Biologia molecolare

TFIIA,

Dopo TFIID si lega al complesso che ha la doppia

funzione di stabilizzare il complesso TFIID-DNA e di

impedire il legame di repressori che potrebbero interferire

con la formazione del complesso di pre-inizio PIC.

TFIIB,

Successivamente, al complesso si lega che ha il

compito di posizionare precisamente Pol II sul sito

d’inizio, “misurandone” la distanza dalla TATA box. Infatti,

mutazioni nel gene codi cante TFIIB fanno sì che il

trascritto abbia un sito d’inizio alterato. TFIIB interagisce

con la TBP e il DNA, grazie alla piegatura indotta da TBP a

monte e a valle della TATA box, è in grado d’interagire

anche con la polimerasi, che si associa al complesso

TFIIF.

aiutata da

Si è vista la presenza nella regione N-terminale di TFIIB di

un dominio che, attraverso un lungo loop, si inoltra all’interno dell’enzima no alla

regione del suo sito attivo. Questo loop, denominato dito B (B- nger), si trova nella

stessa regione dell’ibrido RNA-DNA nel complesso che sta trascrivendo e tale posizione

non interferisce, ma anzi stabilizza la struttura dell’ibrido RNA-DNA. Quando l’RNA

supera i 5 o 6 nt, deve competere con TFIIB per lo spazio nella cavità di Pol II. Se TFIIB

ha la meglio, si ha una sintesi abortiva e la trascrizione deve re-iniziare; se, invece, la

catena crescente di RNA riesce a superare i 6 nt, TFIIB viene espulso dalla cavità di Pol

II, che si può così staccare dal promotore dando inizio alla fase di allungamento.

La coda C-terminale (CTD) di Pol II è libera e non modi cata. Quando, però, si forma il

TFIIE e TFIIH.

complesso con l’RNA polimerasi, intervengono altri due fattori, TFIIE ha

la funzione di reclutare TFIIH nel complesso e TFIIH, che è costituito da 10 subunità, ha un

duplice ruolo. Il primo è quello di aprire il DNA mediante la sua attività elicasica ATP-dipendente e

di formare, quindi, il complesso di trascrizione “aperto”. L’altra funzione essenziale di TFIIH è

quella di fosforilare il CTD. Questa modi cazione della coda CTD, cambiando la qualità delle

interazioni tra il CTD e i vari componenti del PIC, promuove il distacco di Pol II dal promotore e

permette l’inizio della fase di allungamento della trascrizione.

I fattori basali e la polimerasi sono in grado di trascrivere in vitro un DNA nudo a partire dal

promotore. Nelle cellule in vivo, però, occorrono altri

componenti che, da una parte, modi cano la

cromatina per permettere al DNA di essere trascritto

e, dall’altra, portano a livelli di trascrizione elevati. Uno

dei componenti più importanti per la formazione del

mediatore,

PIC in vivo è il complesso chiamato che è

costituito da circa 20 subunità, delle quali più di 7

→

sono conservate dal lievito all’uomo. Il mediatore,

la cui struttura è stata risolta a bassa risoluzione

mediante tecniche di microscopia elettronica, si lega

al complesso d’inizio trasportandovi l’RNA polimerasi.

Questa è legata direttamente al mediatore che

interagisce con il CTD, mascherandolo. Il principale

fi fi fi fi fi fi 72

ruolo del mediatore è quello di fare da ponte tra gli attivatori legati a monte e il complesso d’inizio

e, inoltre, alcune sue subunità possono avere un ruolo nella repressione della trascrizione. Il me-

diatore stimola la trascrizione in un sistema puri cato, anche in assenza di un attivatore; questa

stimolazione può derivare dalle strette interazioni che ha con la polimerasi, i fattori basali e il DNA.

Questo stretto contatto sembra stabilizzare il complesso di pre-inizio, promuovendo la sua

formazione e il suo mantenimento per più cicli di trascrizione. Poiché il mediatore non è

strettamente necessario per la trascrizione basale in vitro, si è a lungo discusso se lo si dovesse

considerare come un fattore basale di trascrizione o come un co-attivatore. Generalmente il

mediatore è considerato come un componente essenziale del complesso di pre-inizio, dato che

alcune delle sue subunità sono necessarie per la trascrizione di quasi tutti i geni trascritti da Pol II.

Struttura di Pol II e reazione di allungamento nella sintesi dell’RNA

Pol II è costituita da più subunità che danno a questo enzima una forma a “pinza” che si apre e

chiude sul DNA inglobandolo in una lunga scanalatura nella struttura dell’oloenzima. La parte

superiore della “pinza” è quella più mobile e permette l’ingresso del DNA. La brusca curvatura

che, a causa della struttura del “muro”, il lamento stampo del DNA è costretto a fare, ha come

risultato quello di esporre la base non appaiata nel sito attivo, pronta ad appaiarsi con il

nucleotide successivo che entrerà nel

complesso.

Questo aspetto è cruciale per la

fedeltà di lettura del codice genetico.

