Appunti Biotecnologie della riproduzione assistita

BIOTECNOLOGIE DELLA RIPRODUZIONE ASSISTITA

6 CFU – PROF.SSA LAURA FRANCESCA RIENZI

ANNO 2019/2020

PROGRAMMA

01 Gametogenesi umana: spermatogenesi e ovogenesi (6 ore)

02 Valutazione del liquido seminale, tecniche di separazione nemaspermica ed inseminazione

intrauterina (5 ore)

03 Fecondazione Assistita: stimolazione ovarica, prelievo chirurgico di ovociti e spermatozoi,

inseminazione in vitro (FIVET e ICSI), trasferimento embrionale (6 ore)

04 Valutazione di ovociti ed embrioni pre-impianto (5 ore)

05 Tecniche di Crioconservazione di gameti ed embrioni (5 ore)

06 Risultati delle tecniche di procreazione medicalmente assistita ed il loro impatto sociale (5 ore)

07 Diagnosi genetica pre-impianto (6 ore)

08 Cenni sulla gestione qualità dei centri di PMA ed inquadramento Legislativo (4 ore)

LIBRO CONSIGLIATO: Biologie della riproduzione umana.

Lenzi e Gandini

LEZIONE 1

Il concepire un bambino garantisce la sopravvivenza della specie, è un’esperienza importante della

vita.

“L’infertilità è una patologia caratterizzata dall’incapacità di generare una gravidanza dopo 12 mesi

di regolari rapporti sessuali non protetti dovuti ad una incapacità riproduttiva del singolo partner o



del/della partner” Questa è la definizione dell’OMS.

Questa definizione si estende anche a coppie di individui dello stesso sesso, individui single e anche

persone che hanno avuto un cancro e di conseguenza hanno subito trattamenti oncologici

(gonadotossici). Si possono conservare le uova o gli spermatozoi e di conseguenza l’infertilità può

essere bypassata attraverso le cure fornite dal SSN. A tutti questi individui è rivolta la procreazione

medicalmente assistita.

L’infertilità è considerata come una patologia che genera disabilità: Ci sono oltre 50 milioni di coppie

in tutto il mondo colpite da infertilità per svariati motivi, che vedremo in seguito.

Dagli anni 60 ad oggi c’è una drammatica riduzione del numero di bambini per donna fertile, oggi si

è scesi sotto a 2, prima erano almeno 3. Inoltre, la gravidanza viene sempre più posticipata. Tutto

ciò non è specifico di una sola regione, ma è diffuso ovunque in tutto il mondo tranne nell’Africa

Sub-Sahariana. Il numero di figli è inversamente proporzionale al reddito: più si hanno soldi meno



figli si vogliono il figlio viene percepito come un costo mentre prima erano ulteriori braccia per il

lavoro.

La Francia non ha avuto lo stesso calo di nascite dell’Italia perché sono stati investiti moltissimi soldi



per la genitorialità sgravi fiscali e altri contributi. Si tratta di un progetto a medio-lungo termine

perché i benefici si avranno in futuro.

Fact-book: è un report che mostra varie tendenze in tutto il mondo. Nel nostro caso si vede che la

popolazione europea sta invecchiando, nel 2025 si arriverà a 49-50 anni di età media. Ci sarà un

aumento di tasse e serviranno misure specifiche e politiche atte ad affrontare questo declino

demografico. Tramite questi grafici della CIA si è stimato che per l’Italia e il Giappone si arriverà ad

una tassazione del 50-60%. In questo contesto si vede l’importanza delle tecniche di biologia

riproduttiva, nate 50 anni fa.

FECONDAZIONE ASSISTITA: Prendiamo le uova da una donna che ha subito una stimolazione per

produrne molte, le inseriamo in una piastra petri insieme agli spermatozoi e poi si reimpianta

l’embrione in utero. La prima bambina concepita in questo modo ha oggi 40 anni. Le prime

fecondazioni assistite hanno creato molte controversie perché non si sapeva se stare fuori dall’utero

poteva creare problemi al feto.

Oggi l’età media è 32,1 per la prima gravidanza e quindi sono aumentate le problematiche non

l’infertilità. In passato, a quest’età una donna era considerata una primipara attempata.

La PMA svolge un ruolo cruciale per la riproduzione assistita: Si è passati da 1 su 10, a 2,4% di

bambini nati per procreazione assistita.

Ci sono vari pensieri errati diffusi sulla fecondazione assistita:

- Paura delle stimolazioni ormonali

- Nascita di gemelli

- Inefficacia

Si è visto che con l’aumentare dell’età queste tecniche di PMA perdono la loro efficacia o se

funzionano c’è un’alta probabilità di aborto. 2/3 della popolazione che si rivolge alla PMA ha più di

35 anni. La correlazione tra l’aumentare dell’età e la diminuzione dell’efficacia delle tecniche di PMA

e della capacità in generale di rimanere incinte dipende dalla meiosi nella donna che è molto

delicata.

