Biologia Molecolare - Traduzione e Sintesi Proteica

Un'altra molecola coinvolta nel processo di traduzione è il tRNA o RNA transfer, sintetizzato a

partire da geni di III tipo. Il tRNA è una piccola catena di RNA, costituita mediamente da circa

80-90 nucleotidi, avente lo scopo di trasferire un aminoacido specifico ad una catena

polipeptidica in crescita al sito ribosomale della sintesi proteica durante la traduzione. La sua

struttura planare ha la forma di un trifoglio, mentre nello spazio la sua conformazione

tridimensionale è caratterizzata da una forma ad L rovesciata. L'estremità 5' viene sempre

rappresentata a sinistra, mentre quella 3' a destra; esse si trovano appaiate formando un doppio

filamento, grazie alla presenza in 5' di una sequenza invertita e complementare a quella presente

in 3'; si forma una doppia elica che costituisce il cosiddetto braccio accettore del tRNA; la

tripletta di basi terminale in 3' è costante ed è rappresentata dalla tripletta CCA; il gruppo

ossidrilico in 3' o in 2' dell'ultima adenina è sfruttato per l'attacco dell'aminoacido. E' presente

un secondo braccio, chiamato braccio D, costituito da uno stelo e da un'ansa, con un'alta

percentuale di base modificata, la diidrouridina. Un'ulteriore struttura a stelo ed ansa costituisce

il braccio A, detto anche braccio dell'anticodone; la struttura dell'ansa è costituita da 7

nucleotidi, 3 dei quali costituiscono la tripletta dell'anticodone, che riconoscerà il

corrispondente codone a 3 basi dell'mRNA, attraverso l'appaiamento di basi complementari; se

ne deduce che la tripletta dell'anticodone non è costante ma è variabile da tRNA a tRNA; di

conseguenza, a causa della variabilità della tripletta dell'anticodone, ogni molecola di tRNA

potrà legare un solo tipo di aminoacido, ovvero quello corrispondente al codone di mRNA

riconosciuto. Un altro braccio che costituisce la struttura del tRNA è il braccio T , con struttura

sempre a stelo-ansa, che presenta al suo interno una base modificata, la pseudouridina. E' inoltre

presente un braccio variabile oltre a quelli già citati. L'alto numero di basi modificate,

soprattutto a livello del braccio D e T, concorre a stabilizzare la forma spaziale del tRNA ad L

rovesciata; il braccio D ed il braccio T collassano su se stessi, determinando la struttura ad L

rovesciata; le dimensioni di tale struttura sono costanti in tutte le molecole di tRNA, ed in

particolare le due aste avranno una dimensione pari a 60 mentre la distanza tra lo stelo

Å,

accettore e l'anticodone sarà pari a 76 la massima distanza raggiungibile all'interno del tRNA;

Å,

tali misure sono importanti per il legame del tRNA con l'enzima deputato al trasferimento

dell'aminoacido corretto su di esso.

Come detto precedentemente, all'estremità 3' del tRNA c'è una tripletta uguale per tutti i

tRNA, ovvero la tripletta CCA, una sequenza accettore che lega l'aminoacido tramite un

processo di aminoacilazione mediato dalla tRNA aminoacil sintetasi. Questa tripletta non è

codificata dal gene, ma viene aggiunta successivamente dalla tRNA nucleotidil transferasi; tale

enzima non possiede alcun gruppo prostetico, ed ha un sito catalitico simile a quello delle RNA

polimerasi; possiede 2 ioni magnesio, aventi scopi uguali a quelli presenti nelle altre polimerasi;

nel sito catalitico, inoltre, sono presenti degli aminoacidi aventi la capacità di formare un alto

numero di legami ad idrogeno esclusivamente con l'adenina e con la citosina; inizialmente il

sito catalitico ha una conformazione tale da poter essere affine 1000 volte più alla citosina

piuttosto che alla adenina, e di conseguenza il primo nucleotide che verrà aggiunto all'estremo

3' del tRNA possiederà una citosina; successivamente, il sito catalitico subisce una variazione

conformazionale che aumenterà ulteriormente l'affinità di questo verso la citosina,

consentendo quindi l'aggiunta di un ulteriore nucleotide avente una citosina; a questo punto il

sito catalitico subisce un'ulteriore variazione conformazionale che determinerà una maggiore

affinità questa volta verso l'adenina piuttosto che verso la citosina, consentendo quindi

l'aggiunta di un nucleotide avente adenina; un'ultima variazione conformazionale del sito

catalitico fa perdere completamente affinità all'enzima verso la tripletta aggiunta, determinando

il distacco dell'enzima ed il ritorno della sua conformazione verso quella iniziale.

Il codice genetico all'interno dell'mRNA è organizzato in triplette chiamate codoni, ognuno dei

quali codificante per un aminoacido (ad eccezione dei codoni di stop). Alcuni aminoacidi sono

codificati da più di un codone, ad eccezione della metionina e del triptofano, codificati da un

solo tipo di codone. Tuttavia, secondo la teoria della base vacillante di Crick, poiché

l'anticodone non ha una sequenza planare, il terzo nucleotide del codone può anche appaiarsi in

modo scorretto con l'anticodone; per questo motivo, un anticodone può riconoscere più

codoni; per tale motivo, i tRNA sono in numero inferiore rispetto ai codoni, e ne esistono

infatti 44 tipi. Un aminoacido può legare più tipologie di tRNA, che in questo caso vengono

detti isoaccettori, e questo legame avviene attraverso l'enzima sopracitato tRNA aminoacil

