Biologia molecolare

La biologia molecolare

Permette di unificare la biochimica e la genetica dal punto di vista dell’approccio metodologico e della finalità. La biochimica serve per comprendere il funzionamento degli esseri viventi a livello chimico con approccio “riduzionistico”, mentre la genetica serve per comprendere i meccanismi di trasmissione dei caratteri ereditari con approccio “olistico”. La biologia molecolare serve quindi per comprendere la trasmissione e il mantenimento dell’informazione genica a livello biochimico-molecolare. Ha permesso di sviluppare tecniche applicabili anche ad altri campi, come la farmacologia. Queste sono utilizzabili a scopo diagnostico, terapeutico, preventivo e sono sfruttate dalla ricerca clinica e preclinica per l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Si possono utilizzare sistemi procariotici, in particolare E. coli, o sistemi eucariotici, in particolare gli animali transgenici.

Gli acidi nucleici

La manipolazione degli acidi nucleici dipende dalla loro struttura e dalle loro proprietà chimico-fisiche, che dipendono dalla natura dei nucleotidi che li compongono. Gli acidi nucleici sono il DNA (acido deossiribonucleico) e l’RNA (acido ribonucleico) che sono catene polinucleotidiche costituite da nucleotidi uniti in modo sequenziale attraverso un legame fosfodiesterico.

Ciascun nucleotide è costituito da tre componenti:

• Un carboidrato pentoso: desossiribosio per il DNA e ribosio per l’RNA. I due zuccheri differiscono per la presenza di un -H (desossiribosio) e di un -OH (ribosio) in posizione 2’;
• Un gruppo fosfato legato al carbonio 5’ del pentoso mediante un legame fosfoestereo;
• Una base azotata legata al carbonio 1’ del pentoso mediante un legame La-N-glicosidico.

La base azotata si lega al di sopra del piano dello zucchero pentoso (conformazione e il legame avviene mediante l’N 9 delle basi puriniche o l’N 1 delle basi pirimidiniche). Le basi puriniche derivano dalla condensazione di due anelli contenenti atomi di N, e sono adenina e guanina. Invece le basi pirimidiniche presentano un solo anello eterociclico contenente N, e sono la citosina sia nel DNA che nell’RNA, la timina soltanto nel DNA e l’uracile soltanto nell’RNA. Le basi si differenziano tra loro soltanto per la natura dei sostituenti legati agli anelli eterociclici.

Esistono 4 deossiribonucleotidi, che differiscono per la base azotata presente: deossiadenosina, deossiguanosina, deossitimidina e deossicitidina. I nucleosidi sono composti soltanto dalla base azotata e dallo zucchero, mentre i nucleotidi sono costituiti dal nucleoside legato al gruppo fosfato in posizione 5’. I deossiribonucleotidi possono essere simboleggiati con A, G, T e C oppure con dA, dG, dT e dC (“d” indica che è un deossiribonucleotide) oppure con dAMP, dGMP, dTMP e dCMP. I nucleotidi possono essere fosforilati e formare i derivati di-fosforilati e tri-fosforilati: il primo fosfato legato al C 5’ dello zucchero viene indicato come e può legare il gruppo fosfato mediante un legame fosfoanidridico, che a sua volta può legare il gruppo fosfato (la nomenclatura dei gruppi fosfati è fondamentale nei processi di marcatura). Se non è specificata la base azotata presente nel nucleotide, esso viene indicato come NMP (forma mono-fosforilata), NDP (forma di-fosforilata) o NTP (forma tri-fosforilata).

I nucleotidi possono contenere anche basi puriniche e pirimidiniche minori, che non hanno una rilevanza funzionale minore ma sono presenti in percentuale nettamente inferiore. Le basi minori del DNA sono la 5-metil-citidina, la N6-metil-adenosina, la N2-metil-guanosina e la 5-idrossi-metil-citidina: si ottengono dalla modificazione delle basi maggiori. Sono fondamentali perché la modifica chimica delle basi azotate maggiori forma nucleotidi che sono punti di aggancio per specifiche proteine, punti importanti per la regolazione dell’espressione genica o per l’attivazione dei meccanismi di riparazione del DNA. Le basi minori dell’RNA derivano da modifiche ancora più fini e sono l’inosina, la pseudouridina, la 7-metil-guanosina e la 4-tiouridina. Queste permettono l’acquisizione della struttura secondaria, senza la quale l’RNA non può legare le proteine ed esplicare la sua funzione.

