Biologia Molecolare

Biologia molecolare e genetica classica

I caratteri fenotipici si trasmettono da una generazione a quella successiva non in maniera casuale e imprevedibile, ma secondo dei rapporti statistici costanti e prevedibili.

Le leggi di Mendel

• Quali sono le basi molecolari (biochimiche) dei caratteri morfologici osservati (es. colore occhi, forma ali)?
• Quali sono e dove sono materialmente localizzate nella cellula le unità responsabili della trasmissione dei caratteri ereditari?

Molti caratteri ereditari sono malattie metaboliche caratterizzate dal blocco di determinate reazioni chimiche. Queste malattie sono causate dall’assenza di un enzima specifico normalmente sintetizzato da un gene presente negli individui sani. Emofilia: malattia genetica caratterizzata dalla mancata attività di uno dei fattori della coagulazione (VIII, IX, XI), enzimi indispensabili perché il processo di coagulazione proceda correttamente.

Ipotesi del "un gene, una proteina"

“Ad ogni gene corrisponde una proteina e viceversa” si tratta di un'approssimazione valida al 90%: un gene può infatti codificare per più proteine originando più di un filamento di RNA. Ci sono anche geni che non codificano per proteine ma per RNA a funzione regolatoria che non verranno perciò mai tradotti in proteine.

• Neurospora crassa: muffa che normalmente cresce su di un terreno contenente solo glucosio e ioni inorganici. Se sottoposta ad agenti che determinano un aumento di mutazioni genetiche (raggi x o uv) si originano ceppi mutanti che per crescere necessitano di ulteriori fattori di crescita (es. vitamine, specifici a.a., basi puriniche o pirimidiniche).

La muffa non mutata produce da sé questi fattori, mentre nei ceppi mutati mancano gli enzimi che normalmente li sintetizzano. Quest’incapacità di produrre i fattori di crescita viene trasmessa alle generazioni successive delle muffe.

Cromosomi

I principali componenti dei cromosomi sono:

• Acido desossiribonucleico (DNA)
• Istoni: proteine basiche che neutralizzano l’acidità del DNA

Gli spermatozoi non contengono gli istoni ma delle piccole proteine basiche dette protamine. Inizialmente si pensava che fossero gli istoni a portare l’informazione genetica, ma il fatto che non siano negli spermatozoi ha fatto intuire che i geni non si trovano negli istoni ma nel DNA sebbene sembrasse troppo semplice per codificare per un così gran numero di proteine.

Le cellule contengono anche un altro tipo di acido nucleico, l’acido ribonucleico (RNA). L’RNA è localizzato nel citoplasma e nel nucleo in piccoli granuli detti nucleoli.

Pneumococchi

Pneumococchi: batteri che possono causare la polmonite; si dividono in:

• Capsulati (lisci): patogeni, la capsula li protegge dagli antibiotici
• Non capsulati (ruvidi): non patogeni, facilmente distrutti dal sistema immunitario

Esperimento di Griffith

Conigli iniettati con:

• Pneumococchi capsulati vivi muoiono di polmonite
• Pneumococchi non capsulati vivi non muoiono di polmonite
• Pneumococchi capsulati uccisi dal calore non muoiono di polmonite
• Pneumococchi non capsulati uccisi dal calore non muoiono di polmonite
• Pneumococchi capsulati uccisi dal calore + pneumococchi non capsulati vivi: un certo numero di conigli sviluppano la polmonite

I pneumococchi non patogeni possono essere resi patogeni grazie all’incorporazione di un fattore trasformante proveniente dal ceppo patogeno, che modifica il fenotipo del batterio che diventa capsulato. Il fenotipo modificato si trasmette anche alle generazioni successive, perciò la modifica avviene a livello genetico.

Se i batteri patogeni dopo essere stati uccisi vengono trattati con:

• Proteasi (che digeriscono le proteine)
• Lipasi (che digeriscono i lipidi)
• RNasi (che digeriscono l’RNA)

La trasformazione batterica avviene comunque. Se vengono trattati con:

• DNasi (che digerisce il DNA) la trasformazione batterica non avviene più quindi il fattore trasformante (genetico) è il DNA.

Nucleotide e struttura del DNA

Basi azotate: idrofobiche, 2-desossiribosio: idrofilico, fosfato: idrofilico. Legame tra 2-desossiribosio e base azotata: legame tra 2-desossiribosio e fosfato: fosfoesterico. Gli organismi diversi presentano nel loro DNA diverse quantità delle quattro basi azotate. La quantità di adenina è sempre identica a quella di timina e quella di guanina a quella di citosina. (Adenina + Timina – Guanina + Citosina). Il numero totale di basi puriniche nel DNA è approssimativamente uguale a quello delle basi pirimidiniche.

