Biologia molecolare

DNA

I genomi differiscono tra loro per un ampio grado di complessità, che è stato evidenziato con esperimenti sulla cinetica di riassociazione: i genomi resi a singolo filamento per denaturazione possono riassociarsi a formare il DNA a doppio filamento. Più complesso è il genoma e maggiore è la velocità con cui i filamenti si riassociano. I dati sono stati confermati grazie al sequenziamento completo o quasi dei genomi delle diverse specie.

La grandezza del genoma aumenta con la complessità dell'organismo e quasi sempre si può affermare che il numero di cromosomi è in linea con la complessità del genoma. La densità genica è il numero di geni contenuti in una regione di genoma costituita da 1 milione di paia di basi e diminuisce progressivamente e in modo altamente significativo con l'aumentare della complessità del genoma. Questo può essere dovuto al fatto che aumentando la dimensione

per tRNA e rRNA;meno dello 0,1% è rappresentato da elementi genetici mobili (sequenze di DNA che possiedono la capacità autonoma di muoversi, mediante un meccanismo replicativo o conservativo, all'interno del genoma batterico).

Nonostante il genoma di E. coli contenga geni isolati la cui espressione è regolata in maniera a sé stante, molto spesso i geni che codificano per proteine coinvolte in una specifica via metabolica sono localizzati uno vicino all'altro e costituiscono gli operoni. L'espressione di questi geni è regolata da un'unica regione, ma ciascuno di essi produce una specifica proteina. La maggior parte di questi geni non presentano sequenze introniche: tramite la trascrizione del DNA si ottiene un trascritto primario che non deve essere ulteriormente processato e maturato.

Il genoma nucleare umano è costituito da più di 3 miliardi di coppie di basi, che in un genoma aploide si distribuiscono su 22 cromosomi.

autosomici e 2 su cromosomi eterosomici. Attualmente, circa il 99% del genoma nucleare umano è stato sequenziato. Solo il 28% del genoma è occupato da geni o sequenze a esso associate, di cui solo l'1,5% è costituito da sequenze geniche che codificano per le proteine. I geni codificanti possono essere presenti in copia multipla oppure in un basso numero di copie ripetute (geni che codificano per famiglie proteiche o famiglie multigeniche, come i geni che codificano per i recettori steroidei e quelli che codificano per le globine). Il restante 26% circa comprende sequenze che non codificano per proteine (DNA associato ai geni): contrae una relazione con i geni che codificano per le proteine e comprende:

• Introni: sequenze del trascritto primario che vengono eliminate durante la maturazione dell'mRNA;
• Sequenze UTR (regioni non tradotte): sequenze che restano presenti nel trascritto maturo usato dai ribosomi per la produzione della proteina, ma che

non vengono tradotte in amminoacidi. Contengono elementi che possono regolare la stabilità degli RNA oppure regolare l'efficienza della traduzione;

• Sequenze regolatorie: regolano la quantità di mRNA che può essere prodotto e sono ipromotori, gli enhancer, i silenziatori, gli isolatori;
• Geni di RNA funzionali non codificanti: rRNA, tRNA, snRNA (piccoli RNA nucleari), snoRNA (piccoli RNA nucleolari), scRNA (piccoli RNA citoplasmatici) e microRNA. I piccoli RNA sono fondamentali per il processo di trascrizione;
• Frammenti genici: frammenti delle sequenze nucleotidiche che presi singolarmente non hanno funzionalità specifica, ma che dopo essere assemblati gli uni con gli altri formano nuovi geni;
• Pseudogeni: sequenze nucleotidiche con elevata omologia con i geni funzionali, ma che non sono funzionali perché non hanno il promotore o hanno troppe mutazioni nella porzione codificante (non vengono trascritti o il prodotto non è

struttura propria compresa tra un sito di inizio e un sito di terminazione. È un'unità funzionale perché il prodotto genico finale (RNA o proteina) svolge una propria funzione. Ha la "potenzialità" di essere espresso perché la sua espressione dipende dal tipo cellulare e dagli stimoli esterni, perciò i livelli di espressione di ciascun gene sono altamente variabili.

La quantità di mRNA che viene usato per la sintesi delle proteine rappresenta circa il 3-10% dell'RNA totale della cellula: generalmente è il 3-5% e può raggiungere il 10% nelle cellule pancreatiche caratterizzate da un'attiva sintesi proteica.