Il legame tra nucleotidi è fosfodiestereo e si forma tra il gruppo -OH legato al carbonio 3’ dello zucchero e il gruppo fosfato in posizione di un nucleotide trifosfato. Così si forma un legame covalente che determina la liberazione del fosfato e del fosfato sotto forma di pirofosfato, che viene scisso in 2 molecole di fosfato inorganico dalle fosfatasi. La formazione del legame fosfodiestereo è catalizzata dalla DNA polimerasi o RNA polimerasi.

Le caratteristiche comuni alle catene di DNA e RNA sono:

• Idrofilia: grazie alla presenza dei gruppi fosfato che presentano cariche negative, e dei gruppi -OH (nell’RNA). Quindi le catene polinucleotidiche sono solubili in acqua;
• Direzionalità: è possibile distinguere l’estremità 5’ e l’estremità 3’. Lo scheletro covalente formato da fosfati e pentosi determina la disposizione delle basi azotate tutte e sempre dallo stesso lato rispetto ad esso. In questo modo, alla molecola viene imposta una precisa direzionalità 5’→3’ perché la disposizione delle basi azotate dallo stesso lato impone una polarità;
• Stabilità: sono molecole stabili a temperatura ambiente e in ambiente acquoso, dato che tutti i legami sono covalenti. Quindi vengono degradate solo in presenza di specifici enzimi: DNAsi e RNAsi, enzimi idrolitici che rompono il legame fosfodiestereo (per accorciamento o frammentazione della catena). La stabilità può variare quando la catena viene esposta a elevate temperature e a pH acidi o basici.

Proprietà chimico-fisiche delle basi azotate

Sono composti moderatamente basici, idrofobici (poco solubili in acqua a pH fisiologico) e altamente coniugati. La coniugazione determina una precisa disposizione spaziale: le basi sono planari quindi si dispongono su un unico piano. La planarità permette l’interazione tra le basi mediante:

• Interazioni da impilamento idrofobico o forze di van der Waals: si formano tra le basi azotate di nucleotidi adiacenti nella catena e permettono la disposizione delle basi dallo stesso lato dello scheletro covalente (disposizione energicamente favorita). Durante lo scorrimento di alcuni sistemi di riparazione, la base azotata in esame viene esposta dal lato opposto rispetto alle altre per verificarne il corretto inserimento. Poi viene rimessa dal lato corretto;
• Legami idrogeno: si instaurano tra gli atomi O, N e H delle basi azotate appartenenti ai gruppi carbossilici e amminici. Si formano 2 legami idrogeno tra adenina e timina (o uracile) e 3 tra guanina e citosina.

Le basi azotate possono esistere fisiologicamente in 2 o più forme tautomeriche. Adenina e citosina possono essere presenti nella forma amminica (con un gruppo amminico esociclico) o nella forma imminica (con un atomo di H del gruppo amminico che viene spostato su un atomo di N della base azotata diverso da quello esociclico). Invece guanina, timina e uracile possono essere presenti nella forma chetonica o nella forma enolica.

La conversione tra le diverse forme è fisiologicamente possibile. La forma amminica e quella chetonica sono le più stabili e quindi quelle maggiormente presenti nei nucleotidi. Anche le altre forme sono presenti a livello fisiologico e, quando sono presenti nella catena, possono provocare problemi negli accoppiamenti perché cambiano i gruppi donatori e accettori di legami idrogeno presenti nella struttura. Questi scambi di accoppiamento provocano problemi nella replicazione del DNA perché la DNA polimerasi che incontra un’adenina in forma imminica incorpora una citosina nel filamento neo-sintetizzato. Una seconda replicazione del DNA determinerà l’inserimento della guanina, generando quindi una mutazione.

L’adenina, che normalmente forma 2 legami idrogeno con timina/uracile, in forma imminica forma legami idrogeno con la citosina. La forma imminica della citosina forma 2 legami idrogeno con l’adenina. La guanina forma 3 legami idrogeno con una timina presente in forma enolica.

