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BIOTECNOLOGIE

01/10/2019

1889 Miescher scopre il DNA, attraverso i suoi esperimenti sul pus

1944 Avery, fornisce le prove che è il DNA a recare le informazioni genetiche che vengono trasmesse

1961….

La natura si oppone al trasferimento di materiale genetico, sono poche le cellule in grado di assumere spontaneamente

frammenti di DNA estraneo, forzando l’entrata di DNA estraneo, la cellula si difende usando enzimi che lo attaccano e

lo demoliscono, usa le nucleasi (Endonucleasi, che attaccano l’interno del filamento di DNA; esonucleasi che invece

demoliscono il DNA a partire dalle estremità). Se riuscissimo a inibire le nucleasi dovremmo comunque far esprimere il

frammento di DNA estraneo.

La tecnologia del DNA ricombinante ha risolto tutti questi problemi e ha fatto si che una cellula ospite potesse esprimere

DNA estraneo, cioè che non appartiene ad essa. La TDNAR può essere definita anche come l’isolamento e la

propagazione di molecole identiche di DNA all’interno di un organismo. Sono due i momenti che possiamo osservare:

1- Ricombinazione. Qui ottengo molecole di DNA ricombinante quando riesco a legare un frammento di DNA di

interesse, all’interno di un’altra molecola di DNA che viene definita come DNA vettore. Il complesso formato

dal gene inserito + il DNA vettore, formano quella che è la molecola di DNA ricombinante

2- Trasformazione o Trasfezione. Una volta formata la molecola di DNAR questa deve essere trasferita all’interno

di un ospite competente che permetta l’espressione del gene di nostro interesse.

Si parla di trasformazione quando si ha a che fare con i plasmidi, di trasfezione quando si utilizzano i virus per

favorire l’entrata del DNAR

Il mio gene mi permetterà di ottenere un prodotto proteico all’interno della cellula ospite. Il DNA vettore dovrà avere

almeno 3 caratteristiche fondamentali:

• Contenere un sito ORI, cioè un sito di origine della replicazione che gli permetta di replicarsi autonomamente

all’interno della cellula ospite

• Contenere siti che vengano riconosciuti da uno o più enzimi di restrizione (in modo da poter tagliare e inserire

il gene di interesse attraverso l’azione delle endonucleasi che vanno a tagliare il filamento di DNA, e

successivamente azione delle ligasi che riformano i legami)

• Contenere un marcatore (es. la resistenza ad un antibiotico) che mi permetterà di verificare l’avvenuta

ricombinazione e la trasformazione/trasfezione

VETTORI

(mettere magari la tabella delle slide)

Ci sono molteplici vettori di DNA e la scelta di uno o dell’altro dipende da fattori pratii quali: lunghezza del filamento di

DNA da inserire; fattori pratici quali la coltura della popolazione microbica da cui verrà poi recuperato il prodotto

proteico di interesse; i costi; i tempi; la resa ecc…

• Plasmidi. Sono in grado di reggere un filamento di DNA di lunghezza minore o uguale a 10kb, oltre questa quota

il plasmide diventa instabile e tende all’equilibrio perdendo frammenti di DNA fino a riottenere stabilità

• Fagi (batteriofagi, in particolare il batteriofago lambda) 5-20kb

• Cosmidi (plasmidi ingegnerizzati) 35-45kb

• BAC (cromosoma batterico artificiale) 75-300kb

• YAC (cromosoma artificiale di lievito) 100-1000kb

C’è dunque un progressivo aumento delle dimensioni del gene che possiamo inserire all’interno del DNA vettore e in

base alle nostre necessità si sceglie uno piuttosto che un altro. Importante tener conto anche della velocità di

replicazione e della resa che si ottiene con le diverse tipologie di vettore. Posso inserire un gene di 10kb anche in un

lievito (cellula eucariotica) invece di inserirlo in un batterio, però, le richieste per quanto riguarda il tipo di terreno, i

nutrienti, le tempistiche di replicazione sono molto più lunghi, mentre con i batteri invece utilizzando un semplice brodo

di coltura il giorno dopo abbiamo la provetta già torbida e pronta per l’estrazione del prodotto proteico di interesse, in

minor tempo e a costi inferiori.

o Plasmidi

Il primo plasmide usato è stato il pBR322. P sta per plasmide, BR sono le inziali dei ricercatori, mentre il numero indica

la serie del plasmide, cioè per arrivare a questo plasmide ci sono voluti più di 300 tentativi. È un plasmide che riesce ad

entrare nella cellula ospite però viene replicato poco e dunque quello che si raccoglie è poco.