RIPASSO MEIOSI



MEIOSI I Si dividono i due cromosomi omologhi della madre e del padre: APLOIDIA



MEIOSI II Si dividono i 4 cromatidi fratelli

La cosa importante è il CROSSING-OVER che garantisce la ricombinazione genetica, non solo perché

vengono ricombinati i geni del padre e della madre ma anche per lo scambio dei “pezzettini” dei

cromatidi. Se la meiosi fosse solo quella

rappresentata nella parte A: 1

individuo su 5 non verrebbe

generato. Esistono tanti modi

diversi per avere una meiosi

corretta perché si generano degli

errori che poi vengono riparati

attraverso sistemi appositi.

- La meiosi femminile è molto speciale e unica perché inizia in età fetale: al quarto mese di

gravidanza mi vengono date le uova da mia madre e queste si bloccano mentre stanno

facendo il crossing-over in modo tale che i cromosomi omologhi rimangano uniti fino a



quando non servono le proteine che uniscono i cromosomi omologhi sono le coesine.

Quindi possiamo dire che la profase I duri anni, poi nel momento opportuno riprende e si

ferma di nuovo alla metafase per poi completarsi nel momento in cui l’uovo incontra lo

spermatozoo. Con l’avanzare dell’età invece i cromosomi omologhi perdono la loro coesione

e aumenta la capacità di errore.

- La meiosi maschile invece è molto semplice e consta di due fasi: I e II.



PUBBLICAZIONE SU SCIENCE: Curva a U Mette in relazione l’età con la fertilità.

GENETICA: Tramite le tecniche genetiche si riesce a quantificare quanto incide il patrimonio paterno

e quello materno. Si è visto che più sono i siti di crossing-over, migliore è la qualità dell’uovo.

Le prime fasi di sviluppo embrionale sono le più delicate perché se avvengono errori in queste fasi,

questi riguarderanno tutte le cellule.

La fecondazione assistita non può correggere la qualità intrinseca dell’uovo o spermatozoo ma

piuttosto elimina le barriere meccaniche (ad es. non possiamo eliminare una trisomia). Siccome la

qualità dell’uovo non può essere corretta allora prendo l’uovo di una donatrice: es. caso di una

donna di 50 anni. Ad oggi le donne di 50 anni possono accedere alla FECONDAZIONE ETEROLOGA

usando appunto le uova di una donatrice.

LABORATORIO DI FECONDAZIONE ASSISTITA: Ha le sembianze di una sala operatoria.

VIDEOLEZIONI 1,2,3

LA SPERMATOGENESI: La spermatogenesi è il processo di formazione e maturazione delle cellule

germinali maschili in spermatozoi.

FASE MITOTICA: Moltiplicazione degli spermatogoni per avere un pool sempre uguale dalla pubertà

fino alla fine della vita (cell. staminali germinali). Dura circa 16 giorni. Lo spermatogonio diventa

spermatocita primario.

FASE MEIOTICA: Divisione meiotica degli spermatociti I. 2 fasi: la prima dura 24 giorni e vede la



trasformazione dello spermatocita primario in secondario e la seconda dura qualche ora si

formano gli spermatidi.

SPERMIOGENESI: Trasformazione morfologica degli spermatidi in spermatozoi per oltrepassare le



barriere degli apparati sessuali. Dura 24 giorni si ottengono spermatozoi maturi

Nell’uomo ha una durata 64 +/- 4 giorni e permette la produzione di circa 120 milioni di spermatozoi



al giorno Processo veloce ed efficace Il TUBULO SEMINIFERO ha una morfologia che

rispecchia perfettamente la funzione che svolge,

infatti se lo si osserva dall’esterno verso l’interno

si possono osservare i vari stadi di maturazione

delle cellule, trovando nella parte centrale gli

spermatozoi maturi (nel lume). Gli spermatozoi

entrano nel lume, lo attraversano tutto e arrivano

al testicolo che è un groviglio di tubuli seminiferi

che poi portano gli spermatozoi lungo l’epididimo

e fuori dall’apparato genitale maschile.

Andando ad esaminare più dettagliatamente le cellule che compongono il lume troviamo: 

- Cellule germinali primordiali: spermatogoni che si dividono in due tramite mitosi uno

serve per ripopolare il testicolo, l’altro per proseguire il processo di maturazione.

- Il secondo, tramite maturazione diventa spermatocita primario

- Lo spermatocita primario tramite la prima divisione meiotica produce due spermatociti

secondari bicromatidici

- Gli spermatociti secondari attraverso la seconda divisione meiotica diventano quattro

spermatidi aploidi

- Gli spermatidi si devono poi trasformare assumendo la loro caratteristica forma (testa +

flagello) per essere in grado di trasportare il materiale genetico.