Struttura covalente della catena polinucleotidica

La catena di DNA presenta sempre: all’estremo 5’ un gruppo fosfato, all’estremo 3’ ossidrile OH. La catena monofilamentosa non è la forma finale della catena di DNA: inizialmente c’erano molte teorie, poi nel 1954 Watson e Crick scoprirono che la struttura del DNA è ad a-elica e vinsero il premio Nobel.

La struttura ad a-elica è costituita da due filamenti legati da coppie di basi azotate. Sui due lati, zuccheri pentosi e gruppi fosfato si possono definire i due mancorrenti, mentre le basi azotate costituiscono i “pioli”.

Complementarità delle coppie di basi

La complementarità delle coppie di basi dipende da:

• Dimensioni delle basi (una base piccola, pirimidinica, si lega sempre con una base grossa, purinica, così che la distanza tra i due filamenti rimanga costante).
• Forma e composizione chimica delle basi: l’adenina si lega sempre con la timina, formando 2 ponti H, la citosina con la guanina formando 3 ponti H.

I ponti H si formano tra l’H di una base e O e N dell’altra; si tratta di legami elettrostatici. Le basi sono legate da legami forti ma non troppo: il DNA per espletare le sue funzioni ha bisogno che i due filamenti si possano anche staccare tra loro di tanto in tanto. È più facile rompere il filamento dove ci sono solo due ponti H, cioè tra adenina e timina, dove invece il filamento deve essere più robusto troviamo guanina e citosina, che danno 3 ponti H. I due filamenti devono essere antiparalleli perché solo in questo modo le basi azotate si posizionano con la corretta angolazione e i gruppi funzionali nella giusta posizione per formare i ponti H. Il legame glucosidico a circa 50° spiega perché i filamenti devono essere antiparalleli.

Formazione dell'α-elica

Si forma spontaneamente, questo perché il nucleotide ha parti idrofobiche e parti idrofiliche. I fosfati e gli zuccheri sono idrofilici (in H₂O formano legami elettrostatici) quindi solubili in acqua, mentre le basi sono idrofobiche, non solubili in acqua.

Nelle catene polinucleotidiche, la distanza tra due desossiribosi adiacenti è di 0.6 nm, di conseguenza tra le basi viene a crearsi uno spazio di 0.27 nm all’interno del quale può inserirsi dell’acqua. Un primo modo per ridurre i contatti delle basi con l’ambiente ricco d’acqua della cellula è quello di formare dei legami con le basi di un’altra catena polinucleotidica. Lo spazio fra le basi adiacenti può essere eliminato facendo ruotare l’asse delle catene zucchero-fosfato di 30 gradi, in modo che le basi interagiscano tra loro con interazioni di tipo idrofobico tra le nuvole elettroniche degli anelli aromatici. Il DNA assume una conformazione ad elica e non a gratinata, perché vi sono dei contatti inaccettabili tra gli atomi delle basi sovrapposte (gruppi funzionali); per eliminare questi contatti vi è una leggera rotazione in senso orario delle basi impilate (circa 36 gradi) che va a formare una conformazione ad elica.

Caratteristiche della doppia elica di DNA-B

• Elica destrorsa si avvolge in senso antiorario; se fosse sinistrorsa si avvolgerebbe in senso orario.
• In ciascuna catena i nucleotidi adiacenti sono ruotati l’uno rispetto all’altro di 34.6°. Per questo motivo la doppia elica completa un giro approssimativamente ogni 10.4 coppie di basi.
• Ciascun giro della doppia elica si estende per 3.40 nm (passo dell’elica). Ogni coppia di basi incrementa la lunghezza dell’elica di 0.33 nm. Il diametro della doppia elica è di 2.37 nm.

