Biologia Molecolare

III CGC CUG

Un aminoacido Più aminoacidi

La base nella posizione vacillante dell’anticodone (tRNA) subisce spesso una modificazione covalente che le

permette di formare legami H con diversi tipi di basi (Es. inosina: formata per deaminazione dell’adenina, si

appaia con A,C,U). La base modificata è in realtà la prima base sull’anticodone. Questo fenomeno

contribuisce a spiegare perché 61 codoni differenti codificano per soli 20 aminoacidi.

Anche solo la modifica di un aminoacido in una proteina può causare gravi danni alla proteina; per

esempio, l’anemia falciforme è causata dalla mutazione di uno dei 146 aminoacidi presenti nell’emoglobina.

 A più codoni può corrispondere un solo aminoacido ma un singolo codone può codificare sempre e solo

per un solo aminoacido. 10

Il codice genetico per il DNA cromosomico è

universale, cioè è comune dai procarioti più

semplici agli eucarioti più complessi. Fa

parzialmente eccezione il DNA mitocondriale

nel quale il codone UGA viene letto come

triptofano (invece che stop) e quello AUA come

metionina (invece che isoleucina).

Tutte le catene di DNA e di RNA si allungano in

direzione 5’-3’ (cioè i nuovi nucleotidi vengono

sempre aggiunti all’estremità 3’).

DUPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI

Il DNA batterico è un DNA ad anello; la duplicazione di tutti i batteri inizia sempre e solo in un unico punto,

ORI-C. Perché il DNA si possa duplicare è necessario che si formi una bolla di denaturazione, e ciascun

filamento faccia da stampo per la sintesi del filamento complementare. Man mano che la duplicazione

prosegue la bolla si ingrossa, e la duplicazione termina quando la bolla arriva sul lato opposto e quindi il DNA

è completamente denaturato andando a

formare due anelli. Il punto in cui avviene

la nuova sintesi, e quindi il DNA

parenterale si divide, prende il nome di

forcella di duplicazione.

Per ogni bolla di duplicazione (zona in cui

si duplica il DNA), ci sono 2 forcelle di

duplicazione. La replicazione inizia in un

punto di origine fisso e procede in

direzioni opposte fino a che le forcelle di

replicazione si incontrano.

Perché il DNA si possa duplicare ci devono essere degli enzimi (catalizzatori) che prendono il nome di DNA

polimerasi.

Esistono tante DNA polimerari, ognuna con un compito specifico.

Quella che duplica il DNA nella forcella di duplicazione è la DNA POLIMERASI III.

DNA polimerasi I: Ripara le lesioni subite dalla catena di DNA e interviene nel processo di saltature dei

- frammenti Okazaki

DNA polimerasi II: partecipa alla riparazione della catena di DNA.

- DNA polimerasi III: E’ responsabile dell’allungamento della catena del DNA durante la duplicazione.

-

Gli enzimi della DNA POLIMERASI III sono enzimi multimerici formati da più proteine 11

La DNA polimerasi III esiste in una forma più semplice (con attività minima e di tipo distributivo) formata da

ε, θ)

tre subunità (α, e in una forma molto più attiva (nota come oloenzima) costituita da 11 subunità (proteine)

di 10 tipi differenti.

Le varie subunità dell’oloenzima hanno ciascuna una funzione specifica:

α

1. la subunità aggiunge nucleotidi all’estremo 3’ catalizza il trasferimento di un gruppo nucleotidico in

direzione 5’→3’. (sintesi del legame fosfoesterico)

β

2. la subunità aggancia saldamente l’oloenzima alla catena di DNA, è quindi responsabile del

meccanismo progressivo dell’oleonzima.

τ

3. la subunità ha il compito di tenere unite come dimero 2 molecole di DNA POLIMERASI III.

ε

4. la subunità ha attività esonucleasica 3’→5’, corregge eventuali errori di duplicazione.

γ.

5. le rimamenti 6 subunità formano il complesso

β β,

La subunità conferisce alla DNA polimerasi III il suo meccanismo d’azione progressivo. Due subunità

infatti, formano un dimero ad anello attorno al DNA che scorre lungo l’α-elica trascinando con sè tutto

β γ.

l’oloenzima. L’iniziale formazione dell’anello richiede l’idrolisi i ATP ad opera del complesso

La DNA polimerasi sintetizza il legame fosfoesterico nella catena di accrescimento.