Da pBR322 si è arrivati a pUC18, è un derivato di pBR322 ma a differenza di quest’ultimo è un plasmide ad alto numero

di copie, cioè il suo punto di origine funziona bene e si arriva fino anche a 500 copie per cellula ospite.

pUC18 contiene (mettere magari

l’immagine):

• Sito ori

• Marcatore, un gene che

conferisce resistenza all’ampicillina

• Sito polylinker. È una

sequenza breve nella quale sono stati

inseriti siti riconosciuti dagli enzimi di

restrizione, è inserito all’interno del

gene lac

lacZ codifica per la beta-galattossidasi,

l’enzima che scinde il lattosio in

glucosio e galattosio. Questo enzima

riconosce anche un substrato

artificiale, substrato rappresentato da

X-gal, una molecola solubile in acqua e

incolore formata da galattosio e indolo

legati insieme; quando X-gal viene

idrolizzato libera una molecola di galattosio e una di indolo. L’indolo liberato è sostituito in posizione 5 con un Br e in 4

con un Cl, grazie a queste sostituzioni, una volta idrolizzato, è in grado di dimerizzare formando un composto insolubile

che precipita, di colore blu/indaco.

Dunque, se la beta-galattossidasi funziona, le colonie di E. coli che codificano per questo enzima si coloreranno di blu.

Caso. Nel lacZ ci metto solo la parte azoto terminale della b-gal e in un’altra cellula inserisco l’altra metà, quella carbossi

terminale. N- terminale lo metto in un plasmide, C terminale in E. coli.

All’interno di lacZ ho la zona polylinker, se l’enzima di restrizione taglia qui avrò una interruzione del gene che codifica

per la b-gal e quindi questo non sarà funzionante. E coli produce la sua metà di enzima, ma il plasmide ricombinante

non sarà in grado di produrlo.

➔ Mancata idrolisi dell’indolo in assenza di b-galox

Voglio inserire all’interno di pUC18 un gene da esprimere, taglio e lo inserisco in mezzo a lacZ, se avrò espressione del

gene inserito allora non avrò b-galox funzionante e quindi le colonie rimangono incolori.

o Batteriofagi

Uso il batteriofago lambda, ha un DNA lungo 45kb, non tutto è necessario per la sua replicazione e quindi posso togliere

quello che non serve, l’importante è tenere le due estremità necessarie per la replicazione. il taglio lo faccio con EcoRI,

un enzima di restrizione, e successivamente faccio agire le ligasi che riformano i legami. Tolto quello che non è

necessario posso inserire fino a 15kb senza andare a influire sulla stabilità del materiale genetico, in particolare sulla

sua capacità di impacchettamento all’interno del capside virale.

Il batteriofago va ad infettare la cellula competente (E. coli), il DNA fagico si replica fino alla lisi della cellula batterica,

dalle placche di lisato batterico che si formano posso raccogliere il prodotto genico di interesse (in genere si trova al

centro della colonia perché sono le cellule batteriche più vecchie e che quindi hanno avuto il tempo di andare incontro

al ciclo vitale completo, fino alla lisi).

o Cosmidi

Posso inserire fino a 50kb. Si tratta di un vettore ibrido, metà plasmide e metà batteriofago. Presentano il gene cos

(gene del batteriofago lambda) inserito all’interno di un plasmide.

Contengono:

• Una origine

• Un marcatore

• Una regione polylinker. Per gli enzimi di restrizione

• Un gene cos. Conferisce una certa capacità di essere impacchettato come se fosse un genoma fagico all’interno

del capside. Ciò mi permette di infettare il batterio come se fossi nel caso normale del batteriofago lambda

Vantaggi:

1) Velocità di infezione del batteriofago, con tutta l’efficienza di infezione di un virus

2) Capacità replicativa del plasmide

3) Non c’è lisi della cellula ospite per via del numero elevato di copie

Cromosomi artificiali. Abbiamo detto che sono di due tipi: BAC e YAC. Con gli YAC uso cellule eucariote, ricorro a queste

e non ai procarioti perché i geni dei mammiferi in genere sono di dimensioni elevate, più di 100kb e quindi si rischierebbe

di avere un vettore instabile che si degrada se si usano BAC.

02/10/2019 o BAC

I BAC contengono il fattore F, i fattori F sono dei plasmidi che si replicano

L’origine ori della replicazione contiene un marcatore, resistenza al cloramfenicolo; contiene anche i siti riconosciuti

dagli enzimi di restrizione

I fattori F sono dei plasmidi che si replicano autonomamente e che trasferiscono informazioni genetiche durante la

coniugazione batterica. Possono portare fino a 1Mb di lunghezza ma sono stati modificati geneticamente per essere

vettori di DNA eucariotico e portare inserti fino a 300kbp.