Sulla superficie esterna di una molecola di DNA-B gli spazi compresi tra i due filamenti avvolti tra loro formano due solchi elicoidali di ampiezza diversa (solco maggiore e solco minore). Ogni base ha quindi una superficie esposta all’esterno dell’elica che può essere riconosciuta da molecole che si legano al DNA interagendo selettivamente con specifici gruppi chimici (delle basi) localizzati nei solchi. Per funzionare il DNA deve lavorare in collaborazione con le proteine. Queste proteine si inseriscono all’interno di questi solchi fino a quando non trovano la sequenza di basi specifica a cui attaccarsi. L’α-elica è molto flessibile rispetto al suo asse longitudinale, di conseguenza può facilmente flettersi se si lega con delle proteine. Questa deformabilità permette al DNA di compattarsi e quindi di occupare nella cellula un volume più piccolo. Lo svolgimento e la separazione dei filamenti del DNA è un processo che prende il nome di denaturazione o fusione, ed è indispensabile per la duplicazione e la formazione di mRNA.

Agenti denaturanti

• Calore superiore ai 90°, se si raffredda si ricostruisce l’α-elica
• pH < 3 > 1
• È possibile anche una denaturazione enzimatica ad opera degli elicasi

Spettrofotometro

Tecnica che permette di analizzare delle sostanze in soluzione, studiandone come queste vengono attraversate dalla luce. È costituito da una lampada, delle lenti che concentrano la luce con lunghezza d’onda più giusta sul campione (questo avviene grazie ad un monocromatore). Misura l’assorbanza del campione contenuto nella cuvette, vale a dire la percentuale di luce incidente (I₀) che è stata assorbita dal campione. Se il campione assorbe tutta la luce incidente (I₀), la luce trasmessa (I_t) è pari a 0 e quindi l’assorbenza è 100%. Se il campione è perfettamente trasparente I_t = I₀ e quindi l’assorbanza è 0. Nel caso dell’acqua distillata l’assorbanza 0 e la trasmittanza 100. Più la sostanza è concentrata più assorbirà luce. Nella cuvette possiamo mettere il DNA e studiarne la denaturazione. A 260 nm di lunghezza d’onda l’α-elica assorbe poca luce, mentre i filamenti singoli (denaturati) ne assorbono molta di più. Fino a 80° il DNA mantiene la sua struttura, successivamente i filamenti iniziano ad aprirsi sempre più fino ai 90° quando l’assorbanza non aumenta più e il DNA è completamente denaturato.

T_m = temperatura di fusione (melting). Porzioni di DNA ricche di coppie GC hanno T_m maggiore di porzioni ricche di AT (perché tra G e C si formano 3 ponti H, tra A e T solo 2). La denaturazione non è perciò istantanea ma progressiva, perché il filamento è costituito da parti diverse.

La replicazione del DNA è semiconservativa

Da un punto di vista teorico la duplicazione del DNA potrebbe essere conservativa (delle due a eliche nelle cellule figlie, una è quella originale, l’altra è la copia), semiconservativa (ciascuna cellula figlia ha un a elica formata da un filamento originale e uno copiato utilizzando quello originale come stampo) o dispersiva (ogni filamento ha frammenti di filamento originale e altri copiati). Conservativa e dispersiva non esistono in natura; la replicazione del DNA è semiconservativa: durante un ciclo di replicazione, ciascuno dei due filamenti è usato come stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare.

Dogma centrale della biologia molecolare

Il funzionamento degli acidi nucleici può essere riassunto da questo schema che prende il nome di “dogma centrale della biologia molecolare”. La molecola centrale è il DNA; questa va in contro a processi di duplicazione. Il processo mediante il quale dal DNA si arriva all’RNA prende il nome di trascrizione. La trascrizione è la sintesi per tutti i tipi di RNA. Questi tre tipi di RNA (mRNA, rRNA, tRNA) agiscono per la trascrizione delle proteine. Viene tradotto solo l’mRNA ma vengono trascritti tutti gli RNA. Ci sono poi alcune eccezioni, come la retroazione, che funziona al contrario: mediante l’enzima trascrittasi inversa, l’RNA funge da stampo e viene trascritto in DNA. Questo meccanismo si può trovare in alcuni virus, detti appunto retrovirus, come l’AIDS.

Acido ribonucleico (RNA)

È il secondo tipo di acido nucleico presente nelle cellule insieme al DNA. Ne esistono tre forme fondamentali:

• mRNA: RNA messaggero
• tRNA: RNA transfer
• rRNA: RNA ribosomiale

DNA vs RNA

Chimiche:

• Contiene il ribosio al posto del 2-desossiribosio
• Contiene la base azotata uracile al posto della timina (complementari all’adenina)

Strutturali

Il polimero di RNA è un filamento singolo che però spesso presenta dei tratti a doppio filamento a causa della presenza di basi complementari (= anse).