Recentemente, la risoluzione di una

struttura cristallogra ca dell’RNA

polimerasi II di lievito contenente 1

NTP ha evidenziato la presenza di un

dominio proteico chiamato trigger loop

(grilletto). Questo ha il ruolo di

riconoscere e discriminare il nucleotide corretto per evitare errori nella sintesi; inoltre, promuove la

formazione del legame fosfodiesterico e l’avanzamento della polimerasi. Il trigger loop posiziona il

nuovo NTP nel sito attivo in modo tale che, se l’appaiamento è corretto, il nucleotide riesce a

posizionarsi correttamente rispetto al 3'OH della molecola di RNA nascente e al nucleotide

complementare nel lamento stampo del DNA. Il trigger loop promuove l’attacco nucleo lo da

parte del 3'OH e il distacco del pirofosfato. Inoltre, ha anche il ruolo di promuovere l’avanzamento

dell’enzima: infatti, dopo che si è formato il legame fosfodiesterico, questa struttura ritorna nella

posizione iniziale, proprio come un grilletto, riformando il sito A vuoto e interagendo con altri

domini proteici come il bridge, che connettendo le due subunità grandi della pinza promuove

l’avanzamento dell’enzima.

Una volta che la polimerasi ha superato la sintesi abortiva e si è staccata dal promotore e dalla

maggior parte dei fattori basali, inizia la fase di allungamento della trascrizione. In questa fase, il

CTD fosforilato recluta alcuni fattori speci ci che sono necessari per il processamento, lo splicing

e la poliadenilazione dell’RNA. Da un punto di vista strutturale, la coda CTD si trova vicino al

canale di uscita dell’RNA e la sua forma non strutturata la fa estendere oltre l’enzima. Questa

caratteristica permette alla coda di reclutare i componenti sopra descritti e di dirigerli sull’RNA

che sta uscendo dall’enzima. Analogamente alla polimerasi batterica, durante la fase di

allungamento Pol II va incontro a delle pause che dipendono anche dalla sequenza che viene

trascritta. Come nei procarioti, esistono dei fattori di allungamento che permettono alla polimerasi

di procedere e superare questi eventuali rallentamenti sul DNA. Oltre a TFIIF, che sembra avere un

ruolo nello stimolare l’allungamento iniziale, il fattore TFIIS limita il tempo delle pause che la

polimerasi è costretta a fare sul DNA stampo. TFIIS funziona in modo simile a GreB. TFIIS ha una

lunga struttura che si inserisce, attraverso l’“imbuto” da dove entrano i nucleotidi, no al sito

attivo, dove avviene la sintesi dell’RNA. TFIIS ha anche la funzione di stimolare l’attività di

correzione da parte della polimerasi nel caso sia stato incorporato un nucleotide sbagliato.

Queste reazioni di correzione possono essere realizzate attraverso la reazione inversa di sintesi

dell’ultima base, con la polimerasi che indietreggia sullo stampo o con una degradazione limitata

della catena di RNA. TFIIS stimola l’attività ribonucleasica della polimerasi, che rimuove le basi

sbagliate e poi riprende a trascrivere dopo la pausa.

fi fi fi

fi fi fi fi 73

Regolazione

Si analizzano ora i meccanismi che regolano la trascrizione della RNA polimerasi II. Tale

regolazione si realizza attraverso l’integrazione dei ruoli di numerose proteine, genericamente

fattori di regolazione,

chiamate che, controllando sia positivamente che negativamente la

trascrizione di geni speci ci, sovraintendono al normale funzionamento della cellula, al

di erenziamento dei vari tessuti, allo sviluppo di un organismo. La funzione di molti regolatori è, a

sua volta, in uenzata da stimoli esterni, permettendo così all’organismo di reagire a speci ci

segnali. Questo complesso apparato di attivatori, co-attivatori e repressori permette il controllo

della trascrizione della maggior parte degli mRNA, sia stimolando e aumentando il livello basale di

trascrizione, che modi cando lo stato della cromatina, così che le regioni di controllo di speci ci

geni diventino accessibili all’apparato trascrizionale solo in determinati momenti della vita della

cellula. Questi meccanismi di controllo sono conservati negli eucarioti, dal lievito all’uomo.

Struttura modulare dei promotori eucariotici

Un promotore di Pol II è costituito da vari elementi che si possono suddividere in due gruppi

distinti: quelli prossimali al sito d’inizio della trascrizione ( no a circa 200 pb), a cui si legano i

fattori basali di trascrizione, la polimerasi e alcuni attivatori, e quelli distali, che si possono trovare

anche a 100 kb di distanza, ai quali si legano i fattori di regolazione della trascrizione.

Anche nella regione prossimale del promotore vi sono elementi sul DNA che legano attivatori o

repressori. Nel lievito la maggior parte dei geni ha un elemento chiamato UAS (Upstream

Activating Sequence), che si trova da –100 a –200 pb dal sito d’inizio della trascrizione, al quale si

legano attivatori speci ci per il gene posto a valle. Negli eucarioti multicellulari il promotore è ricco

di sequenze regolatrici costituite da parecchi elementi prossimali posti no a –200 pb dal sito

d’inizio. Queste sequenze di DNA sono state individuate attraverso esperimenti di mutagenesi

sito-speci ca nella regione del promotore, spesso usando un gene reporter per saggiare l’attività

trascrizionale. In questo caso, un promotore eucariotico viene posizionato a monte del gene che

Fluorescent Protein,

codi ca per la GFP (Green proteina uorescente verde) e il plasmide che

contiene questo costrutto è trasfettato in cellule eucariotiche in coltura. Una serie di mutazioni

che coprono la regione prossimale permette di individuare le sequenze del promotore su cui si

legano i fattori basali e di regolazione essenziali per la sua trascrizione.

I siti di riconoscimento prossimali nel promotore sono, in generale, formati da sequenze

nucleotidiche che si presentano a blocchi (box), quali, per esempio, la C