Biologia Molecolare - Trascrizione

seguente ordine: TF II D, TF II A, TF II B, TF II F, TF II E e TF II H.

1. Il TF II D è uno dei fattori accessori della TATA, chiamati TAF; è costituito da 11-12

proteine; la maggior parte di esse lega la TPB, nonostante questa sia di piccole

dimensioni; 2 proteine legano invece il DNA a livello del DTE. Il posizionamento a ferro

di cavallo del TF II D sul punto di flesso del DNA consente il contatto sia con la DTE che

con la TBP.

2. Il TF II A si lega al TF II D dopo l'interazione di quest'ultimo con le proteine DTE e TBP,

stabilizzandone il legame.

3. Il TF II B, unico monomero di tutti fattori del PIC, modifica la sequenza a valle della

TATA box, linearizzando tramite il proprio finger B (una struttura del TF II B) circa 11-14

nucleotidi posti a valle del nucleotide +1 del gene, ed inglobando al suo interno i 15 posti

a valle della TATA box. Il finger B è il sito di legame anche per l'RNA polimerasi.

Il TF II F lega il finger B; esso è costituito da 4 subunità, ed è sempre legato con l'RNA

4. polimerasi (è il suo chaperone). L'RNA polimerasi si accomoda su un lungo tratto di

DNA (circa 240 che si estende sia a monte che a valle del sito di start (-11/+3). Il TF

Å),

II F, legandosi al finger B, consente il corretto inserimento dell'RNA polimerasi sul

nucleotide +1 del gene; a seguito di ciò, il TF II F viene rilasciato. A questo punto, l'RNA

polimerasi è inserita correttamente, ma è ancora inattiva e quindi la trascrizione non può

ancora iniziare. Le condizioni che consentono l'attivazione della RNA polimerasi

richiedono il coinvolgimento del TF II E, del TF II H e del complesso del mediatore.

Quest'ultimo è un complesso di 52 proteine, multifunzionale, che recluta le proteine che

modificano la cromatina (come ad esempio le HAT o i complessi di rimodellamento) e

comunica con le proteina che legano legano sequenze enhancer e fattori di inizio della

trascrizione generale.

5. Il TF II E è il fattore necessario per il riconoscimento della RNA polimerasi da parte del

TF II H, il vero attivatore dell'enzima. Il TF II H è costituito da almeno 9 subunità ed è

fondamentale per il processo di inizio della trascrizione, perché possiede almeno 3 attività

enzimatiche: attività elicasica, attività 3'-5' esonucleasica ed attività chinasica. Le elicasi

sono proteine che in presenza di ATP aprono l'elica, rompendo i legami a idrogeno e

separando i 2 filamenti, con conseguente formazione di superavvolgimenti (ad esse sono

quindi associate anche le topoisomerasi). Le 3'-5' esonucleasi sono capaci di idrolizzare i

legami sintetizzati dall'RNA polimerasi, ed hanno quindi attività proof reading, ovvero

hanno lo scopo di correggere gli errori commessi dall'RNA polimerasi (1 nucleotide ogni

10000 circa). Per quanto riguarda l'attività chinasica del TF II H, bisogna premettere che

la RNA polimerasi II degli eucarioti è un complesso multiproteico costituito da 12

proteine, 5 delle quali costituisco il core catalitico dell'enzima; le 5 subunità in questione

prendono il nome di RBP 1, RBP 2, RBP 3, RBP 6 (identica in tutte e tre tipologie di RNA

polimerasi) e RBP 11; ad esse sono associate altre 7 proteine, chiamate proteine

accessorie. Le 5 proteine del core catalitico sono necessarie ed essenziali; sono assemblate

con forma a chela di granchio, con la parte interna della chela chiamata wall; la RBP 1 e la

RBP 2 sono le proteine di dimensioni maggiori che costituiscono la prima e la seconda

chela; il wall è costituito dall'interfaccia di queste 2 proteine; è proprio questa la zona in

cui è posizionato il sito catalitico dell'enzima. La subunità RBP 1, inoltre, possiede una

lunga catena carbossiterminale costituita da una ripetizione per 52 volte di un

eptapeptide formato, in ordine dagli aminoacidi tirosina, serina, prolina, treonina, serina,

prolina e serina; la presenza di molte serine nella catena carbossiterminale della subunità

RBP 1, associata all'attività chinasica del TF II H, determina un evento chiave

nell'avviamento della trascrizione, ovvero la fosforilazione delle serine di questa catena;

la fosforilazione delle serine determina, infatti, l'attivazione della RNA polimerasi. Tale

fosforilazione ha un codice ben preciso: la fosforilazione esclusiva delle serine 5 è un

segnale di attivazione della RNA polimerasi e di reclutamento delle proteine di

maturazione dell'mRNA; la fosforilazione esclusiva delle serine 2 rende attiva l'RNA

polimerasi, ma è un segnale di reclutamento delle proteine di splicing; la fosforilazione di

entrambe le serine rende inattiva la RNA polimerasi. Altra caratteristica importante di

questo eptapeptide è la presenza della prolina; tale aminoacido va incontro a processo di

isomerizzazione, un processo che costituisce un ulteriore linguaggio di comunicazione

tra la RNA polimerasi e le proteine accessorie.