Localizzazione cellulare

Il DNA è localizzato al 99% dentro al nucleo e in piccola parte nei mitocondri e nei cloroplasti. L’RNA si deve trovare invece in tutta la cellula: nel nucleo, dove viene sintetizzato, nel citoplasma dove viene utilizzato per sintetizzare le proteine, nei mitocondri o nei cloroplasti.

RNA messaggero (mRNA)

L’mRNA porta su di sé l’informazione per la sequenza amminoacidica per la proteina (struttura primaria). Fa quindi da tramite tra il DNA (dove l’informazione genetica per la struttura delle proteine è codificata a livello dei geni) e i ribosomi (dove avviene la sintesi proteica).

RNA ribosomiale (rRNA)

L’rRNA viene sintetizzato nel nucleo e trasferito poi nei ribosomi (organelli presenti sia nei procarioti che negli eucarioti). Il ribosoma sintetizza le proteine e presenta un canale per la fuoriuscita di queste ultime. Entrambe le subunità del ribosoma sono formate da rRNA e da delle proteine che concorrono a formarne la struttura. Nei procarioti le due subunità vengono identificate come subunità 30S e subunità 50S. In totale però, il ribosoma è di 70S, questo perché gli Svedberg non sono unità additive, sono coefficienti di sedimentazione e indicano quanto una particella è pesante.

Ribosomi

Eucarioti

Negli eucarioti hanno ribosomi di due tipi:

1. Ribosomi citoplasmatici: sono ribosomi di 80S hanno la stessa struttura di quelli dei procarioti ma sono più grossi; sono costituiti da due subunità:
   • Sub unità 40S (small): rRNA 18S + 33 proteine (S1, S2, S3..)
   • Subunità 60S (large): Rrna 5S/28S/5,8S + 50 proteine (L1, L2, L3..)
2. Ribosomi mitocondri/cloroplasti sono più piccoli (70S) e sintetizzano proteine mitocondriali. Hanno la stessa struttura di quelli dei procarioti (50S + 30S).

La sequenza primaria di nucleotidi dei diversi tipi di rRNA varia considerevolmente tra procarioti ed eucarioti ed anche tra specie e specie. Tuttavia la lunghezza e la posizione delle strutture a steli ed anse è molto simile in tutte le specie. Di conseguenza la struttura tridimensionale del ribosoma è simile in tutti gli organismi.

RNA transfer (tRNA)

Aiuta anche esso a sintetizzare le proteine. Quando deve avvenire la sintesi ci devono essere gli amminoacidi che vengono trasportati sul ribosoma dagli tRNA. Un filamento di tRNA è costituito da ~ 80 nucleotidi, è quindi corto. Ha una struttura secondaria definita a trifoglio, perché mostra tre anse dovute alla presenza dei ponti H. Alla sequenza –CCA 3’ terminale si lega l’amminoacido: estremità detta stelo accettore. L’ansa dell’anticodone (situata nella parte opposta) contiene l’anticodone, complementare ad un codone (porta la sequenza per uno specifico amminoacido) dell’mRNA. Esistono 30-40 diversi tRNA nei procarioti e diverse centinaia negli eucarioti. L’informazione genetica contenuta nel DNA deve essere trasmessa dalla sequenza delle quattro basi azotate (A,T,G,C) anche se gli amminoacidi sono 20 diversi. Perciò possiamo definire il gene come una sequenza di nucleotidi adiacenti che specificano le sequenze amminoacidiche delle proteine della cellula. Questa sequenza non può sempre essere lineare e semplice, in qualche modo ogni singolo amminoacido deve essere indicato da più basi azotate. Tra la sequenza nucleotidica e la sequenza di amminoacidi c’è una corrispondenza collineare l’ordine dei nucleotidi del gene corrisponde all’ordine degli amminoacidi nella proteina corrispondente. I meccanismi molecolari che stanno alla base della collinearità tra sequenze nucleotidiche e sequenze aminoacidiche non sono ovvi, perché i 20 aminoacidi eccedono di gran lunga il numero dei 4 nucleotidi presenti nel DNA. Non può esserci una corrispondenza univoca fra nucleotidi e aminoacidi: ciascun aminoacido deve essere quindi specificato (codificato) da un gruppo di nucleotidi. Se ogni amminoacido fosse specificato da delle doppiette di nucleotidi avremmo 16 permutazioni (4x4) = insufficienti. Se invece facciamo delle triplette otteniamo 64 permutazioni che sono più di quelle necessarie per i 20 amminoacidi, per cui ogni singolo amminoacido deve essere specificato da tre nucleotidi.