Le basi azotate possono subire modificazioni chimiche spontanee o indotte (ne avvengono milioni quotidianamente). Gli agenti deamminanti sono mutageni e cancerogeni. Tra queste ricordiamo le reazioni di deaminazione, che consistono nella perdita di gruppi amminici esociclici delle basi azotate e possono essere spontanee oppure indotte da agenti deamminanti (sodio nitrito, sodio nitrato e nitrosammine). Un’altra modificazione è la reazione di alchilazione, che prevede l’aggiunta di gruppi metilici o etilici alle basi azotate. I donatori di gruppi alchilici sono agenti alchilanti e possono essere molecole endogene (S-adenosil-metionina) oppure esogene (dimetil-nitrosammine, dimetil-solfato e mostarde azotate). Varie basi possono subire la reazione di alchilazione, la più suscettibile è la guanina, la cui metilazione determina la formazione dell’O6-metilguanina. La guanina è la base più suscettibile perché il suo prodotto di metilazione causa un’alterazione nell’accoppiamento: la O6-metilguanina perde la capacità di formare un legame idrogeno legata all’atomo di O in posizione 6 e quindi si accoppia con la timina invece che con la citosina.

Le modificazioni chimiche possono essere indotte anche da agenti fisici, come le radiazioni. La luce UV determina la formazione di legami covalenti tra i due C5 e i due C6 delle due basi oppure tra il C4 di una base e il C6 dell’altra. La formazione di questi legami altera la disposizione spaziale della catena. Le basi azotate e gli acidi nucleici assorbono la luce UV: ciascuna base possiede un massimo di assorbimento a una lunghezza d’onda caratteristica, ma si ritiene che il massimo di assorbimento medio degli acidi nucleici sia 260 nm.

Struttura del DNA

La struttura primaria degli acidi nucleici consiste nell’esatta sequenza dei nucleotidi e può essere scritta a singola lettera. Per esempio la dicitura 5’-pdAdCdGdTOH indica che l’estremità 5’ è fosforilata e l’estremità 3’ presenta un gruppo -OH libero.

Struttura secondaria

Nelle cellule però il DNA è presente nella forma di struttura secondaria che prevede la formazione di 2 filamenti. La struttura secondaria è stata determinata mediante: dati biofisici che con la misurazione della densità del DNA in una fibra hanno permesso di identificare il numero di filamenti e la distanza tra i nucleotidi; profili di diffrazione ai raggi X che hanno identificato la natura elicoidale del DNA. Esperimenti successivi hanno stabilito che la doppia elica di DNA possiede una specifica composizione in basi, mediante dati raccolti nelle regole di Chargaff:

• La composizione in basi del DNA varia da una specie all’altra;
• Il DNA purificato da diversi tessuti della stessa specie ha la stessa composizione in basi (specie-specifica);
• La composizione in basi del DNA di una specie non varia al variare dell’età, dello stato nutrizionale o di stimoli dell’ambiente circostante;
• Per ogni specie, la percentuale di [G + C] non è necessariamente uguale alla percentuale di [A + T] ma può variare dal 22% al 73% in base all’organismo;
• In tutti i DNA analizzati, indipendentemente dalla specie, A = T e G = C quindi [A + G] = [T + C].

Il DNA è una destrorsa in cui le basi sono complementari. Le catene, per consentire il corretto posizionamento delle basi azotate e la loro planarità, devono essere disposte in direzione antiparallela. Le 2 catene antiparallele si dispongono in modo da avere le cariche dei gruppi fosfati rivolte verso l’esterno e le basi azotate idrofobiche rivolte verso l’interno dei 2 filamenti, in modo che formino i legami idrogeno che stabilizzano la struttura a doppio filamento. Altri tipi di legame che stabilizzano il doppio filamento sono: interazioni idrofobiche da impilamento e interazioni elettrostatiche. Queste vengono contratte con le proteine, dato che il DNA non è mai presente allo stato nudo né nei procarioti né negli eucarioti. Le interazioni elettrostatiche si formano tra le cariche positive dei residui amminoacidici delle proteine e le cariche negative dei gruppi fosfato della catena polinucleotidica.

Le proteine che legano il DNA hanno funzioni: strutturali e di impacchettamento, di trasporto e localizzazione, di metabolismo e riarrangiamento, regolazione dell’espressione genica. Possono legarsi alle estremità, a regioni interne della molecola o sulla sua superficie (formando avvolgimenti parziali o completi detti interazioni superficiali) oppure mediante alloggiamento in specifiche fenditure. Le proteine interagiscono con il DNA mediante legami idrogeno, forze di van der Waals e interazioni idrofobiche e si possono formare diverse interazioni:

• Tra le catene laterali degli amminoacidi e le basi azotate;
• Tra lo scheletro covalente delle proteine (legame peptidico) e le basi azotate;
• Tra le catene laterali degli amminoacidi e lo scheletro covalente dell’acido nucleico (zucchero-fosfato);
• Tra lo scheletro covalente delle proteine e lo scheletro covalente dell’acido nucleico.