Inizialmente, quindi, il TF II H ha attività serina 5 chinasica; idrolizza rapidamente ATP ed

aumenta il livello di fosforilazione delle serine 5; la RNA polimerasi subisce la variazione

conformazione di attivazione in modo graduale, via via che le serine 5 vengono

fosforilate. Con la fosforilazione graduale delle serine 5, l'RNA polimerasi inizia la sintesi

di mRNA; il filamento crescente di mRNA viene inserito, man mano che la sintesi di

mRNA procede, nel canale di uscita dell'mRNA presente nell'RNA polimerasi; questo

canale è, però, inizialmente occupato dal finger B del TF II B, che costituisce quindi un

ostacolo per l'mRNA; poiché il canale è inizialmente occupato dal finger B, il processo di

avanzamento della trascrizione è lento all'inizio, ed i primi mRNA sintetizzati vengono

persi (mRNA abortivi); quando la fosforilazione della serina 5 è al livello massimo, la

trascrizione raggiunge la sua velocità massima di 40 nucleotidi sintetizzati al secondo, ed

il finger B viene spinto fuori dal canale, e l'mRNA può finalmente entrare in esso. Con

l'uscita del finger B dal canale di uscita dell'mRNA, TF II B si distacca dall'RNA

polimerasi, e tutto il PIC si disassembla; l'unico fattore a rimanere legato all'RNA

polimerasi è il TF II H, che entra in gioco con le altre attività enzimatiche.

Quando la fosforilazione delle serine 5 è completa, quindi, tutti i fattori TF II, ad eccezione del

TF II H, si allontanano dall'enzima, e la RNA polimerasi risulta attiva per la trascrizione. La

fosforilazione delle serine 5 rappresenta un segnale di riconoscimento per determinate proteine:

innanzitutto vengono reclutati gli enzimi serina 5 fosfatasi (che defosforila la serina 5) e serina 2

chinasi (che fosforila la serina 2), che hanno il compito di bilanciare il livello di fosforilazione

delle serine in posizione 2 e 5; vengono inoltre reclutati i cosiddetti fattori di allungamento,

capaci di stimolare alcune modifiche a cui può andare incontro l'mRNA, tra i quali si trova la

proteina hSPT5 (proteina stimolatore del capping; è un complesso proteico che modifica

l'estremo 5' dell'mRNA) e la proteina TF II S (un fattore di stabilità dell'RNA polimerasi;

quest'ultima tenderebbe a staccarsi dal DNA, ma grazie all'intervento della TF II S essa mantiene

il legame con il DNA).

Quando vengono reclutati gli enzimi serina 5 fosfatasi e serina 2 chinasi, la fosforilazione delle

serine 5 diminuisce mentre la fosforilazione delle serine 2 aumenta. Ci sarà un momento in cui

le 2 posizioni saranno parzialmente fosforilate; in questa fase viene reclutata un'altra proteina, la

TAT SF1, reclutatore dello splicing, capace di discriminare le sequenze esoniche da quelle

introniche; per il reclutamento di questa proteina è necessario, anche, che le proline siano

andate incontro ad isomerizzazione; vengono quindi reclutate le PIN 1 che consentono il

processo di isomerizzazione. Quando la fosforilazione della serina 2 raggiunge il suo livello

massimo, mentre la defosforilazione della serina 5 è totale, il processo di trascrizione è quasi

giunto al termine, e vengono reclutati altre 2 proteine, la serina 2 fosfatasi (che opera la

defosforilazione delle serine 2) ed il complesso di taglio e di poliadenilazione (che promuove la

separazione dell'RNA polimerasi dal DNA ed il rilascio dell'mRNA).

La struttura interna dell'RNA polimerasi è costituita da 5 canali, in cui in 3 di essi ci si accomoda

il DNA, mentre negli altri 2 si accomodano molecole diverse; di questi 2 canali fanno parte il

canale di exit e il canale di uptake. Il canale di exit, o di uscita dell'mRNA, è il canale in cui il TF

II B inizialmente inserisce il proprio finger B; all'interno di esso l'mRNA si appaio con 9

nucleotidi del DNA template, formando un eteroduplex con conformazione A. Il canale di

uptake è invece il canale al cui interno vengono reclutati i ribonucleotidi trifosfato; è un canale

con dimensioni diverse rispetto a quello della DNA polimerasi, poiché i ribonucleotidi hanno

dimensioni maggiori rispetto ai deossiribonucleotidi; a causa di ciò, al suo interno posso entrare

erroneamente deossiribonucleotidi al posto di ribonucleotidi, portando ad un errore di

trascrizione; per prevenire ciò, esistono sistemi di controllo che consentono di discriminare i

ribonucleotidi dai deossiribonucleotidi. Uno dei 3 canali per il DNA è il canale di ingresso del

DNA, che consente l'inserimento del DNA a doppia elica; all'interno della RNA polimerasi la

doppia elica del DNA viene scissa, ad opera di un piccolo dominio di aminoacidi che agisce

come un'incudine, che costringe la doppia elica a separarsi; tale cuneo, inoltre, dirige il

filamento template verso il sito catalitico dell'enzima, portando il filamento non template verso

un altro sito posto lontano dal sito di catalisi (canale per il filamento di DNA non template); il

terzo ed ultimo canale per il DNA è il canale di uscita del DNA, che esce come singola elica e si

assembla all'esterno come doppia elica grazie alla presenza di topoisomerasi nei pressi dell'uscita

dalla RNA polimerasi.

Il meccanismo di catalisi della RNA polimerasi è un meccanismo conservato in tutte le

polimerasi. La polimerizzazione di una sequenza di nucleotidi avviene in direzione 5'-3', e tale

direzione non è casuale, poiché fornisce il margine di errore minore possibile. In questo modo il

3'-OH compie attacco nucleofilo sul 5'-trifosfato del ribonucleotide in aggiunta; in caso di

errore, il ribonucleotide errato verrebbe rilasciato sotto forma di ribonucleotide monofosfato,

ripristinando così l'ultimo ribonucleotide del filamento neosintetizzato, con il 3'-OH libero.

Ciò non avverrebbe se la polimerizzazione avvenisse