Ovogenesi - Biotecnologie della riproduzione

MATURAZIONE DELL'OVOCITA

Un follicolo risulta dominante perché ha più recettori per FSH e quindi viene selezionato per portare a termine la maturazione. In una prima fase, tutti i follicoli non sono competenti per lo sviluppo embrionale e l'acquisizione della componente meiotica avviene in una fase successiva che prevede un'acquisizione di competenza da parte del nucleo ma anche del citoplasma.

Maturazione citoplasmatica: modificazioni all'interno della cellula (cambiamenti nella distribuzione e organizzazione degli organuli cellulari e cambiamento a livello molecolare) che porta l'ovocita fermo in profase I a diventare competente, permettendo quindi la successiva maturazione nucleare.

Uno degli aspetti più evidenti è la maturazione dei granuli corticali che nell'ovocita GV si trovano dispersi nel citoplasma ma durante la maturazione si dispongono lungo la parte più esterna della cellula uovo; dopo la fecondazione permettono la...

Riattivazione del metabolismo dell'ovocita. In particolare, quando l'ovocita è in metafase II i granuli corticali si trovano distribuiti su tutta la superficie tranne la zona dove si forma il fusomeiotico che è dove avverrà l'espulsione del globulo polare (nell'uomo invece i granuli si dispongono lungo tutta la superficie della cellula uovo). In questa fase, si ha anche la formazione del cappuccio di actina. Inoltre, si osserva la rottura della vescicola germinale e la migrazione del nucleo verso la superficie nonché l'organizzazione della placca metafasica. I microtubuli si organizzano intorno al nucleo; la loro organizzazione e polimerizzazione è promossa da centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) diversi dai centrosomi che mancano nella cellula uovo. Segue una progressiva rotazione della piastra metafasica e della regione interessata dal globulo polare: nell'uomo è disposta perpendicolarmente rispetto

alla superficie della cellula (fondamentale per l'attività dell'ovocita) mentre è parallela alla superficie nel topo. All'esterno, in corrispondenza della regione con i granuli, si trova una regione microvillare con delle estroflessioni della membrana della cellula che interviene nel contatto tra la membrana spermatozoo e cellula uovo. In questo modo, gli spermatozoi si adagiano sulla superficie dell'ovocita e un microvillo prende contatto con esso permettendo la fusione delle membrane e il successivo rilascio del nucleo dello spermatozoo. Per quanto riguarda l'apparato del Golgi, questo va via via scomparendo. Infine, nella fase iniziale di maturazione dell'ovocita i recettori e i canali per il calcio sono pochi e mano a mano che procede la maturazione citoplasmatica questi aumentano anche a livello del reticolo endoplasmatico. Quando lo spermatozoo si lega alla cellula uovo e poi vi penetra, si ha un'onda di calcio (che parte dal punto in

cui lo spermatozoo si è legato) che riattiva il metabolismo dell'ovocita.

Aspetti morfologici che possono essere valutati per capire se un ovocita può essere competente o meno:

• grandezza del cappuccio di actina che determina la grandezza del globulo polare espulso -> se il globulo polare è troppo grande, viene lasciato poco citoplasma all'ovocita, ma l'ovocita comunque non è competente anche se il globulo polare è troppo piccolo.
• Alterazioni ormonali possono portare alla perdita del cappuccio di actina, dando una divisione quasisimmetrica che può presentare un problema.
• orientamento della placca per selezionare gli ovociti con l'orientamento corretto.
• posizione della vescicola germinale: se è centrale e non laterale, l'ovocita è qualitativamente meno buono rispetto a quello con una vescicola periferica. Probabilmente, infatti, lo spostamento della piastra metafasica nel caso della vescicola centrale.

richiede più energia e dà piastra più grande che comporta la formazione di un globulo polare più grosso. 31/10/18 Maturazione nucleare Avviene soprattutto nella fase finale di maturazione del gamete quando viene ripresa la meiosi; interessa quindi i fully grown oocyte, ossia quelli che hanno completato la maturazione citoplasmatica. Consiste in una modifica della cromatina dallo stato di diplotene, quando si ha la vescicola germinale, allo stadio di metafase II e nell'accumulo di sostanze (mRNA, tRNA, rRNA, ecc, ossia le istruzioni molecolari) che permettono all'embrione di essere autosufficiente prima della capacità dell'embrione stesso di produrre in modo autonomo e indipendente delle informazioni per sopravvivere, cioè fino al MAT (Maternal Ebryonic Transition, passaggio da regolazione materna a regolazione embrionale). Nella prima fase dello sviluppo della cellula uovo ma anche nello zigote, tutto quello che richiede energiaLa sintesi proteica avviene ad opera di organelli già presenti nella cellula uovo e quindi di origine materna. Una volta che avviene la fecondazione, inoltre, è importante che le stesse componenti citoscheletriche che prima promuovevano una divisione asimmetrica, favoriscano una divisione simmetrica che è fondamentale perché l'embrione vada avanti nello sviluppo. Questo perché nelle prime fasi dello sviluppo, l'ovocita non va incontro ad un aumento del citoplasma ma il citoplasma che già c'è viene suddiviso nei blastomeri; la ripresa della duplicazione degli organelli avviene solo nella fase di blastocisti. Interessante è l'andamento della metilazione del DNA nell'ovocita e nelle prime fasi della fecondazione: tutto il DNA viene completamente metilato fino allo stadio di zigote e poi si ha una progressiva fase di demetilazione che sarà diversa a seconda del genoma (se materno o paterno). Infatti, il genoma

paternodemetila più velocemente. Intorno alle 2 cellule si ha quasi una totale demetilazione di tutto il DNA perché poi si attiva una nuova ondata di metilazione a seconda dei geni che devono essere silenziati.

