Spermatogenesi - biotecnologie della riproduzione

Studio del gamete maschile

Per lo studio del gamete maschile si usano tecniche che danno informazioni di tipo probabilistico, cioè si può stabilire se la percentuale di cellule sane rispetto a quelle con anomalie risulta nella norma o bisogna attuare dei comportamenti per favorire la fecondazione.

Si cerca di usare tecniche il meno invasive possibile e che permettano alla cellula di mantenere la propria vitalità. Questo, comunque, è difficile perché gli spermatozoi sono molto modificati dal punto di vista morfologico rispetto alle staminali e lo studio a livello molecolare risulta difficile. Per cui, mi accorgo di anomalie solo se si manifestano a livello morfologico.

Parametri morfologici per definire uno spermatozoo normale (morfologicamente adatto a fecondare):

• Testa: ha una forma precisa che differisce in base alla specie. È ovale per l'uomo e ad uncino per il topo.
• Acrosoma: 40-70% della testa
• Larghezza testa: 2,5-3,5 micron
• Altezza testa: 4-5 micron

collo: 6-10 micron- lunghezza coda: 45 micrometri

Anomalie che rendono difficile la fecondazione sono classificate in base alla posizione:

• acrosoma: le anomalie legate all'acrosoma possono intaccare l'attraversamento da parte dello spermatozoo degli strati di cellule follicolari e della zona pellucida.
• acrosoma troppo grande (>70%)
• acrosoma troppo piccolo
• acrosoma assente
• acrosoma vacuolizzato: all'interno sono presenti vacuoli che indicano una non completa aggregazione delle vescicole pro acrosomiali.
• collo:
• ispessimento per alterazione della disposizione dei mitocondri (generalmente posti a spirale) -> alterata energia da cui consegue un'alterata motilità
• presenza di un residuo citoplasmatico che è segno di uno spermatozoo immaturo (lo spermatozoo dovrebbe perdere il citoplasma nell'epididimo). La goccia impedisce il corretto movimento perché la cellula non è

“aerodinamica”.

• flagello staccato: può essere un’anomalia strutturale dello spermatozoo ma spesso accade per sbaglio quando si fa lo striscio per analizzarli a causa di uno stress meccanico. E’ quindi necessario che la tecnica venga eseguita da un operatore abile per non creare un artefatto e spesso due persone in contemporanea lavorano sullo stesso campione in doppio cieco per avere risultati più standard.

- testa: anomalie che danno problemi soprattutto del movimento

• testa tonda o spermatozoi macrocefali: testa più grande
• testa allungata o spermatozoi microcefali: testa più piccola
• doppia testa
• testa piegata o a martello: inserzione non corretta della testa

- coda: anche in questo caso bisogna fare attenzione ad errori dell’operatore che potrebbero sfalsare il risultato.

• doppia
• arrotolata
• spezzata
• tronca

Fino al 10% di anomalie è considerato un valore normale. Infatti, la

spermatogenesi è un processo quantitativo che ad ogni eiaculazione porta alla fuoriuscita di milioni di spermatozoi per cui è normale avere delle anomalie ("la legge dei grandi numeri"). Al di sopra di questo valore, però, si ha una diminuzione dell'efficienza della fecondazione. Se un individuo con alterazione morfologica degli spermatozoi si sottopone a tecniche di fecondazione assistita, risulta fondamentale l'andare a prelevare spermatozoi funzionali. Inoltre, si vanno a ricercare anche le cellule ematopoietiche: se sono presenti in numero eccessivo, possono essere segno di un'infezione in atto. Analisi dell'acrosoma Se in una prima analisi morfologica si evidenziano delle alterazioni della testa/acrosoma, si passa a una più dettagliata analisi. L'assenza dell'acrosoma (agenesia acrosomale) può essere evidenziata: - con ab specifici per la proacrosina (proteina specifica dell'acrosoma) - analisi

superficiale al microscopio ottico o dettagliata al microscopio elettronico. In quest’ultimo caso capisco anche a che livello si ha l’alterazione dell’acrosoma. Questa malformazione potrebbe essere dovuta ad alterazioni del citoscheletro (componente fondamentale per il processo di migrazione degli elementi del gamete non ancora matura) che comporta una prematura migrazione del Golgi.

La agenesia acrosomale rende incapace lo spermatozoo di fecondare la cellula uovo ma, grazie a ICSI, può comunque originare l’embrione, anche se la resa è bassa.

Analisi della coda

La coda può essere analizzata al microscopio elettronico che permette di vedere la struttura interna del flagello (in teoria assonema ordinato). Alterazioni possono essere l’assenza bracci di dineina, presenza del segmento di connessione e l’assenza dei microtubuli centrali.

Inoltre, possono essere evidenziate delle alterazioni del segmento principale, come la presenza di

materialeelettrondenso disposto irregolarmente a dare un rivestimento fibroso.

Difetti della coda impediscono la fecondazione naturale, ma anche in questo caso gli spermatozoi possono essere usati con ICSI. Utilizzare questo tipo di spermatozoi però aumenta il rischio di trasferimento del difetto genico.

Non è tuttavia un esame di routine perché utilizza tecniche costose attuabili solo in pochi centri con sufficiente esperienza (microscopia elettronica).

Analisi del liquido seminale

Serve per evidenziare alterazioni della morfologia della cellula o la presenza di cellule diverse.

