biologia molecolare

Biologia molecolare

Il DNA e le basi molecolari

Il DNA è la base molecolare dell’ereditarietà e dell’espressione dei caratteri. Malattie genetiche dovute a malfunzionamento di reazioni metaboliche per l’assenza di enzimi specifici (emofilia, fenilchetonuria) sono i caratteri più facili da osservare.

Esperimento di Griffith

1 gene ⟶ 1 proteina.

Capsulati/lisci: patogeni.

Pneumococchi (batteri che causano la polmonite) non capsulati/ruvidi: non patogeni (anticorpi lo possono attaccare facilmente).

• Pneumococchi capsulati vivi = patogeni topo ⟶
• Pneumococchi non capsulati vivi = non patogeni topo ⟶
• Pneumococchi capsulati/non capsulati uccisi dal calore topo ⟶
• Pneumococchi capsulati uccisi dal calore + non capsulati vivi topo ⟶

Quindi i non patogeni possono diventare patogeni se incorporano un fattore trasformante dal ceppo dei patogeni. Trattando patogeni con proteasi, lipasi, RNasi vedo che la malattia si sviluppa comunque perché l’informazione è portata dal DNA.

Cromosomi

DNA: acido desossiribonucleico.

Istoni: proteine basiche che neutralizzano l’acidità del DNA (protamine negli spermatozoi).

Nucleotidi sono i monomeri che costituiscono l’acido nucleico DNA e sono formati da:

• Base azotata
• Purine: Adenina, Guanina (doppio anello)
• Pirimidine: Citosina, Timina (anello semplice)
• Zucchero pentoso il desossiribosio
• Gruppo fosfato

Nucleoside = zucchero + base azotata ⟶ legame β-glucosidico (α=50°) (adenosina, timidina, citidina, guanosina). Nucleoside viene fosforilato + gruppo fosfato ⟶ legame fosfoesterico = nucleotide (AMP, TMP, CMP, GMP).

Struttura del DNA

I nucleotidi si legano tra di loro tra –OH del C3 e O del gruppo fosfato in C5 con eliminazione di una molecola d’acqua (legame fosfoesterico). Mentre le basi azotate si legano tra di loro mediante legami a idrogeno. Purine G si legano sempre a 1 pir e 1 pirimidine C T per mantenere costante la distanza tra i due filamenti. Nei tratti di DNA con molti legami A-T i due filamenti sono più facili da separare perché ci sono meno legami a idrogeno.

Estremità 3’ con gruppo ossidrile –OH. Estremità 5’ con gruppo fosfato. Nel DNA quantita di A=T C=G e G+A=T+C (regole di Chargaff).

Watson e Crick scoprono la struttura del DNA (Nobel). Struttura α-elica costituita da due catene polinucleotidiche (filamenti) con impalcatura laterale formata di zuccheri e gruppi fosfati con al centro basi azotate. I filamenti sono antiparalleli (i due filamenti 5’-3’ scorrono in direzioni opposte) visto che il legame β-glucosidico ha un angolo di circa 50° è l’unica configurazione che consente la giusta angolazione per formare i ponti idrogeno.

Struttura α-elica è termodinamicamente più favorevole perché:

• Parti idrofiliche: gruppi P e zucchero stanno all’esterno a contatto con l’acqua.
• Parti idrofobiche: basi azotate sono rivolte verso l’esterno riducendo i contatti con l’acqua. Ma per allontanare ancora di più i contatti con l’acqua i due filamenti ruotano in senso antiorario (elica destrorsa) di circa 30° in questo modo le basi si avvicinano ancora di più. Passo dell’elica = giro completo ⟶ 10 nucleotidi ⟶ 3.4 nm. Diametro = 2.37 nm.

La superficie esterna del DNA B tra le eliche presenta:

• Solco maggiore
• Solco minore

Questi solchi facilitano in legame di enzimi o altre molecole alle basi azotate. DNA B è la struttura che assume l’α-elica in ambiente acquoso. DNA A struttura assunta in ambienti non acquosi, le basi sono inclinate di 20°, i due solchi sono simili e assume la forma di un cilindro cavo al centro. Assumono questa struttura le molecole di RNA a doppio filamento e le molecole ibride DNA-RNA. Nella cellula il DNA è quasi sempre in forma B intercalata da brevi sequenze A (DNA Z).

α-elica è una struttura molto flessibile grazie a proteine questa molecola lunga anche 7 m può compattarsi nel nucleo di 1 micron della cellula.

Codice genetico

Il gene è una sequenza di nucleotidi che specifica la sequenza di aminoacidi di una proteina. Colinearità:

• 1 nucleotide ⟶ 1 aminoacido solo 4 combinazioni
• 2 nucleotidi ⟶ 1 aminoacido solo 16 combinazioni
• 3 nucleotidi ⟶ 1 aminoacido 64 combinazioni più che sufficienti per i 20 aa

Triplette di 3 nucleotidi che codificano per 1 aa = codoni. 61 codoni codificanti + 1 codone d’inizio AUG (metionina) + 3 codoni STOP (UAA, UAG, UGA). Degenerazione del codice = 1 aa può essere codificato da più codoni. Quando il codone interagisce con l’anticodone le prime due basi si accoppiano normalmente mentre l’ultima a causa del vacillamento della terza base può legarsi a diversi nucleotidi (più codoni del tRNA grazie a inosina nella posizione vacillante si legano a più codoni del mRNA).