FASE MITOTICA 8-10 GIORNI

Esistono delle nicchie seminali: presenza di cellule

staminali, alta vascolarizzazione, cellule di Leydig.

Gli spermatogoni si dividono in Spermatogonio A e B.



La spermatogenesi lavora in ONDE Gli

spermatogoni lavorano in sincizi. Quando lo

spermatocita primario decide di entrare nella fase

maturativa, durante le mitosi esistono delle

continuità citoplasmatiche cioè due spermatogoni si

replicano in 4 che presentano 4 nuclei con i 4

citoplasmi in contatto: questo permette la

sincronizzazione della formazione degli spermatozoi,

infatti anche le cellule che entrano nella meiosi sono



sincrone e funzionano insieme Formazione onde

che producono molti spermatozoi tutti maturi nello

stesso momento. Dopo la seconda meiosi si formano gli spermatidi che maturando perdono poi il

rivestimento citoplasmatico che li appesantirebbe nel loro cammino.

FASE II MEIOSI

La meiosi consta di 3 diverse fasi e da 1 cellula se ne ottengono 4:

- Duplicazione del DNA Il DNA si duplica e forma i cromosomi formati dai 2 cromatidi uniti

dal centromero

- I divisione meiotica Noi umani abbiamo 23 coppie di cromosomi (uno di origine paterna

e uno materna), si chiamano cromosomi omologhi. I cromosomi omologhi si allineano sulla

piastra metafasica cioè al centro della cellula e verranno trascinati dai microtubuli per poi

separarsi e andare in 2 spermatociti secondari. Durante questo allineamento avviene il

crossing over. 

- II divisione meiotica Gli spermatociti secondari hanno un corredo cromosomico aploide:

23 cromosomi formati da 2 cromatidi quindi serve una seconda divisione equazionale che

separi i cromatidi fratelli e alla fine abbiamo spermatidi aploidi con un solo cromatide.

FASE III SPERMIOGENESI E STRUTTURA SPERMATOZOO

Uno spermatide con nucleo e citoplasma svilupperà vari accessori. Da una parte si forma

l’ACROSOMA dall’apparato del Golgi (cappuccio enzimatico che permette l’attraversamento della

barriera dell’ovocita), dall’altra parte si ha perdita del citoplasma con relativa fagocitosi e sviluppo

del flagello. Nel collo sono presenti le riserve energetiche rappresentate dai mitocondri che

permetteranno il movimento insieme al flagello. Nella testa è presente un nucleo molto compattato

 nella compattazione del DNA vengono eliminati gli istoni e si usano altre proteine (PROTAMINE).

È presente anche un CENTRIOLO prossimale fondamentale per la fecondazione perché nell’ovocita

vengono portati solo il DNA e il centriolo.



FLAGELLO Struttura molto complessa con assonema 9+2: si trovano 9 coppie di microtubuli

esterne + 2 centrali, è lo slittamento di queste due centrali a permettere il movimento.

Un errore nella corretta configurazione cromosomica potrebbe creare spermatidi errati (diploidia,

monosomia…). Questi errori sono rari e più comuni nella meiosi femminile. Configurazione normale:

18X.

Nel testicolo oltre alle cellule germinali esistono anche delle cellule somatiche di 2 tipi:

- Nel tubulo seminifero abbiamo le CELLULE DEL SERTOLI fondamentali a sostenere la

spermatogenesi. Si trovano nel connettivo. Servono per dare sostegno alle cellule germinali

dall’esterno verso l’interno e sono inoltre responsabili del mantenimento del numero degli

spermatogoni che sono le cellule germinali, mantenendo così l’omeostasi. Queste cellule

producono anche ormoni sotto stimolazione dell’ormone FSH prodotto dall’adenoipofisi. Le

cellule del Sertoli presentano dei recettori specifici per l’FSH. Durante la vita fetale

producono anche l’ormone anti-Mulleriano AMH in tal modo concorrono alla

degenerazione del dotto di Muller e alla differenziazione in senso maschile delle gonadi

indifferenziate. Dopo la pubertà le cellule del Sertoli producono anche gli ormoni INIBINA e