Dai BAC si è passati anche agli YAC per poter esprimere il DNAr anche all’interno di cellule eucariotiche. La cellula di

lievito può essere coltivata facilmente e modificata quasi facilmente come un batterio inoltre, il loro genoma è stato

sequenziato e quindi ne conosciamo bene i geni. È un eucariote e dunque è in grado di apportare tutte quelle modifiche

post traduzionali tipiche delle cellule eucariote, una delle quali la glicosilazione.

Se avessi bisogno di una glicoproteina questa devo per forza produrla con gli YAC, perché le cellule batteriche non sono

in grado di glicosilare essendo assenti dell’apparato di Golgi.

Importante modifica post traduzionale è anche il ripiego della proteina lineare in una conformazione funzionale, le

cellule batteriche non sono in grado di fare le modifiche necessarie per avere una conformazione funzionale e

degradano velocemente le proteine non funzionanti.

I lieviti sono considerati microrganismi non pericolosi, al contrario dei batteri

o YAC

Yac contiene un centromero, due sequenze telomeriche che sono prossimali a due siti di restrizione riconosciuti

dall’enzima di restrizione BamHI (H primo), contiene un’origine di replicazione, e contiene inoltre 3 marcatori

selezionabili. Nasce come una molecola di DNA a doppio filamento circolare, ma in seguito all’intervento dell’enzima di

restrizione BamHI linearizza.

Contiene un ulteriore sito di restrizione che viene riconosciuto da SnaBI, l’intervento di questo enzima crea il varco

necessario per la ricombinazione. Cioè parto da molecola circolare, interviene BamHI che linearizza andando a tagliare

sui siti di restrizione (compresi tra le due sequenze telomeriche), BamHI va a tagliare la sequenza compresa tra i due siti

di restrizione liberando le estremità telomeriche. Successivamente va ad agire SnaBI che invece taglia all’interno del

marcatore SUP4, liberando la regione dentro la quale potrò andare a inserire il mio gene.

Dopo aver inserito anche la porzione di molecola di DNA di mio interesse, intervengono le ligasi che vanno a riformare

i legami, interrompendo il marcatore SUP4.

Inserisco poi questo cromosoma all’interno della cellula di lievito e ottengo le mie copie di prodotto genico

o Vettori shuttle

È un’ultima classe di vettori, si chiamano vettori navetta perché contengono due origini della replicazione, uno che è

attiva all’interno della cellula batterica e uno che invece viene riconosciuto dalla cellula eucariotica. Ciò significa che

possono funzionare in entrambe le tipologie di cellule e il vantaggio di questa cosa è che se voglio ottenere tante copie

del mio vettore di DNA lo inserisco in una cellula batterica e così ottengo tante copie in poco tempo; se poi il prodotto

genico necessita di specifiche modifiche post traduzionali allora prelevo la quantità elevata di vettore dai batteri e poi li

inserisco all’interno di cellule eucariote.

Avevamo visto che nel 1962 Arber fornì le prove dell’esistenza degli enzimi di restrizione, successivamente Nathans e

Smith li hanno usati per la caratterizzazione della sequenza di DNA.

Avevano visto che all’interno della cellula batterica il genoma dei virus veniva degradato, scoprendo che gli enzimi di

restrizione, delle endonucleasi, possono eliminare sequenze da 4 a 6 paia di basi alla volta. Hanno osservato che le

sequenze eliminate sono sequenze palindromiche (cioè lette nella stessa direzione hanno la stessa sequenza), questo

significa che le endonucleasi sono monomeri.

Tipi di taglio:

• Taglio pari, se avviene alla stessa altezza in entrambi i filamenti

• Sfalsato, quando avviene in due posizioni diverse. In questo modo si creano due brevi filamenti che vengono

detti estremità coesive, perché riconoscono per complementarietà il singolo filamento ottenuto con il taglio sul

filamento opposto della doppia elica,

Le estremità coesive sono più vantaggiose perché hanno una tendenza maggiore a riformare i legami e questo

mi aumenta l’efficienza di ricombinazione

Gli enzimi di restrizione prendono il nome dal ceppo batterico dal quale sono stati isolati, in genere si hanno le iniziali

del batterio, se si tratta di un ceppo speciale a questo nome segue una lettera maiuscola, se poi all’interno di questo

ceppo ci sono più enzimi troviamo anche un numero romano.