Denaturazione

Processo di separazione dei due filamenti totale o a tratti mediante rottura dei legami a idrogeno. Anche il DNA circolare può denaturare rimanendo chiuso ad anello forma un “gomitolo”.

Agenti denaturanti:

• Calore (T>80°C)
• pH estremi <3 o >10
• Sostanze chimiche

Elicasi sono proteine ad azione enzimatica che si occupano di denaturare il DNA. Tm = melting temperature è il punto di fusione del DNA ed è più elevato tante più coppie G-C ci sono.

DNA vs RNA

DNA

• Desossiribosio
• Timina
• Bifilamentoso α-elica
• 99% nucleo + 1% mitocondri

RNA

• Ribosio
• Uracile
• Monofilamentoso
• Nucleo dov’è sintetizzato + citoplasma (ribosomi)

Duplicazione

- Duplicazione conservativa (sperimentato con DNA marcato con N radioattivo)

- Duplicazione dispersiva

- Duplicazione semiconservativa

La duplicazione del DNA in natura è sempre semiconservativa cioè durante il processo i due filamenti madre vengono utilizzati con stampo per i nuovi filamenti complementari. (50% DNA materno + 50% DNA neosintetizzato) Salvo mutazioni i 2 DNA sono identici a quello di partenza.

1. Bolla di duplicazione di DNA denaturato da elicasi
2. Alle estremità si forma tensione torsionale e superavvolgimenti
3. Topoisomerasi individua e svolge i superavvolgimenti

Ribosoma

Ribosoma è un organello formato da un’impalcatura di proteine che sorregge rRNA, è una struttura simile in tutti gli organismi viventi. Svedberg (S) = coefficiente di sedimentazione che corrisponde a quanto una particella è grande e pesante.

Ribosoma procariote 70s

• Subunità minore 30s: rRNA 16s e 21 proteine (s1,s2,s3…s=small)
• Subunità maggiore 50s: rRNA 5s, rRNA 23s e 31 proteine (l1,l2,l3…l=large)

Ribosomi eucarioti

Ribosomi citoplasmatici 80s

• Subunità 40s: rRNA 18s e 33 proteine
• Subunità 60s: rRNA 5s, 28s, 5.8s e 50 proteine

Ribosomi mitocondri/cloroplasti: stessa struttura di quelli procarioti (teoria endosimbiontica).

RNA transfer

Circa 80 nucleotidi, struttura a trifoglio con 3 anse stabilizzate dai ponti H che legano basi complementari. Ogni tRNA lega una tripletta del mRNA e il suo aminoacido corrispondente. Ha 1 sito di legame per l’aminoacido e anticodone complementare a mRNA.

Duplicazione DNA nei procarioti

Nel cromosoma batterico circolare la duplicazione inizia in un punto fisso (oriC) e procede bidirezionalmente nelle 2 forcelle di duplicazione della bolla di duplicazione. Il sito di origine della duplicazione o oriC consiste in una sequenza di nucleotidi altamente conservati seguiti da una sequenza di DNA ricca di A e T che favorisce la denaturazione.

OriC ha 4 siti di legame che interagiscono con dnaA (proteina tetramerica) provocando un arricciamento del DNA che causa denaturazione (necessaria idrolisi ATP).

Sono stati scoperti 3 enzimi che catalizzano la sintesi:

• DNA polimerasi I ripara le lesioni e salda i frammenti di Okazaki
• DNA polimerasi II partecipa alla riparazione della catena di DNA
• DNA polimerasi III responsabile dell'allungamento catena DNA nella forcella di duplicazione

Velocità duplicazione DNA batterico: 1000 nucleotidi/secondo.

DNA pol III aggiunge nucleotidi che derivano da un desossiribonucleoside-5’-trifosfato (dNTP) solo all’estremità 3’. Lo scheletro zucchero-fosfato si forma per trasferimento di un gruppo nucleotidico da un dNTP al gruppo -OH del residuo nucleotidico terminale della catena di DNA in allungamento. L’idrolisi del pirofosfato con pirofosfatasi fornisce l’energia necessaria. In questo modo è possibile correggere gli errori.

Possibili meccanismi della DNA polimerasi III

• Processo distributivo = dopo che è stato aggiunto nucleotide l’enzima si stacca e si lega a un’altra catena
• Processo progressivo = enzima continua sintesi sulla stessa catena fino a che non completa la duplicazione. Sperimentalmente è stato dimostrato che è questo il meccanismo per questo enzima

La DNA polimerasi III può essere formata da 3 subunità (α, ε, θ) o da 11 subunità (oloenzima).