ATTIVINA. Secernono anche proteine leganti gli androgeni ABP che hanno un fattore

neutrofico delle cellule derivate dalla linea gliale, che è stato dimostrato abbiano un effetto

proliferativo sugli spermatogoni indifferenziati. Producono anche fattori di trascrizione e

producono la cosiddetta barriera ematotesticolare. Contribuiscono anche alla rimozione

dell’eccesso di citoplasma dagli spermatidi maturi. Secernono anche il fluido che permette il

viaggio nel lume

- Tra un tubulo seminifero e un altro ci sono le CELLULE DI LEYDIG, nello stroma. Rilasciano

principalmente ormoni ANDROGENI come il TESTOSTERONE e l’ANDROSTENEDIONE. Le

cellule di Leydig sono stimolate dall’ormone luteinizzante LH ipofisario. Il testosterone è

fondamentale allo sviluppo degli organi sessuali, al differenziamento del testicolo e per i

caratteri sessuali secondari. Questo ormone in età puberale limita anche l’accrescimento

delle ossa lunghe evitando una crescita sproporzionata. Nell’uomo adulto i livelli di

testosterone giocano un ruolo fondamentale per la sessualità, l’apparato muscolare

scheletrico, la buona salute e la vitalità, contribuisce quindi a mantenere la fertilità perché

contribuisce alla maturazione degli spermatozoi nel testicolo. Inoltre, influenza qualità e

quantità dello sperma prodotto poiché opera sulle vie seminali e sulla prostata deputate alla

produzione di sperma. L’ormone FSH aumenta la risposta delle cellule di Leydig all’LH.

ASSE IPOTALAMO-IPOFISI-GONADI

Importantissimo nell’ovogenesi e nella spermatogenesi. Sotto lo stimolo dell’ipotalamo, l’ipofisi

produce due ormoni che sono l’LH (luteinizzante) e l’FSH (follicolo stimolante) che contribuiscono

entrambi a stimolare la spermatogenesi. L’LH va a stimolare direttamente le cellule del Leydig che

producono testosterone che va nel compartimento interno del tubulo seminifero a stimolare le

cellule del Sertoli. L’FSH va direttamente a stimolare le cellule del Sertoli che possiedono i recettori

specifici, in esse il testosterone che è arrivato viene trasformato in DIIDROTESTOSTERONE ed

ESTRADIOLO. Questi 2 ormoni viaggiano attraverso il sangue per arrivare poi all’ipotalamo creando

un feedback negativo alla produzione di FSH. Anche l’inibina svolge un feedback negativo.

La prima fase della meiosi è ormone indipendente, la seconda dipendente.

BARRIERA EMATO-TESTICOLARE

Presente nei tubuli seminiferi e formata dalle cellule del Sertoli. Presenta giunzioni occludenti e

impedisce il passaggio di molecole tra il compartimento basale e quello adluminare. Questo è

fondamentale perché gli spermatozoi vengono prodotti in pubertà e quindi si evita la produzione di

anticorpi anti-spermatozoi.

MATURAZIONE DEGLI SPERMATOZOI NELLE VIE SEMINALI

Per poter uscire dall’apparato maschile gli spermatozoi seguono un complesso sistema di canali che

comincia con l’EPIDIDIMO che è situato postero-lateralmente ad ogni testicolo. È formato da una

testa molto voluminosa, da un corpo e da una coda che si continua con il dotto deferente. Dopo che

lo spermatozoo ha avuto la sua maturazione morfologica completa il processo con un’ulteriore

maturazione (acquisizione mobilità) nell’epididimo. Nell’apparato genitale femminile avviene

invece la CAPACITAZIONE perché lo spermatozoo si troverà ad una temperatura più alta e quindi

tramite la reazione acrosomiale si attiverà e potrà fecondare. Il dotto deferente è lungo circa 30 cm

e funge da raccolta di spermatozoi maturi. Esistono poi le VESCICOLE O VESCICHETTE SEMINALI che

producono liquido seminale.

Nella meiosi sono coinvolti vari geni che se subissero mutazioni comprometterebbero la

spermatogenesi.

PRINCIPALI GENI COINVOLTI NELLA SPERMATOGENESI



Gene che codifica per il recettore degli androgeni Per una normale spermatogenesi ci sono i geni

che codificano per i recettori per gli androgeni che se subiscono mutazioni possono generare una

sindrome molto particolare che si chiama SEX REVERSE: non essendoci i recettori per gli androgeni

è come se non ci fossero androgeni e quindi il fenotipo della persona è femminile malgrado il

cariotipo sia XY maschile. 

Geni che veicolano la sostituzione degli istoni in protamine Garantiscono l’impacchettamento

della testa dello spermatozoo. 

Geni coinvolti nella formazione dell’acrosoma Gene SPATA coinvolto in una sindrome che porta

ad una totale infertilità: Globozoospermia = totale assenza di acrosoma con teste rotonde.

Sul cromosoma Y sono stati identificati locus responsabili della spermatogenesi, in particolare l’AZF:

se ci fosse una mutazione o una delezione in questa zona ci sarebbe un alto rischio che i pazienti

siano azoospermici. VIDEOLEZIONI 4,5



INFERTILITA’ MASCHILE Può avere 3 tipi di cause:

1. CAUSE P