(fattore di crescita epidermica). Tutti questi fattori sono in grado di stimolare la proliferazione delle

cellule endometriali in vitro, quindi si suppone che siano in grado di farlo anche in vivo nella

condizione di endometriosi.

​ ​

Inoltre, TNF-α (fattore di necrosi tumorale) e varie citochine, presentano concentrazione più elevata

del normale nelle donne affette. La loro normale concentrazione è dovuta alla produzione da parte

di macrofagi e cellule mesoteliali di peritoneo: in endometriosi anche le cellule endometriali

contribuiscono a questa produzione, così come presentano un’ alterazione anche del VEGF

(fattore di crescita endoteliale vascolare), un fattore che stimola l’angiogenesi. Questo processo è

strettamente correlato alla condizione patologica e coinvolge anche i già citati IL-8(citochina),

TNF-α e TGF-β.

Quindi il classico pathway dell'endometriosi è descritto dalla proliferazione dei fattori di crescita

correlata a un aumento di citochine.

In endometriosi abbiamo già detto che anche l’enzima 'aromatasi aumenta.Gli induttori più potenti

dell’aromatasi sono le prostaglandine (PGE2), che aumentano notevolmente in caso di infezione

dell’endometrio e gli estrogeni.Quindi si crea una sorta di meccanismo a feedback positivo che si

auto-alimenta, contrastando i processi apoptotici ed inducendo proliferazione cellulare e

contemporaneamente la reazione infiammatoria. Un altro fattore in grado di promuovere la

proliferazione delle cellule endometriotiche è bFGF (fattore di crescita dei fibroblasti basali), che ha

stimola la proliferazione e l’ attività angiogenica. La sua attività è strettamente modulata dalla

presenza delle forme di senso e antisenso del suo mRNA.

Chapter 4: Ovarian reserve markers

Prima di iniziare un percorso di fecondazione assistita è necessario fare alcune analisi per

controllare il numero di ovociti rimasti alla paziente. Queste analisi sono fondamentali perché il

trattamento per la fertilità prevede che si induca nella donna una super ovulazione, quindi è bene

sapere prima quanti tentativi si possono predisporre. Fino alla fase di ovocita secondario, abbiamo

l'azione di un controllo paracrino che impedisce a tutti gli ovociti presenti, di partire

simultaneamente per la maturazione. In questa fase si ha prevalentemente un iniziazione ed

accrescimento del follicolo. Il primo segnale che viene prodotto fin dalle primissime fasi di sviluppo

è l’anti mullerian hormone prodotto dalle cellule del Sertoli quando il genotipo embrionale è di tipo

XY. Grazie alla presenza di questi segnali il dotto di Muller degenera e contemporaneamente viene

favorito lo sviluppo della gonade maschile. Il nome di questo segnale deriva proprio dal ruolo

chiave che gioca durante questo periodo dello sviluppo; tuttavia nella donna adulta esso compare

nuovamente per ricoprire una funzione importante a livello dell'ovario. Le sue concentrazioni

aumentano durante la fase del controllo paracrino, fino a raggiungere un picco massimo nella fase

di follicolo antrale ridotto. In seguito si passa ad una vera e propria fase di reclutamento, in cui il

controllo endocrino regola lo sviluppo del follicolo dal preantrale, antrale ed ovulatorio, fino

all’espulsione dell’ovocita e formazione del corpo luteo. A partire da questa fase vengono prodotti

anche segnali di morte, assenti nella precedente, che inducono l’apoptosi (atresia) dei follicoli non

dominanti. Oltre ai segnali già approfonditi nei capitoli precedenti, nell'immagine sovrastante

​ ​

troviamo altri due segnali: BPM15 e GDF9​ . Si tratta di segnali altamente conservati anche nei

modelli sperimentali più semplici, come zebrefish, che persistono rispettivamente fino alla

formazione del corpo luteo e fino al follicolo preovulatorio.

Grazie all’aiuto delle biotecnologie, oggi possiamo anche effettuare dei test che ci informano sulla

riserva ovarica, termine usato per descrivere il potenziale funzionale dell'ovaio, che riflette il

numero e la qualità degli ovociti al suo interno. Nell'equazione alla base di questo calcolo, figurano

fattori già visti come: Età, storia di esposizione a una gonadotossina confermata, cioè fumo di

tabacco, chemioterapia, radioterapia, storia familiare di menopausa precoce o insufficienza ovarica

precoce (POF), chirurgia ovarica estensiva, cioè cistectomia e ooforectomia unilaterale

(ovariectomia), BMI (indice di massa corporea) (stile di vita sedentario / dieta ad alto contenuto

calorico), malattie ovariche (endometriosi, malattia infiammatoria pelvica).

Un buon test della riserva ovarica dovrebbe essere

predittivo del concepimento (con o senza trattamento) e

dovrebbe indicare per quanto tempo gli attuali livelli di

attività ovarica possono essere mantenuti prima che

l'invecchiamento ovarico entri in vigore. Nel caso del

test della riserva ovarica, la sensibilità, la specificità,

l'alto valore predittivo positivo (PPV) e negativo (NPV)

sono i valori più importanti e vengono valutati grazie a

metodi informatici, sulla base di un controllo incrociato

tra l’analisi dei biomarker e quella della risposta ovarica.


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Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia applicata
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher lauragaggiano di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie della riproduzione e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Politecnico delle Marche - Univpm o del prof Carnevali Oliana.

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