Subunità dell’oloenzima

• Subunità α catalizza trasferimento gruppo nucleotidico in direzione 5’⟶3’
• 2 Subunità β agganciano oloenzima a DNA. Responsabili del meccanismo progressivo.
• Subunità τ tiene unite 2 molecole di DNA polimerasi III
• Subunità ε ha attività esonucleasica 3’⟶5’ elimina errori alle estremità (proofreading)
• Le altre 6 subunità formano il complesso γ che idrolizza ATP

Questo enzima ha il più basso tasso di errore tra tutti gli enzimi = 10^-4.

Altri enzimi

• Elicasi denaturano il DNA a livello delle forcelle di duplicazione
• Proteina SSB impedisce la formazione di anse a forcina

La DNA polimerasi III catalizza la sintesi solo in direzione 5’⟶3’ quindi si formeranno:

• Filamento guida dove la sintesi avviene in maniera continua aggiungendo nucleotidi all’estremità 3’
• Filamento lento la sintesi è discontinua si formano brevi sequenze di DNA i frammenti di Okazaki uniti successivamente da un enzima!

La DNA pol non è in grado di sintetizzare ex novo un filamento ma ha bisogno di brevi sequenze di RNA innesco 5’⟶3’ (anche per ogni frammento di Okazaki) sintetizzato da enzima primasi o dnaG.

Primosoma è un complesso formato da primasi e elicasi che si trova a livello della forcina di duplicazione.

RNA innesco vengono idrolizzati da RNasi H e da DNA pol I (attività esonucleasica).

Traslazione delle discontinuità = DNA pol I sostituisce RNA innesco con DNA.

DNA ligasi salda i frammenti di Okazaki, catalizza legame fosfodiesterico tra OH 3’ di un frammento e il gruppo P 5’ del frammento adiacente.

In vivo la sintesi del filamento guida e di quello lento avvengono alla stessa velocità.

Replisoma

Complesso enzimatico formato da tutte le proteine coinvolte nella duplicazione:

• 2 molecole di DNA polimerasi III per forcella
• 1 primosoma (primasi+elicasi)
• 1 proteina REP che srotola l’α-elica per il filamento guida
• 4 proteine SSB
• DNA topoisomerasi che allentano la tensione che si accumula a monte della forcella per lo srotolamento dell’α-elica

Duplicazione negli eucarioti

Il processo è simile a quello dei procarioti anche in questo caso avremo la sintesi continua del filamento guida e la sintesi discontinua del filamento lento. Negli eucarioti si formano più bolle di duplicazione contemporaneamente che mano a mano si uniscono permettendo duplicazione di tutto il DNA eucariotico in meno di un’ora (nei procarioti è molto più lento). I frammenti di Okazaki sono più corti.

Tipi di DNA polimerasi

• DNA polimerasi α attività primasica + polimerasica aggiunge all’estremità 3’ dell’RNA innesco una catena di 20 nucleotidi.
• DNA polimerasi β catalizza processi di riparazione del DNA.
• DNA polimerasi γ catalizza duplicazione del DNA mitocondriale.
• DNA polimerasi δ agisce dopo α e catalizza la sintesi del filamento lento.
• DNA polimerasi ε agisce dopo α e catalizza la sintesi del filamento guida.

Meccanismi in grado di correggere gli errori (proofreading). DNA pol δ e γ hanno attività esonucleasica 3’⟶5’ che rimuove nucleotidi sbagliati.

Duplicazione istonica

Negli eucarioti duplicazione del DNA avviene contemporaneamente alla sintesi degli istoni. Filamento guida ⟶ istoni parenterali. Filamento lento ⟶ istoni neosintetizzati. Esperimento: se tratto cellule eucariote in duplicazione con inibitori della sintesi proteica vedo che uno dei due filamenti è privo di istoni.

Trascrizione

Regioni di controllo della trascrizione sono sequenze di DNA a monte/valle/all’interno del gene sia negli eucarioti che nei procarioti. Promotori sono sequenze consenso a monte in molti geni procarioti.

Promotore di E. coli

• TATA box (TATAAT) regione -10 rispetto a punto di inizio della trascrizione
• TTGACA regione-35

RNA polimerasi nei procarioti

1 sola forma di RNA pol che catalizza la sintesi dei 3 RNA, è un oloenzima con 5 subunità diverse:

• Subunità β lega in modo aspecifico il DNA
• Subunità β’ contiene il sito attivo dell’enzima per la sintesi
• Subunità α lega altri fattori di trascrizione
• Subunità σ70 avvia il processo di trascrizione

RNA pol scorre lungo filamento di DNA e la σ70 riconosce e lega il promotore grazie a catene laterali di residui amminoacidici.

1. La σ si lega a sequenza TATA
2. DNA si denatura e si forma una bolla di trascrizione
3. Si forma corto RNA innesco
4. Quando RNA innesco raggiunge la lunghezza di 10 nucleotidi RNA pol si allontana dal promotore
5. Subunità σ si stacca
6. Trascrizione aggiunta di nucleotidi all’estremità 3’ con energia fornita da idrolisi dei nucleosiditrifosfato e dalla rinaturazione del DNA
7. La trascrizione termina a livello di sequenze palindromiche