Ovogenesi - Biotecnologie della riproduzione

Maturazione e differenziamento del gamete femminile

Oogenesi

Oogenesi: processo che comprende tutti i cambiamenti che subisce l'oocita per diventare una cellula uovo. È quindi il processo che porta al differenziamento completo delle cellule germinali in oociti.

Follicologenesi

Follicologenesi: la maturazione del gamete femminile è in stretto rapporto con quella che è la componente somatica che si associa al gamete in una struttura particolare detta follicolo. Nel complesso sono previste tre tappe fondamentali:

• Inizio: formazione dei follicoli primordiali che racchiudono la cellula uovo (ovociti primari) che maturerà nel tempo. La maturazione di questa struttura avviene durante l'età fetale ed è accompagnata dalla maturazione nucleare dell'oocita, ma poi subisce un arresto
• Arresto: blocco fino alla pubertà
• Follicologenesi: ripresa della maturazione di un gruppetto di follicoli. La maturazione del gamete femminile avviene in concomitanza con la maturazione del follicolo.

Differenze tra spermatogenesi e oogenesi

Inizialmente, entrambe le vie di differenziamento partono dalla crescita e dalla maturazione di una cellula con caratteristiche staminali che subisce prima un processo di mitosi e poi, a seguito di divisioni asimmetriche, la cellula gametica inizia il processo di meiosi. Nel caso della spermatogenesi, la prima cellula a iniziare la divisione meiotica è lo spermatocita primario, mentre nell'oogenesi prende il nome di oocita primario. Questo dà origine a due cellule: una molto grande detta oocita secondario e una cellula molto più piccola detta globulo polare che contiene un piccolo volume di citoplasma e metà del corredo genetico dell'oocita primario.

L'oocita secondario continua il processo di differenziamento e maturazione, mentre il globulo polare degenera. Si ha, quindi, una divisione meiotica asimmetrica rispetto al piano di divisione spaziale (che risulta essere non equatoriale), dando cellule di dimensioni diverse. Lo scopo è quello di dividere il corredo cromosomico in modo da ottenere cellule aploidi ma contemporaneamente avere una sola cellula che continuerà il processo di meiosi.

La divisione asimmetrica nella spermatogenesi invece è in fase mitotica e riguarda differenze di tipo funzionale (cellula che ricostituisce il pool di staminali e cellula che va in meiosi). Anche il globulo polare a volte si divide, ma è raro perché solitamente la cellula degenera prima in quanto non ha ulteriori funzioni se non quelle di eliminare metà corredo genetico. Spesso, i globuli polari sono usati quindi come marker per capire quando l'oocita ha fatto la prima divisione meiotica.

Dopo due divisioni asimmetriche, si ottiene così un singolo ovocita (a differenza dei quattro spermatidi nella spermatogenesi) che va incontro a un processo di maturazione, ossia di riorganizzazione delle componenti citoplasmatiche. Non si ha però un cambiamento notevole nella morfologia al contrario degli spermatozoi.

Lo scopo della divisione asimmetrica è quello di accumulare materiale in modo da permettere all'oocita di avere ciò che gli serve per lo sviluppo dell'embrione durante le prime fasi, ossia prima dell'impianto nell'utero. Se accumulo poco citoplasma per via della divisione scorretta, l'embrione non riesce a sopravvivere perché non può procurarsi i nutrienti.

Dal punto di vista genetico, ovvero per quanto riguarda la ricombinazione genica, entrambi i processi avvengono nello stesso modo ma in tempi diversi. L'oocita, infatti, ha già intrapreso la divisione meiotica (fermi alla profase della 1^a divisione meiotica già fatto il crossing-over) a livello fetale e alla nascita non ho più la componente staminale.

La cellula uovo, quindi, è tipicamente una cellula molto grande indipendentemente dalla specie da cui proviene. Nell'uomo le cellule somatiche hanno un diametro di circa 10-15 micron mentre gli oociti umani arrivano fino a 100 micron.

Sviluppo delle gonadi femminili

Lo sviluppo delle gonadi femminili avviene circa all'8^a settimana di gestazione (sono riconoscibili dalla 10^a) ed è dovuto al movimento di cellule che dall'allantoide arrivano a livello delle creste genitali primordiali grazie alla formazione di cordoni che vanno a formare un ovario primitivo che poi si differenzia e va a formare tutte le sue componenti.