Il 90-93% dell'RNA totale è costituito da RNA non codificante, che comprende l'rRNA (80%), il tRNA (15%) e in percentuale minore gli snRNA e gli snoRNA (per la maturazione dei trascritti precursori da cui origina l'RNA funzionale), gli scRNA (per il trasporto intracellulare).

delle proteine), i microRNA27(regolano la stabilità dell'RNA e partecipano alla regolazione dell'espressione genica), l'RNAtelomerasico (per la formazione della telomerasi, che permette di mantenere integre le estremità dei cromosomi) e gli RNA catalitici (con dimensioni variabili e la capacità di aumentare la velocità di reazione di specifici RNA, vengono definiti ribozimi). Anche nelle cellule procariotiche possono essere presenti dei piccoli RNA: RNA guida che servono per il processamento degli mRNA, RNA regolatori che regolano l'espressione dei geni e RNA catalitici che mediano il rimaneggiamento di altri RNA.

Le cellule di E. coli contengono circa 4.000 proteine (equiparabile al numero di geni del genoma) mentre le cellule umane contengono circa 65.000-70.000 proteine (non sempre espresse contemporaneamente). È quindi emerso che l'associazione 1 gene-1 proteina non può essere valida, mentre è possibile

L'associazione 1 proteina-1 gene. Ciò è possibile grazie a modificazioni a livello trascrizionale, traduzionale e post-traduzionali. Le modificazioni a livello trascrizionale comprendono:

• Splicing alternativo: è uno dei meccanismi mediante il quale le cellule possono produrre 2 o più proteine a partire da un solo gene;
• RNA editing;
• Utilizzo di siti di inizio e di terminazione della trascrizione alternativi.

Le modificazioni a livello traduzionale comprendono l'utilizzo di siti di inizio e di terminazione della traduzione alternativi e la presenza di geni sovrapposti. Questi permettono di ottenere diverse proteine dalla stessa sequenza di mRNA, usando siti di inizio differenti e quindi leggendo la sequenza di RNA in modo sfalsato. Le modificazioni post-traduzionali permettono di ottenere 120.000 proteine differenti.

5-TRASCRIZIONE

Consente di copiare specifiche regioni di DNA generando molecole di RNA a singolo filamento, molto eterogeneo.

dal punto di vista funzionale e strutturale ma con una sequenza nucleotidica identica a uno dei 2 filamenti di DNA da cui deriva. Il meccanismo di trascrizione è semplice e altamente conservato nelle cellule procariotiche ed eucariotiche, mentre i processi di regolazione sono più variabili e complessi.

È catalizzato dall'RNA POLIMERASI DNA-DIPENDENTE che ha una struttura molecolare abbastanza complessa e, dopo essersi legata al DNA, crea una zona denaturata definita bolla di trascrizione che fornisce il filamento di DNA stampo. Lo scorrimento dell'enzima lungo il filamento di DNA permette la sintesi del nuovo filamento di RNA: la bolla di trascrizione procede lungo il filamento in corrispondenza dell'enzima e, mentre avviene l'allungamento del nuovo filamento, il DNA che esce dall'enzima si richiude posteriormente.

La trascrizione è un processo di polimerizzazione e avviene in 3 fasi:

1. Inizio: l'RNA polimerasi si lega a un sito
specifico sul DNA;
1. Allungamento: l'RNA polimerasi migra lungo la molecola di DNA sintetizzando la molecola di RNA;
2. Terminazione: l'RNA polimerasi si dissocia dal DNA rilasciando il nuovo filamento di RNA.
La trascrizione copia solo alcune regioni del genoma, che vengono definite unità trascrizionali. Queste non vengono scelte in modo casuale perché sono fisicamente delimitate da una sequenza solitamente posizionata all'inizio del gene da trascrivere (PROMOTORE), a cui si lega l'RNA polimerasi, e da una sequenza posizionata alla fine del gene (TERMINATORE). Il promotore spesso contiene anche il nucleotide da cui inizia la trascrizione (sito di inizio della trascrizione o TSS). Per convenzione, al nucleotide sito di inizio di trascrizione viene attribuito il valore numerico +1, la regione a monte del sito viene definita regione upstream e i nucleotidi che la compongono hanno valore numerico negativo. La sequenza a valle del sito viene definita regione.

downstream (prossimale o distale in base a quando è lontana dal nucleotide +1) e i nucleotidi che la compongono hanno valore numerico positivo.