sintetasi, che possiede 2 siti di riconoscimento, uno per lo stelo accettore del tRNA ed uno per

l'anticodone. Questo enzima catalizza la reazione di esterificazione di uno specifico aminoacido

ad uno dei possibili tRNA corrispondenti; esso lega inizialmente una molecola di ATP; quindi,

con un processo di adenililazione, trasferisce l'ATP sul corrispondente aminoacido, a formare

un aminoacido adenililato, rendendo il gruppo carbossilico dell'aminoacido energeticamente

attivato, e rilasciando una molecola di pirofosfato, la cui energia verrà trasferita interamente al

legame acilico che si verrà a formare tra il tRNA e l'aminoacido; l'enzima subisce quindi una

variazione conformazionale che lega la molecola di tRNA appropriata, spostando l'aminoacido

adenililato alla coda 3' della molecola del tRNA, ed in particolare all'adenina della tripletta CCA

dello stelo accettore; si forma un legame acilico tra il -COOH dell'aminoacido e l'OH in

posizione 2' o 3' dello zucchero legato all'adenina; a questo punto l'AMP legato all'enzima

viene eliminato. Esistono 20 tipologie di tRNA aminoacil sintetasi; se ne deduce quindi che

questi siano più specifici verso gli aminoacidi piuttosto che verso i tRNA, perché gli aminoacidi

sono strutturalmente più piccoli dei tRNA, e questi ultimi possono essere riconosciuti in più

punti della loro struttura. I tRNA aminoacil sintetasi, inoltre, possono essere suddivisi in 2

principali classi, una classe a struttura monomerica, capace di legare l'aminoacido a livello del 2'-

OH dell'adenina (tRNA aminoacil sintetasi di I classe), ed una classe a struttura dimerica, capace

di inserire l'aminoacido a livello del 3'-OH dell'adenina (tRNA aminoacil sintetasi di II classe).

L'enzima presenta 2 solchi per il riconoscimento del tRNA corretto; in un primo solco viene

alloggiato lo stelo 3' accettore sul quale avverrà la reazione catalitica, mentre nel secondo solco

viene alloggiato l'anticodone del tRNA; per evitare l'aggiunta di un aminoacido scorretto ad un

tRNA, tutti i tRNA isoaccettori condividono un identico stelo accettore tra di loro. Il

riconoscimento dell'aminoacido avviene grazie ad un sito di riconoscimento all'interno del

quale viene alloggiato l'aminoacido; mentre alcuni aminoacidi sono diversi tra loro

strutturalmente e per quanto riguarda i gruppi all'interno della loro struttura, altri aminoacidi

sono invece molto simili tra loro, ed il loro riconoscimento può essere fraudolento; è il caso

della isoleucina e della valina, che differiscono tra loro solo per un gruppo metile (in più nella

isoleucina); per evitare che l'enzima leghi un aminoacido scorretto nel suo sito di

riconoscimento, è presente un ulteriore sito, chiamato sito correttore di bozze o sito di

espulsione idrolitica, avente dimensioni minori rispetto al sito catalitico; l'enzima legherà

l'aminoacido all'interno del suo sito di riconoscimento, catalizzerà la formazione del legame tra

l'aminoacido e il tRNA, ed una variazione conformazionale dell'enzima sposterà lo stelo

accettore legato all'aminoacido verso il sito di espulsione idrolitica; se l'aminoacido legato al

tRNA non riuscirà ad alloggiare all'interno di tale sito, esso non verrà idrolizzato perché

corrisponderà all'aminoacido corretto, ed il tRNA legato all'aminoacido verrà rilasciato

dall'enzima; qualora l'aminoacido legato al tRNA riuscisse ad alloggiare all'interno del più

piccolo sito di correzione di bozze, verrà idrolizzato perché corrisponderà ad un aminoacido

scorretto; prendendo infatti l'esempio della isoleucina e della valina (la prima più grande

dell'altra), l'enzima specifico per la isoleucina, qualora legasse la valina, riuscirebbe a legare la

valina all'interno del sito di correzione di bozze e riconoscerebbe la valina come aminoacido

errato, mentre nel momento in cui lega la isoleucina, questa non riuscirebbe ad alloggiare nel

sito di espulsione idrolitica perché di dimensioni maggiori rispetto al sito, e verrebbe

riconosciuta come aminoacido corretto. In caso di errore, l'aminoacido scorretto viene

idrolizzato e viene rilasciato, assieme al tRNA libero.

La sintesi proteica inizia con la separazione delle 2 subunità del ribosoma, per favorire

l'inserimento dei fattori di inizio. Il fattore eIF3 lega la subunità minore in corrispondenza del

sito E, mentre eIF6 lega la subunità maggiore in prossimità del suo sito catalitico; essi tengono

separate le 2 subunità, poiché provocano una modifica conformazionale di entrambe che ne

favorisce la separazione. La subunità minore libero recluta quindi un trimero costituito dal

fattore eIF1A, che si legherà al sito A, dal fattore eIF5, che si accomoda in prossimità del sito P,

provocandogli una variazione conformazionale che gli consentirà il legame esclusivamente al

tRNA della metionina iniziatore, e dal fattore eIF4F. L'aggiunta di questo trimero lascia libero

soltanto il sito P, che a questo punto sarà l'unico sito che il tRNA legante metionina iniziatore

potrà riconoscere. La certezza che il tRNA ad essere legato nel sito P sia quello iniziatore è

controllata, oltre che dalla modifica conformazionale indotta da eIF