A livello già dell'ovario primitivo si ha un differenziamento tra la parte corticale (esterna) e quella midollare (con vasi sanguinei). Alla nona settimana di gestazione, i cordoni sessuali primordiali degenerano in ammassi irregolari che scompaiono nella parte midollare della gonade stessa lasciando posto a un tessuto connettivale lasso nel quale si sviluppano numerosi vasi sanguigni.

A livello della superficie della gonade (parte corticale) si formano i cordoni sessuali corticali di Valentin-Pfluger nei quali si insinuano i gonociti primordiali (cellule germinali ancora indifferenziate). A questo punto, i cordoni corticali si dividono in gruppi che poi vanno a circondare le cellule germinali e a formare i follicoli.

A livello del follicolo, dunque, possiamo avere diversi strati di cellule somatiche che circondano il gamete. Ogni strato ha una derivazione embrionale diversa. Gli strati più vicini all'ovocita sono formati da cellule della granulosa e si differenziano dalle cellule dei cordoni sessuali epiteliali. Dalle cellule mesenchimali dell'ovario si formano, invece, le cellule della teca che sono le cellule degli strati più esterni. La formazione di questi strati, che avvengono in diversi stadi della maturazione follicolare, porta alla formazione del follicolo vero e proprio.

Le cellule follicolari hanno un ruolo chiave per la corretta maturazione del gamete; infatti, instaurano una comunicazione bidirezionale tra cellule somatiche e gamete per il passaggio di fattori di trascrizione e fattori ormonali che permettono la corretta maturazione.

Alla 15^a settimana di gestazione, si vedono i primi follicoli primordiali costituiti da un ovogonio di piccole dimensioni (10 micron) circondato da cellule follicolari appiattite provenienti dai cordoni corticali. Segue il differenziamento dell'ovogonio in ovocita di primo ordine che inizia la meiosi I ma si blocca alla fine della profase nello stadio di diplotene che permane fino alla pubertà quando si ha la ripresa della divisione meiotica.

Fino alla maturità sessuale di un individuo, le cellule germinali primordiali nella gonade maschile sono ferme in G1, mentre in quella femminile sono bloccate in profase della meiosi I. Questa ripresa è ciclica nel senso che un gruppetto alla volta comincia la maturazione e alla fine di questo processo ne comincia un altro. Con la gestazione si ha il blocco del ciclo ovarico fino alla fine della gravidanza.

Alla fine del settimo mese ci saranno qualche milione di follicoli primordiali. Nel coniglio e nel criceto alla nascita si hanno oogoni e tutta la maturazione avviene successivamente, ma nella maggior parte dei mammiferi, alla nascita si hanno ovari che contengono oocita primario, ossia cellule che hanno già intrapreso la 1^a divisione meiotica (ma bloccate in profase I).

Inoltre, per la maggior parte dei mammiferi l'ovulazione avviene al completamento della divisione meiotica I (dopo l'emissione del primo globulo polare). La fecondazione è spesso essenziale per il completamento della seconda divisione meiotica (senza la fecondazione la divisione si blocca in metafase II e quindi non ho l'emissione del secondo globulo polare).

Morfologia ovario

L'ovario ha una struttura irregolare con protuberanze in cui è contenuta la cellula uovo ai diversi gradi di maturazione. Negli uccelli, l'ovario assume forme ancora più irregolari e dentro ogni protuberanza è contenuto un uovo. L'uovo maturo (con il guscio) viene espulso e il guscio serve per proteggere e dare nutrimento (stessa funzione dell'utero).

Nei mammiferi, invece, l'ovario è più tondeggiante ma con gibbosità che diventano più grandi quando si sta completando la maturazione della cellula uovo. Con una siringa si può prelevare l'ovulo dai follicoli più grossi per l'inseminazione artificiale. Dopo l'ovulazione, la struttura è più lineare perché non c'è più l'ovulo.

Man mano che i follicoli maturano, si spostano verso la regione corticale dell'ovario in modo da favorire l'ovulazione. Nel follicolo che ha ovulato (senza cellula uovo che è stata "espulsa") si trova anche una struttura più compatta che è detta corpo luteo ed è costituita da ciò che rimane del follicolo dopo il processo ovulativo. Esso ha il compito di bloccare il ciclo ovarico in quel follicolo e quindi dà il tempo all'ovulo espulso di essere fecondato. Tuttavia, se la fecondazione non avviene, il corpo luteo degenera e il ciclo ovarico può ricominciare.

Nell'ovario, quindi, posso osservare diverse fasi di maturazione del follicolo e le posso distinguere.

Esempio: Ovario neonatale si avrà la componente follicolare che è costituita da follicoli primordiali molto piccoli e nessun follicolo che matura.