Affinché una proteina si leghi a una sequenza specifica per effettuare una lettura diretta delle basi azotate contenute nella specifica regione, è necessario che le basi siano accessibili per la proteina. Questa interazione è possibile perché le basi si stratificano nella parte interna della doppia elica e l’impilamento delle basi si ottiene grazie alla loro disposizione l’una di fronte all’altra in modo non esattamente simmetrico: quindi lo scheletro covalente non risulta spaziato in modo uniforme.

L’asimmetria della disposizione spaziale delle basi determina la formazione di 2 tipi di scanalature: il solco maggiore o principale, più ampio e profondo, e il solco minore, più stretto e meno profondo. I solchi permettono l’accesso all’informazione contenuta nella doppia elica senza dover distruggere la struttura elicoidale. Il fondo dei solchi permette di esporre le basi azotate, dotate di atomi e gruppi atomici donatori/accettori di legami idrogeno. La maggior parte delle proteine che si legano in modo sequenza-specifico per lettura diretta interagiscono con il solco maggiore.

Inoltre, i solchi maggiori e minori forniscono informazioni chimiche differenti: lo schema con cui si dispongono gli atomi e i gruppi atomici che possono formare legami idrogeno, è diverso per le coppie A-T e C-G ma anche in base al filamento considerato. Il solco maggiore fornisce maggiori informazioni perché gli schemi di formazione dei legami idrogeno sono differenti a seconda che C si trovi sul filamento 5’→3’ e G si trovi sul filamento 3’→5’ o viceversa. Ad esempio, leggendo da sinistra a destra il solco maggiore nell’immagine sotto, se la coppia è G-C si hanno due gruppi accettori seguiti da un gruppo donatore, mentre se la coppia è C-G si ha un gruppo donatore seguito da due gruppi accettori. Il solco minore, invece, è meno informativo perché lo schema è identico: si ha la sequenza accettore-donatore-accettore indipendentemente dalla disposizione delle basi.

Nel caso della coppia A-T, invece, il solco maggiore fornisce una maggiore informazione chimica perché il gruppo metilico di T può disporsi in posizione differente a seconda della presenza delle basi sui due filamenti. Quindi può formare interazioni idrofobiche con le catene laterali dei residui amminoacidici in modi differenti a seconda di come è disposto.

La molecola di DNA è altamente eterogenea e flessibile: ciò è dovuto al fatto che i legami covalenti presenti nello scheletro hanno una certa possibilità di rotazione, che è limitata a seconda del tipo di legame. Per esempio, possono ruotare intorno al legame con una possibilità di N-glicosidico, rotazione maggiore per le basi azotate puriniche: i residui di A e G possono presentarsi in conformazione sin o anti. La possibilità di rotazione delle basi pirimidiniche è inferiore e infatti la loro conformazione più energicamente stabile è quella anti.

Anche lo zucchero non ha una struttura strettamente planare, ma può esistere in conformazioni diverse a seconda della disposizione sopra o sotto il piano dei gruppi in 2’ e 3’: le conformazioni C-2’ endo e C-3’ endo hanno l’atomo di carbonio sopra al piano, mentre le conformazioni C-2’ eso e C-3’ eso hanno l’atomo di carbonio al di sotto.

La flessibilità del DNA è confermata da analisi cristallografiche ai raggi X. Le catene oligonucleotidiche possono assumere diverse disposizioni strutturali, di cui le più stabili sono:

• Forma B: forma di DNA maggiormente presente in condizioni fisiologiche e maggiormente compatibile con l’ambiente acquoso e con il grado di salinità che caratterizzano l’ambiente cellulare. È una doppia elica destrorsa che gira in senso orario quando viene osservata lungo un asse longitudinale immaginario;
• Forma A: forma di DNA assunta diminuendo il contenuto di acqua e aumentando la salinità dell’ambiente, come avviene durante la cristallizzazione. È un’elica destrorsa in cui le basi sono inclinate rispetto al piano longitudinale immaginario perché la conformazione dei legami è anti (come per la forma B), ma la conformazione del pentoso è C-3’-endo. Si presenta più corta e più ampia a parità di numero di nucleotidi. Si ritiene poco probabile si ritrovi in lunghe sezioni dell’acido nucleico.