Biosintesi delle pirimidine, Biochimica

Abbiamo visto la sintesi prebiotica. Il nucleotide in questo caso è un uridin-riboso-monofosfato.

Significa che la sintesi va scorporata, bisogna effettuare l'analisi retrosintetica, cioè dato un

composto come può essere formata questa molecola. In questo caso l'UMP sarà formato da base

azotata più ribosio fosfato.

Quando si parla di metabolismo, non si può prendere a compartimenti, per quanto ci sono dei

metabolismi privilegiati in cui c'è solo una via metabolica sganciata da tutte le altre, normalmente i

processi sono tra loro integrati, come in questo caso si interseca con il metabolismo dei glucidi, in

una via metabolica che si chiama via dei pentosofosfati. Un ribosio proverrà da questa via. Nella

biosintesi delle purine, le due vie metaboliche, via dei pentosofosfati e via delle basi azotate si

intersecano, poiché il composto uridil monofosfato è necessariamente un composto che proviene

dalla catalisi enzimatica operata sulla base azotata e sul ribosio con formazione di un legame N-

glicosidico, legame tra azoto 1 delle primidine o azoto 9 delle purine con carbonio 1 del ribosio,

non reazione di attacco nucleofilo.

Analisi retrosintetica: si può semplificare il sistema prendendo lo scheletro degli atomi che

compongono la molecola ed effettivamente a partire dall'aspartato, un metabolita ampiamente

disponibile in tutti gli esseri viventi, con la formammide; viene prodotta la formammide? l'essere

umano non la produce, produce un surrogato che richiede un passaggio enzimatico in più: il

carbonio viene dalla CO idratata, l'azoto proviene invece da una glutammina, altro amminoacido

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prontamente disponibile. La sintesi dell'uracile avviene con questi elementi, acido aspartico,

glutammina come donatore di azoto, e bicarbonato come donatore di carbonio. Ecco in cosa

consiste l'analisi retrosintetica, analizzare da quali frammenti può essere composta una molecola.

Nel caso del catabolismo, non ha senso, si applica chiaramente all'anabolismo.

Formammide+aspartato=formammilaspartato. E' una reazione di attacco nucleofilo a formare il

formammilaspartato. Quest'ultimo dopodiché può ciclizzare. La molecola che ne deriva si chiama

diidroorotato, ciclizzazione dell'ammide ciclica data dal formammilaspartato. Arrivati al diidroorotato

serve una decarbossilazione e una ossidazione; si passa da diidroorotato a orotato con

l'ossidazione, vengono ossidati due atomi di carbonio, con rilascio di due protoni e due elettroni e

genera una molecola che si chiama orotato, il diretto precursore dell'uracile. Una volta

decarbossilato abbiamo l'uracile. Sono fondamentalmente quattro passaggi. L'ultimo passaggio è

la formazione del legame N-glicosidico a dare uracile.

Quando si analizzano le biosintesi si stabilisce la sequenza delle

formule chimiche e capire come si passa da un composto all'altro,

schema di formule a reazioni chimiche semplici; una volta capita la

sequenza si inseriscono enzimi e cofattori.

Nella reazione metabolica viene sintetizzato prima il

legame glicosidico e per ultima avviene la decarbossilazione. C'è un enzima per ogni passaggio. I

vari enzimi sono: la carbammil-fosfato sintetasi II (ci sarà una I); l'aspartato transcarbamilasi,

enzima importante, è un esamero, enzima allosterico; il terzo enzima è la diidroorotasi, catalizza la

ciclizzazione. Questi tre enzimi sono distinti nei procarioti, sono enzimi costituiti da diverse

subunità. Nell'uomo questi tre enzimi sono fusi insieme, un singolo gene, un enzima molto grande

e polimerico, in cui ciascun dominio avrà un'attività catalitica (gene CAD). Nell'evoluzione i geni

relativi a questi tre enzimi sono fusi insieme. E' facile che si fondano quando nei procarioti si ritrova

una struttura policistronica, se nei procarioti come nel caso dei geni per il CAD sono sequenziali,

basta una mutazione nel codone di stop e avviene un'integrazione di due geni in uno solo. C'è poi

un enzima successivo, il diidroorotato deve essere ossidato per formare l'orotato, l'enzima è la

diidroorotato deidrogenasi. La via biosintetica differisce leggermente perché l'organismo preferisce

fare la decarbossilazione come ultimo passaggio e anticipare il trasferimento sul ribosio-fosfato per

formare l'oritidina monofosfato, l'OMP, ha vita breve e forma l'UMP.

Rivediamo allora i passaggi con gli enzimi. Serve un passaggio che ci costruisca un analogo della

formammide. L'enzima carbammilfosfato sintasi prende la CO , un gruppo fosfato e un gruppo

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amminico e forma il carbammilfosfato. E' l'analogo biodisponibile della formammide, è infatti una

formammide (mezza molecola di urea) che anziché l'atomo di H della formammide ha un gruppo

fosfato. Il carbammil fosfato interviene nel catabolismo dell'azoto (I) e nella biosintesi delle basi

azotate (II). E' una reazione unica, si viene a formare una ammide con un gruppo fosforico, è un

enzima a tre substrati. Questi substrati sono ammoniaca allo stato puro e fosfato inorganico; è una

sintetasi che utilizza ATP (VI gruppo), servono due ATP per sintetizzare il carbammilfosfato. Il

gruppo amminico non viene dall'ammoniaca ma dalla glutammina, un ottimo trasportatore di

ammonio nel metabolismo, NH2. Il trasportatore del gruppo amminico non è una vitamina ma un

amminoacido, ha funzione in questo caso di trasporto. Il gruppo amminico della glutammina con 2