Le sequenze riconosciute da questi enzimi di restrizione sono sequenze molto corte e quindi statisticamente è molto

probabile che la stessa sequenza ci sia anche altrove dove non bisogna tagliare. Ma allora come fanno i batteri a

proteggere il DNA dall’azione delle nucleasi? Evolutivamente le sequenze nucleotidiche dei batteri sono metilate e

questo fa si che siano protette dall’azione delle nucleasi libere nel citoplasma insieme alla molecola di DNA.

Con la stessa endonucleasi posso tagliare sia il mio gene che la molecola vettore, in questo modo otterrò su entrambe

le molecole di DNA delle brevi sequenze a singolo filamento, complementari, che potranno riconoscersi e dare luogo

spontaneamente a ponti H. Il successivo intervento dell’enzima ligasi potrà saldare in maniera più efficace la molecola

ricombinante. (vedi immagini del taglio sfalsato con inserimento del gene nel vettore grazie all’azione della stessa

endonucleasi)

Ma siamo sempre così fortunati da avere il sito per le endonucleasi dove serve? Nel mio vettore si anche perché è

ingegnerizzato, ma nel mio gene i siti di taglio devono essere presenti in punto specifici, non posso tagliare in parti del

gene che sono necessari per avere una proteina completa.

Se non ho siti di restrizione adatti potrei non poter tagliare con lo stesso enzima sa gene che vettore, e potrei anche

non poter ottenere sempre delle estremità coesive. Per questi motivi posso pensare di inserire io stesso delle sequenze

che fungano da siti di restrizione, utilizzando la Desossinucleotidil transferasi, una polimerasi speciale perché aggiunge

sequenze nucleotidiche senza la presenza di uno stampo.

Una volta tagliato le estremità pari del mio gene, per trasformare in estremità coesive, aggiungo delle estremità di poliA

e poliT andando a formare le mie estremità complementari sui nei due filamenti; ho le estremità coesive e adesso si

può formare la molecola di DNA ricombinante.

Trasferimento della molecola all’interno della cellula ospite

Adesso il DNAR deve essere replicato, tradotto…devo quindi introdurlo all’interno della cellula ospite. Come faccio?

Posso avere la trasformazione oppure la trasfezione. Ho diverse metodologie per l’inserimento della mia molecola nella

cellula ospite, il metodo dipende anche dal tipo di cellula ospite se procariote o eucariote.

Procarioti:

• Trasformazione naturale. Alcune specie batteriche sono in grado di accettare da sole DNA estraneo, ad esempio

il Bacillus subtilis

• Posso sottoporre a shock termico in presenza di elevate concentrazioni di calcio. In queste condizioni la

permeabilità della membrana batterica viene parzialmente compromessa permettendo l’entrata del DNAr

• Elettroporazione. Compromissione parziale della membrana batterica attraverso scariche elettriche che

formano dei pori temporanei

• Utilizzo di batteriofagi

• Utilizzo di plasmidi coniugativi. Plasmidi contenenti il fattore F o fattore di coniugazione. In questo caso la cellula

donatrice che contiene il plasmide coniugativo, contatta la cellula ricevitrice attraverso i pili coniugativi ad

esempio

Eucarioti:

• Virus animali o vegetali. Utilizzando l’innata capacità di infezione dei virus

• Shock termico in presenza di elevate concentrazioni di calcio

• Elettroporazione

• Microiniezione. Questo è possibile grazie alle dimensioni più elevate rispetto alla cellula batterica. Al

microscopio, attraverso degli opportuni micromanipolatori, si possono iniettare le molecole di DNAr all’interno

della cellula eucariotica

• Agrobacterium tumefaciens. È un batterio che contiene un plasmide coniugativo che causa una malattia nella

pianta, cioè, quando questo batterio infetta il tessuto ferito di una pianta inietta nelle cellule vegetali il suo

plasmide coniugativo, causando il cosiddetto tumore del colletto. Da qui i ricercatori hanno modificato

geneticamente questo plasmide coniugativo, ottenendo un metodo utile per il trasferimento dei geni di

interesse all’interno delle cellule vegetali. È stata quindi rimossa la sequenza responsabile della malattia e al suo

posto è stato inserito il gene d’interesse.

Nelle cellule vegetali può essere rimossa in opportune condizioni la parete, ottenendo i protoplasmi, questi

accettano con più facilità le molecole di DNA estraneo grazie alla maggiore permeabilità, e dal protoplasma si

può facilmente rigenerare la c