biologia molecolare

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA

1) Correzione di bozze della DNA polimerasi

2) Riparazione degli accoppiamenti errati che utilizza il filamento parenterale come

stampo

Dopo la sintesi corregge mutazioni puntiformi MISMATCH (=accoppiamento basi

non complementari, DNA denaturato).

Qual è il filamento corretto e quello mutato ????

In e. coli la A della sequenza consenso GATC è metilata solo nel filamento

parenterale.

La correzione richiede 3 proteine:

- MutH riconosce il filamento corretto metilato e si lega a GATC

- MutS si lega al mismatch

- MutL attiva MutH che taglia il filamento neosintetizzato (attività

endonucleasica)

Si crea una lacuna nel filamento neosintetizzato e il mismatch viene

eliminato.

DNA pol I e DNA ligasi ricostituiscono il filamento e una volta corretto può

essere metilato.

3) Riparazione a seguito di escissione di una regione danneggiata

Corregge regioni di DNA con basi chimicamente modificate che denaturano il

DNA.

Proteine scorrono in continuazione sul DNA alla ricerca di irregolarità nel doppio

filamento.

- UV possono causare la fotodimerizzazione (formazione di legami

covalenti tra 2 T adiacenti). Dimeri di T distorcono elica e impediscono

duplicazione e trascrizione

- Deaminazione idrolitica i gruppi amminici di A G C vengono eliminati x

idrolisi.

Le deaminazioni vengono eliminate da E DNA glicosilasi e poi il filamento

viene ricostituito.

TELOMERI

Sequenze di DNA ripetuto alle estremità dei cromosomi degli eucarioti per evitare

dispersione di materiale genetico. L’RNA innesco all’estremità 5’ del filamento lento

non può essere convertito in DNA e viene eliminato dalle RNasi  il filamento si

accorcia.

I telomeri sono sequenze di 6-8 nucleotidi ricche di G (nell’uomo sequenza 5’ TTAGGG

3’)

L’E telomerasi (trascrittasi inversa) allunga l’estremità 3’ del filamento di DNA che fa

da stampo per il filamento lento.

Lunghezza dei telomeri  longevità ??? Nel corso della vita i telomeri già presenti alla

nascita si accorciano.

Quando i telomeri sono consumati a ogni duplicazione cell perde materiale genetico.

Cell neoplastiche hanno capacità di allungarsi i telomeri per potersi duplicare infinite

volte.

REGIONI DI CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE DEGLI EUCARIOTI = PROMOTORE

• TATA BOX a monte del sito di start simile ai procarioti

• Iniziatore

• CpG

• Enhancers o intensificatori

RNA POLIMERASI NEGLI EUCARIOTI

1) RNA polimerasi I x rRNA nel nucleolo

2) RNA polimerasi II x mRNA

3) RNA polimerasi III x tRNA

Tutte e 3 sono costituite da:

• 2 subunità grandi – omologhe a subunità β e β’ della RNA pol dei

procarioti

• 2 subunità piccole – omologhe alla subunità α

TRASCRIZIONE EUCARIOTI vs. PROCARIOTI

1) RNA sintetizzato nel nucleo

2) Maturazione dell’RNA (introni-esoni e splicing)

3) Apparato di trascrizione complesso (nei batteri c’è solo 1 RNA pol)

FATTORI DI TRASCRIZIONE (TF)

Proteine che permettono all’RNA pol di interagire con il DNA. Assemblandosi formano il

complesso di inizio della trascrizione costituito da:

• TF generali (TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC x l’RNA pol III)

• TF gene-specifici

• RNA polimerasi

Il gene per il tRNA ha 2 regioni di controllo interne (ICR) BOX A e BOX B (enhancers)

1) TFIIIC si lega con BOX A e B

2) TFIIIB si lega al complesso TFIIIC-gene

3) Si lega la RNA pol III che inizia la trascrizione

4) RNA pol scorre lungo il filamento mentre il complesso di trascrizione (TFIIIB e

TFIIIC) resta attirando altre RNA pol

ENHANCERS O INTENSIFICATORI

Permettono l’aggancio del complesso di trascrizione. Sono formati da sequenze

consenso ridondanti.