ATP e CO dà carbammilfosfato più glutammato (dalla glutammina se tolgo l'NH2 prende l'OH

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diventa glutammato). In questo caso l'enzima non richiede neanche una biotina, è l'unico caso in

cui una carbonilazione non richiede biotina. Il carbammil fosfato è un'ammide attivata, reagisce

con l'aspartato, esce un fosfato inorganico e si forma il formammil-aspartato. La variante quindi è

questa, non abbiamo la formammide che è tossica, si usa il carbammil fosfato che è una

formammide attivata. L'enzima diidroorotasi ciclizza il formammil-aspartato in diidroorotato. Tutte

queste reazioni fanno parte dell'enzima CAD: entrano CO , ATP e glutammina e esce il

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diidroorotato. Una volta formato il diidroorotato avviene una ossidazione: la reazione avviene in

presenza di ossigeno, da diidroorotato più ossigeno a dare orotato più acqua ossigenata, l'enzima

è la diidroorotato deidrogenasi è un enzima che consuma ossigeno, è un'ossidasi (classe I EC);

convertire un legame carbonio-carbonio singolo in doppio legame è una reazione che richiede un

legame forte; il cofattore più utilizzato in questo genere di reazioni è il NAD, catalizza ossidazioni

delle deidrogenasi a basso potenziale; in questo caso si usa infatti una variante del FAD, il FAD

ossida la molecola e si riduce e verrà riciclato riossidandosi. La diidroorotato deidrogenasi è

un'ossidasi FAD-dipendente ed è un importante bersaglio terapeutico, può essere inibito da una

serie di inibitori competitivi che bloccano la sintesi delle purine; se ne possono studiare a centinaia,

sono importanti per le terapie anti tumorali, bloccando la sintesi delle purine/pirimidine si blocca la

sintesi di DNA. In realtà l'utilizzo dell'inibizione della diidroorotato deidrogenasi è solo di supporto.

La cosa curiosa è che molti dei farmaci sviluppati come antitumorali si rivelano come dei preziosi

antinfiammatori e antireumatici. Come si spiega questo? L'inibizione è della sintesi delle pirimidine,

il concetto è che nelle malattie reumatiche e nelle infiammazioni vi è proliferazione dei leucociti, se

inibiamo la sintesi delle pirimidine si inibisce la produzione dei leucociti e si ha un effetto

secondario antinfiammatorio o antireumatico. Questi composti sono abbastanza semplici.

Un esempio di inibizione enzimatica competitiva per la diidroorotato deidrogenasi. E' un enzima

complesso, costituito da una corona di alfa eliche e una parte centrale che somiglia ad un barile

beta; è simile ad un enzima con ripetizione del motivo strutturale beta-alfa-beta, in cui tutti i foglietti

beta si pongono all'interno a formare una cavità, mentre le alfa eliche sono poste all'esterno. Nella

cavità entra il diidroorotato nel sito attivo vicino ad una molecola di FAD, molecola triciclica; per

avvenire la reazione di ossidazione il diidroorotato è a contatto con il FAD, che si riduce e l'enzima

rilascia il diidroorotato ossidato. L'enzima ha un barile beta che visto dall'alto è chiuso da un altro

foglietto beta, il substrato entra da una catena laterale; infine un inibitore competitivo, si piazza

all'entrata della cavità e blocca l'entrata del diidroorotato o l'uscita dell'orotato [questo è formato da

due fenili, un'ammide, ha una parte polare e una parte idrofobica; nella tasca ci saranno

amminoacidi idrofobici, entra nella tasca e blocca l'enzima]; l'inibitore può essere rimossa

aumentando la concentrazione di diidroorotato, ecco perché può essere usato come

antinfiammatorio o antireumatico, ma funziona male come antitumorale, perché con la produzione

di diidroorotato l'inibitore viene spiazzato facilmente. L'inibitore si legherà all'enzima in maniera

non covalente non proprio al substrato, perché l'inibitore blocca l'entrata o l'uscita del substrato.

Il diidroorotato può essere coniugato al ribosio fosfato e si ottiene la molecola. C'è l'enzima, orotato

fosforibosil transferasi, prende l'orotato e lo trasferisce sul fosforibosil. Il substrato sembra essere il

ribosio 5-fosfato. In realtà un legame fra l'alcol del ribosio e l'azoto dell'orotato non è facile e non

avviene fra l'azoto 1 e il ribosio, l'alcol del ribosio deve essere attivato; interviene un composto

chiamato PRPP fosforibosil pirofosfato, il ribosio 5-fosfato attivato in posizione 1 da un pirofosfato;

quindi per fosforibosil non si intende il ribosio 5-fosfato ma il PRPP; quando si forma il legame N-

glicosidico, il pirofosfato se ne esce e si forma l'orotidina-ribosio, l'OMP, o uracile carbossilato in 2.

Il substrato in questo caso per formare i legami N-glicosidici si necessita di zuccheri pirofosfati, in

questo caso 5-fosfato e 1-pirofosfato, altrimenti non si forma. Serve quindi che uno dei due gruppi

si attivi. Acido orotico + PRPP dà fosforibosil orotato, o orotidina. Ricordarsi il PRPP, non si usa il

ribosio semplice, ma il PRPP.

Una volta formata l'orotidina, questa decarbossila a dare l'UMP, cioè OMP=UMP+CO2. Il concetto

è che però l'enzima precedente compie uno sforzo nel coniugare il carbonio e l'azoto in presenza

di un doppio ingombro sterico, sia dell'O sia d