L'ovario è un organo pari dalla forma a mandorla con dimensioni di 3 x 1,5-2 cm (uomo). Si trova nel legamento largo dell'utero ed è collegato all'utero attraverso un peduncolo detto mesovario. Al suo interno, distinguiamo:

• Epitelio germinativo che deriva dal peritoneo ma non contiene nulla di staminale
• La tonaca albuginea, una capsula di connettivo fibroso denso e fibre di collagene con distribuzione parallela lungo tutta la lunghezza dell'organo. È poco vascolarizzata

Inoltre, si possono individuare due zone:

• Midollare: zona centrale dell'organo altamente vascolarizzata e innervata. È formata da un tessuto fibroelastico (fibroblasti circondati da collagene e fibre elastiche) e da cellule epiteliodi (suddivise in interstiziali, ossia ammassi di cellule nella fase premestruale che secernono estrogeni, e cellule dell'ilo, che secernono androgeni).
• Corticale: zona esterna di connettivo con supporto ai follicoli. Contiene quindi follicoli ovarici e cellule stromali (simili ai fibroblasti).

Le due parti sono ben distinguibili in fase prenatale ma poco distinguibili dopo la pubertà per via dei follicoli in differenziamento: i follicoli più grandi sono all'esterno vicino all'ampolla che raccoglie gli oociti ovulati e li immette nella tuba, mentre nella parte centrale ci sono quelli più piccoli che andranno in seguito incontro al ciclo di maturazione.

Nel momento dell'ovulazione, l'ovario è più gonfio e più vascolarizzato. Man mano che si procede con la follicologenesi, cambiano le cellule che circondano l'oocita e anche le sue dimensioni.

Tutti gli ovociti che ci sono alla nascita di un individuo sono quelli a disposizione per tutto il resto della vita. Il picco massimo di ovociti (7 milioni) si raggiunge a 5 mesi dal concepimento. Tuttavia, alla nascita ne rimangono solo 1 milione a causa di un'apoptosi massiccia dovuta ad atresia follicolare (processo di degenerazione dei follicoli). Successivamente il numero diminuisce ancora perché molte cellule vanno incontro ad apoptosi e vengono eliminate. Quelli che rimangono intraprendono il processo di maturazione a gruppi di 10 e solo uno tra i 10 raggiunge la maturazione finale, per cui si ha un'ulteriore perdita di cellule; rimangono così solo circa 300/500 oociti disponibili per la fecondazione. Questo avviene per far sì che il follicolo che viene poi ovulato abbia lo spazio sufficiente per espandere il proprio citoplasma.

Inoltre, quando il corpo luteo degenera, rimane comunque una parte che forma una sorta di cicatrice che rimane a livello dell'ovario ed elimina parte dello spazio che gli altri follicoli richiedono per espandere la superficie. Dunque, anche per questo motivo è impossibile che avvenga la maturazione di più di un follicolo alla volta.

Infine, bisogna considerare che meno del 0,1% di tutta la popolazione degli oociti viene ovulata.

Ciclo ovarico

Periodo che intercorre tra due ovulazioni successive. Negli individui che hanno il ciclo mestruale, in pratica il ciclo ovarico è il periodo tra due mestruazioni successive e l'ovulazione avviene a metà di questo ciclo. Si distinguono tre fasi:

• Fase follicolare: di durata variabile e dipende dal destino del follicolo, per cui alcuni iniziano prima, mentre altri rimangono bloccati per anni. È il momento che va dal reclutamento dei follicoli primordiali alla loro maturazione. Si ha l'accrescimento finale del follicolo, il completamento della prima divisione meiotica (da diplotene di meiosi 1 a metafase di meiosi 2), il distacco del cumulo ooforo e l'uscita del COC (complesso ovocita-cumulo ovarico). In questa fase vengono prodotti estrogeni. Infatti, bassi livelli di ormoni prodotti dall'ipofisi mantengono i follicoli immaturi, mentre l'aumento di ormoni causa la maturazione del follicolo e poi l'ovulazione del COC. Il follicolo crescendo diventa esso stesso produttore di ormoni e quindi i livelli di estrogeni aumentano ulteriormente.
• Fase ovulatoria: durata precisa di circa 15 ore (avviene intorno al 14^o giorno di un ciclo da 28) ed è stimolata dal picco ormonale di LH che coincide (ed è stimolato) da un picco di estrogeni che si ha quando il follicolo è maturo. Solo gli oociti con un gran numero di recettori per questi ormoni proseguono la maturazione; si parla di selezione del follicolo dominante. La parete del follicolo si rompe e rilascia il suo contenuto (compreso l'ovocita ma anche il cumulo ooforo) all'interno della cavità peritoneale. In seguito all'ovulazione si ha la ripresa della meiosi II.
• Fase luteinica: dura circa 14 giorni. In seguito all'ovulazione, nell'ovario rimane una struttura cellulare a funzione endocrina definita corpo luteo, che produce progesterone, preparando l'utero per un'eventuale gravidanza, e blocca il ciclo ovarico. Se avviene la fecondazione, questa struttura rimane attiva grazie a prolattina (prodotta dall'ipofisi) e HCG (prodotta dal trofoblasto, monostrato di cellule esterne della blastocisti) e continua a produrre progesterone fino al secondo mese di gravidanza quando viene sostituito in quest'attività dalla placenta stessa. Se non ho fecondazione, invece, il corpo luteo non riceve HCG e quindi degenera nel corpus albicans, che rimane come una cicatrice sulla superficie dell'ovario (dopo mesi inizia la sua graduale scomparsa). Questo determina la ripresa del ciclo ovarico (poiché la diminuzione dei livelli di estrogeni e progesterone stimola il rilascio dell'ormone stimolante il rilascio di gonadotropine a livello ipotalamico, che stimola a sua volta il rilascio di FSH e LH) e la comparsa delle mestruazioni poiché diminuiscono i livelli di estrogeni e quindi si ha lo sfaldamento dell'endometrio.

Le mestruazioni continuano finché un nuovo gruppo di follicoli non raggiunge la maturazione tale da produrre nuovamente alti livelli di estrogeni.

Fase follicolare: tipi di follicoli

Follicolo primario: deriva dalla maturazione del follicolo primordiale (costituito dall'ovocita circondato da un semplice strato di cellule follicolari squamose). Nel follicolo primario, le cellule follicolari aumentano di dimensione e si dividono numerose volte formando uno strato più spesso intorno all'ovocita che è grande 10-20 micron e possiede un nucleo con cromatina lassa.

Man mano che lo strato di cellule follicolari aumenta si crea uno spazio tra l'ovocita e lo strato follicolare più interno detto zona pellucida che è una membrana glicoproteica (glicoproteine solforate) e di proteoglicani acidi che circonda la cellula uovo in accrescimento. Questa si trova negli ovociti in accrescimento e negli ovociti ovulati per selezionare gli spermatozoi più vitali ma rimarrà a circondare anche gli embrioni fino all'impianto in modo da mantenerlo compatto poiché all'inizio le cellule sono piuttosto separate con contorni definiti e poche giunzioni cellulari. Un'altra funzione della zona pellucida è quella di bloccare la polispermia poiché, dopo che uno spermatozoo ha fecondato l'ovulo, blocca l'accesso a tutti gli altri spermatozoi.

La zona pellucida è costituita da glicoproteine ZP, di quattro tipi nell'uomo (da 1 a 4). Queste proteine hanno recettori specifici che legano le membrane degli spermatozoi, inducendone la capacitazione (e dunque l'induzione dell'esocitosi della vescicola acrosomale):

• ZP3 e ZP4 servono per il legame primario
• ZP2 per il legame secondario
• ZP1 ha un ruolo strutturale

Fino alla pubertà si hanno solo oociti primari. Poi dopo, con l'inizio della pubertà, possiamo trovare quelli che sono definiti i follicoli primari multilamellari ovvero follicoli con più strati di cellule follicolari che sono in attiva proliferazione per mantenere un numero di strati necessario per proteggere la cellula uovo che sta crescendo (20-30 micron). In questi follicoli si osservano poi all'esterno le cellule follicolari della teca che costituiscono il tessuto connettivo che circonda il follicolo. Internamente si trova la zona granulosa costituita da cellule follicolari che proliferano e formano uno spesso strato che secerne estrogeni.

Un follicolo si può quindi definire un piccolo organo poiché ha diversi strati cellulari che compongono e caratterizzano l'organo. Nonostante diversi follicoli primordiali maturano nei follicoli primari, solo pochi follicoli primari maturano nei follicoli secondari, situati in profondità nella corticale. La trasformazione inizia quando le cellule follicolari dello strato più interno cominciano a rilasciare il fluido follicolare che si accumula in tasche (cavità antrale) che gradualmente aumentano di dimensioni e separano lo strato follicolare esterno da quello interno. Questo processo continua... (testo originale si interrompe qui)