Ad esempio, la presenza di corpi apoptotici nel liquido seminale è indice di una perdita troppo abbondante di spermatozoi per eccessiva apoptosi. Oppure può essere dovuto a una non attività delle cellule del Sertoli, preposte a fagocitare le cellule apoptotiche.

Inoltre, la presenza di cellule ematopoietiche è segno di un'infezione in corso.

Analisi della cromatina

Tecnica TUNELE’ una tecnica che serve ad analizzare il numero di rotture presenti sul DNA. Questo fornisce un’indicazione del grado di frammentazione dell'acromatina che può essere dovuto ad un evento casuale che ha colpito il campione nei due mesi precedenti il prelievo (poiché la spermatogenesi dura circa due mesi).

Le cellule vengono marcate con un fluorocromo che si legherà alle porzioni singolo filamento (dove il dsDNA si è rotto). Le cellule con dei frammenti al livello cromatinico risulteranno, quindi, fluorescenti.

L'analisi può essere fatta in microscopia a fluorescenza. In questo caso, un esempio di protocollo potrebbe essere:

1. Preparazione delle cellule su vetrino (2 vetrini per campione in modo da analizzare un numero sufficiente di cellule)
2. Fissazione in etanolo assoluto
3. Permeabilizzazione in sodio citrato 0,1% + triton 0,1% per facilitare la permeazione del colorante
4. Preparazione dei campioni per controllo positivo (dove sono...

indotte rotture grazie a DNAasi I) e campioni per controllo negativo (dove si è certi che non ci sia il danno) - marcatura con nucleotide marcato e il suo enzima - valutazione tramite microscopio a fluorescenza 400x e conteggio di almeno 400 spermatozoi per vetrino (per ottenere un dato solido da un punto di vista statistico) con successivo calcolo della percentuale di spermatozoi con fluorescenza verde). L'analisi può essere fatta anche in citofluorimetria che permette di ottenere un grafico con picchi che riporta il grado di fluorescenza in rapporto al numero di cellule con quel parametro (immagine a sinistra). Il protocollo risulta abbastanza simile ma il processo di fissazione avviene in formaldeide. Inoltre, dopo il processo di marcatura bisogna: - risospendere in soluzione - acquisizione di un totale di 10000 cellule per campione al citofluorimetro equipaggiato con laser a 488 nm e filtri per fluorescenza verde (540 nm) e rossa (610 nm). - analisi tramite software per calcolare la

percentuale di spermatozoi confluorescenza verde

Analisi molto veloce perché automatica e si diminuisce il rischio di errore da parte dell'operatore.

Saggio Comet il campione viene messo su un gel di agarosio su un vetrino e le cellule vengono lisate. Dopodiché, si fa partire il campo elettrico e, se ci sono frammenti, questi cominceranno a migrare con una velocità differente in base alla grandezza del frammento. Si otterrà una coda "cometa" tanto più lunga, quanto più numerosi sono i frammenti (la fluorescenza e la lunghezza della coda sono proporzionali al numero di rotture presenti nell'elica).

Il protocollo, nel dettaglio, prevede:

• isolamento e inclusione delle cellule su vetrini contenti agarosio low melting
• lisi fredda (pH 10) in soluzione di 2,5 NaCl2, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton, 10% DMSO e poitrattamento con proteinasi K
• elettroforesi a 25 V e 300 mA sodio citrato 0,1% + triton 0,1%
• colorazione con

etidiobromuroL'osservazione viene fatta in microscopia a fluorescenza utilizzando un obiettivo 400x con filtro disbarramento 490 nm e di eccitazione 530 nm.

Nell'analisi si considera:

• lunghezza della testa e della coda della cometa: dà un'indicazione sulla dimensione dei frammenti
• area della cometa: dà un'indicazione di quanto il DNA sia frammentato
• % di fluorescenza totale
• % di fluorescenza rimasta nella testa
• % fluorescenza migrata nella coda
• tail moment: misura che mette in relazione le informazioni della fluorescenza legata alla testa e della fluorescenza legata alla coda e la percentuale di DNA contenuto nella coda.

È una tecnica molto utile per osservare frammenti di DNA ma è usata solo per studi sulla fecondazione, non come esame di routine.

Tecnica del SCSA (= Sperm Chromatin Structure Assay)

Tecnica aspecifica per l'analisi della cromatina negli spermatozoi che valuta la suscettibilità del DNA alladenaturazione.

rivelando quindi in maniera indiretta, la possibile presenza di rotture a singola elica o difetti di protaminazione. Per questa tecnica, si utilizza un colorante (arancio di acridina) che cambia colore se sono presenti alterazioni (rosso problema, verde normali, colori diversi medio problema), nel senso che ha proprietà metacromatiche che dipendono dal tipo di legame che instaura con gli acidi nucleici. Il protocollo prevede: - Preparazione del campione in tampone TNE (0.01M Tris, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4). Le aliquote possono essere congelate a -80°C o in azoto liquido. - Preparazione del campione per analisi citofluorimetrica: trattamento con soluzione detergente/acida (0,15 M, 0,1% triton X-100, 0,08 N HCl in H2O, pH 1.2). - Elettroforesi a 25 V e 300 mA sodio citrato 0.1% + triton 0.1%. - Colorazione con arancio di acridina (in 37 mM acido critico, 12,6 mM sodo fosfato, 1 mM sodio EDTA, 150 mM NaCl, pH 6). L'osservazione viene fatta al c