Sono piuttosto lunghi e sono universali per + geni. Agiscono anche se sono all’interno

del gene, in un introne o su geni molto lontani. Agiscono in tutte e 2 le direzioni.

Possono legare molti fattori di trascrizione. I TF contengono 2 domini funzionali uno

per il legame col DNA e uno per l’attivazione della trascrizione. I domini di legame al

DNA possono essere:

• Proteine a omeodomini (hanno un’ α elica che si lega al DNA del solco >)

• Proteine a dita con zinco (ansa tenuta su dallo Zn forma il “dito”)

• Proteine a serratura di leucine (2 eliche con residui di leucine idrofobiche,

formano dimeri)

• Proteine elica ansa elica (dimeri legati)

Probabilmente gli enhancers riescono a controllare la trascrizione di geni così lontani

perché il DNA si ripiega a formare anse che avvicinano enhancers e TF.

Enhancers delle immunoglobuline

“Le azioni e le proprietà di ogni tipo di cellula sono determinate dalle proteine che essa

contiene”.

SINTESI DIFFERENZIALE DELLE PROTEINE:

• Controllo trascrizionale (velocità trascrizione mRNA)

• Velocità degradazione mRNA

• Controllo traduzionale (velocità con qui mRNA viene tradotto in proteine)

• Controllo degradativo (velocità degradazione proteine)

CONTROLLO TRASCRIZIONALE

L’RNA polimerasi si lega ad un sito detto promotore. L’efficienza della trascrizione

dipende dalla forza del promotore = quanto + si avvicina alla sequenza consenso.

OPERONE LAC

Per poter usare come nutriente il lattosio l’e.coli necessita di 3 enzimi:

• Β-galattosidasi (scinde il lattosio in gluc + galatt)

• Permeasi (facilita ingresso lattosio)

• Tiogalattoside transacetilasi

Operone = porzione di DNA che comprende geni x 3 proteine (mRNA policistronico) +

regioni di controllo

Poco lattosio  pochi enzimi Lattosio induce la sintesi degli enzimi.

Meccanismo d’azione

REPRESSORE si lega ad un sito detto OPERATORE (O1 e O2) in prossimità dell’inizio del

gene impedendo all’RNA polimerasi la trascrizione  controllo negativo della

trascrizione

Il LATTOSIO agisce da induttore si lega al repressore e lo inattiva  sintesi mRNA

Controllo positivo della trascrizione

Nei batteri che crescono in presenza di glucosio i livelli di AMPc sono bassi.

Proteina recettore del AMPc (CRP) non legata al AMPc non è attiva e non può interagire

con il DNA.

OPERONE DEL TRIPTOFANO

È costituito da 5 geni che codificano per gli enzimi della biosintesi del triptofano + 1

regione di controllo trascrizionale.

Il TRIPTOFANO si lega al REPRESSORE che cosi può legarsi all’OPERATORE bloccando la

trascrizione.

Attenuazione : ad elevati livelli di triptofano la trascrizione inizia ma invece di

trascrivere i 5 geni per gli enzimi si forma solo mRNA per il PEPTIDE LEADER. L’mRNA

pe il peptide leader si ripiega si se stesso e segnala alla RNA polimerasi di cessare la

trascrizione.

CONTROLLO TRADUZIONALE

L’efficienza traduzionale dipende dalle sequenze di Shine-Dalgarno sono le

sequenze ricche di purine a monte del sito di inizio traduzione AUG complementari alle

sequenze sull’rRNA .

Il massimo dell’efficienza si ha quando la sequenza di Shine-Delgarno è esattamente 8

nucleotidi a monte di AUG. L’azione di queste sequenze può essere modulata da

proteine ribosomiali.