Per quanto riguarda il profilo di trascrizione, inizialmente si ha una trascrizione di derivazione materna e via via la quantità di mRNA materno cala progressivamente in favore di una graduale transizione dallatrascrizione puramente di origine materna a utilizzo dei trascritti di origine embrionale.

L'attivazione del genoma embrionale, in particolare, avviene a 2 cellule per il topo e a 4-8 cellule nell'uomo (attivazione embrionale più tardiva). Quest'attivazione è importante per la sopravvivenza dell'embrione: se il genoma non si attiva completamente, l'embrione che non ha più mRNA materni (usati e/o degradati) va incontro a morte. Si è infatti visto che nel topo molti embrioni non superano le 2 cellule.

Perché non riescono ad attivare il genoma: questo blocco è definito blocco al 2 cellule. Il passaggio di questo blocco è utile per selezionare gli embrioni da impiantare! C'è tutto un momento in cui i due genomi di diversa origine rimangono separati; solo in un secondo momento si fondono.

La maturazione nucleare avviene 10-12 ore prima dell'ovulazione attraverso:

• rottura dell'involucro nucleare della vescicola
• condensazione cromosomi
• formazione fuso per metafasi I
• separazione degli omologhi
• emissione del primo globulo polare
• arresto alla metafase II

Tutti questi aspetti prevedono anche una maturazione citoplasmatica che permette la migrazione della componente microtubulare legata alla formazione del fuso. Da un punto di vista molecolare, ciò che permette questa transizione è l'eliminazione di certe inibizioni, ossia l'attivazione di diversi fattori di trascrizione che portano alla riacquisizione della componente meiotica.

Gli

ovociti vengono bloccati in profase I grazie ad un blocco mediato dalle cellule follicolari (cellule della granulosa e cellule del cumulo ooforo) perché mantengono alto nell'ovocita cAMP che inibisce il fattore cdc25 che promuove la maturazione dell'ovocita. Quando l'ormone LH si lega al proprio recettore sulle cellule della granulosa, vengono rilasciati dei fattori di crescita (AREG e EREG) che si legano al recettore EGFR sulle cellule del cumulo. Questo promuove la fosforilazione della connexina 43 (CX43) che forma le GAP junction tra le cellule del cumulo e quelle della granulosa e tra le cellule del cumulo e l'ovocita, portando ad una rottura di queste giunzioni. Il distacco porta a diminuire i valori di cAMP all'interno dell'ovocita poiché si attiva un fattore che degrada cAMP e di conseguenza il fattore cdc25, il cui ingresso nel nucleo era prima inibito dall'alta concentrazione di cAMP, entra nel nucleo e agisce come fattore di

La trascrizione attiva il fattore MPF (Maturation Promoting Factor) responsabile della maturazione del gamete. L'attivazione di MPF avviene per eliminazione di un gruppo fosfato dalla proteina in quanto cdc25 ha un'attività fosfatasica. Quindi, gli oociti fully grown possiedono "stockpile" di pre-MPF che sono formati da cdc2 legato ad una ciclina; il primo viene fosforilato doppiamente da una chinasi attivata dall'alta concentrazione di cAMP, rendendo quindi il fattore inattivo. L'attività fosfatasica di cdc25 invece ripristina l'attività di MPF.

In particolare, MPF aumenta quando si ha la ripresa della meiosi ma poi diminuisce dopo l'espulsione del primo globulo polare per bloccare il ciclo in metafase II. Si rialza nuovamente quando, dopo fecondazione, la meiosi riprende ma poi diminuisce ulteriormente. Un nuovo picco si osserva successivamente per favorire la mitosi in seguito alla fertilizzazione.

molecolareTrascrizioneIn un ovocita GV fully grown che ha completato la trascrizione, accumulando tutte le sostanze necessarieallo sviluppo embrionale, la trascrizione diminuisce a livelli appena rilevabili e si ha il passaggio da GV aGVBD (rottura della vescicola). Se a questo punto l'ovocita non ha accumulato tutte le sostanze necessarie(storage del programma materno terminato) per lo sviluppo embrionale, arriva ad un punto in cui non è piùin grado di compensare la crescita embrionale e questo porta alla morte dell'embrione.Gli RNA accumulati sono molto stabili perché hanno code poliA;alcuni di questi mRNA vengono usati ma alcuni degradati perchésono stati prodotti in eccesso.La trascrizione, quindi, subisce una graduale diminuzione dellatrascrizione fino a diventare nulla tra metafase II e zigote mentrela trascrizione embrionale aumenta nel passaggio da stadio a 1cellula a stadio a 2 cellule. Ci sono vari fattori che permettono ladegradazione

della coda di poli-A su mRNA materni perdegradarli e che permettono l'attivazione di RNA embrionali per la traduzione di proteine. L'assenza di qu