CONTROLLO TRADUZIONALE DEGLI EUCARIOTI

Traduzione dell’mRNA per la ferritina

Ferritina è una proteina che lega gli ioni ferro evitandone l’accumulo tossico.

Se c’è poco Fe  scarsa sintesi ferritina

Se c’è eccesso di Fe sintesi ferritina che sequestra il Fe

Questa regolazione dipende dagli elementi di risposta al ferro (IRE) nella regione 5’

UTR (untraslated region) che legano le proteine IRE-BP e impediscono l’agancio dei

ribosomi all’mRNA.

RNA DEI MAMMIFERI

80% rRNA 15% tRNA 5% mRNA

Trascritto primario = RNA immaturo  MATURAZIONE DELL’RNA

Il grado di rielaborazione dell’RNA è direttamente proporzionale alla sua stabilità. I più

rielaborati sono i tRNA e gli rRNA. ↑rielaborazione ↑stabilità ↑emivita

MATURAZIONE DELL’mRNA (eucarioti)

Nel nucleo pre-mRNA (hn-RNA) associato a proteine per formare ribonucleoproteine

eterogenee.

mRNA maturo trasportato nel citoplasma attraverso i pori nucleari.

Modificazioni

1) CAP di 7-METILGUANOSINA: una fosfoidrolasi rimuove il fosfato terminale e il

gruppo 5’ difosfato restante reagisce con GTP – l’E guanilil transferasi trasferisce

il GMP sul gruppo 5’ difosfato e alla guanina viene aggiunto un gruppo metilico

in posizione 7.

Funzioni del CAP

• Protegge dall’azione delle esonucleasi 5’3’

• Rende l’mRNA suscettibile a ulteriori modificazioni

• Sito di attacco per i ribosomi

2) CODA DI POLI-A: quando l’RNA pol ha terminato la trascrizione del gene una

endonucleasi scinde a valle della sequenza AAUAAA –all’estremità 3’

neoformata vengono aggiunti residui multipli di adenosina.

La poliadenilaione avviene in 2 fasi:

a) Fase lentaaggiunti 12 nucleotidi da E poli-A-polimerasi (PAP) che usa ATP

b) Fase veloceaggiunti 200-250 nucleotidi da PAB II

Coda di poli A ha la stessa funzione dei telomeri infatti le code di poli A vengono

accorciate da esonucleasi 3’5’ prima di essere trasportate nel citoplasma.

3) SPLICING: l’mRNA trasctitto primario contiene INTRONI che separano tra loro gli

ESONI  mRNA maturo contiene solo esoni tutti codificanti x proteine + le

regioni 5’ e 3’ UTR.

Lo splicing avviene nel nucleo e consiste nella rimozione degli introni.

I siti di giunzione tra introni ed esoni contengono sequenze consenso:

a) SEQUENZA GU all’estremità 5’ dell’introne

b) SEQUENZA AG all’estremità 3’ dell’introne

c) Residuo di A nel sito di ramificazione all’interno del’introne

5’ esone AG GUAAGU introne A introne UUUUCAG G esone 3’

Rimozione degli introni – SPLICEOSOMA (enzimi + RNA nucleare piccolo =

ribonucleoproteine nucleari piccole)

2 reazioni di transesterificazione con idrolisi ATP.

1) Tra il fosfato all’estremo 5’ dell’introne e l’OH dell’adenosina nel sito di

ramificazione

2) Tra l’OH dell’estremo 3’ di un esone e il fosfato del 5’ dell’altro esone

L’introne forma una struttura a laccio il LARIAT che viene eliminato e idrolizzato.

Gli intoni possono essere eliminati secondo l’ordine con cui sono stati trascritti o

al contrario.

IN VITRO sono stati scoperti 2 tipi di introni in grado di fare auto-splicing:

• Introni di gruppo I presenti nei geni degli rRNA dei protozoi

• Introni di gruppo II presenti nei geni degli RNA di mitocondri, piante e