L’enzima sintetizza il DNA aggiungendo un nucleotide per volta all’estremità 3’ (OH) della catena in

accrescimento.

Il nucleotide aggiunto deriva da un desossiribonucleoside -5’-trifosfato (dNTP). Per questa reazione è, inoltre,

++

necessario Mg , poiché i dNTP per poter essere utilizzati devono essere complessati con il magnesio.

Lo scheletro zucchero-fosfato si forma per trasferimento di un gruppo nucleotidico da un dNTP al gruppo

ossidrilico 3’ del residuo nucleotidico terminale della catena di DNA in allungamento.

Poiché il nucleotide si possa legare all’OH in 3’ serve molta energia, fornita dai legami di anidride. L’idrolisi

del pirofostato (si scinde prima il legame PPP e poi quello tra PP) ad opera di una pirofosfatasi, fornisce

l’energia necessaria alla reazione e l’enzima (DNApolimerasi III) opera a una velocità di circa 1000 residui

nucleotidici al secondo (in 20 minuti E.coli duplica il suo DNA). I nucleotidi aggiunti alla catena rimarranno

monofosfati.

Quando la DNA polimerasi duplica il DNA aggiunge un nuovo nucleotide, e teoricamente potrebbe agire con

due meccanismi diversi:

1. processo di sintesi definito distributivo: dopo che un nuovo residuo è stato aggiunto alla catena,

l’enzima potrebbe staccarsi e legarsi a caso su di un’altra catena incompleta.

2. processo definito progressivo: una volta che la polimerasi ha iniziato la sintesi del DNA su un filamento

che funge da stampo, rimane legata ad esso finche’ tale filamento non viene completamente

reduplicato.

Si è dimostrato sperimentalmente che la DNA polimerasi III ha sempre un meccanismo progressivo, quindi le

forcelle non si staccano finché non arrivano sul lato opposto e l’intero cromosoma è stato completamente

reduplicato. 12

La DNA-polimersai III è capace di correggere gli errori sulla catena di DNA in formazione causati da un non

ε

corretto accoppiamento delle basi. Questo è possibile perché la subunità possiede un’attività

5’

esonucleasica 3’ che idrolizza il legame fosfodiestere tra il residuo terminale e il resto della catena.

ε

Se il nucleotide aggiunto è sbagliato, non può formare i ponti H e la subunità si comporta come un

enzima idrolasi: aggiungendo H 0 degrada il filamento di DNA.

2

Si tratto di un enzima nucleasi: enzima che idrolizza un acido nucleico aggiungendo H 0; se taglia il

2

filamento in un punto qualsiasi si parla di endonucleasi, se invece lo taglia a partire dalle estremità si chiama

esonucleasi.

L’oloenzima incorpora una base sbagliata circa una volta ogni 10.000 reazioni di allungamento (tasso di

-4 ε

errore 10 ). Questi errori vengono corretti dall’attività esonucleasica della subunità che, a sua volta, ha un

-3

tasso di errore di 10 . La combinazione di queste due reazioni sequenziali produce un tasso complessivo di

-7

errore di 10 (uno dei più bassi mai riscontrati per un enzima). Quindi enormi molecole di DNA vengono

reduplicate con pochissimi errori.

Un errore ogni tanto viene fatto, troppi sarebbero pericolosi per la cellula, ma ogni tanto alcune mutazioni

sono utili all’evoluzione.

Altre proteine collaborano, inoltre, con la DNA-POLIMERASI III.

1. le elicasi catalizzano lo svolgimento dell’α-elica a livello delle forcelle di duplicazione.

2. Le topoisomerasi impediscono l’accumulo di tensione evitando dei superavvolgimenti che

bloccherebbero lo scorrimento della denaturazione

3. La proteina che si lega ad un singolo filamento (SSB) impedisce ai filamenti di DNA denaturati di

riformare l’α-elica o delle anse a forcina, che arresterebbero l’azione della polimerasi.

Per evitare che i due filamenti del DNA si richiudano prima di far da stampo per i due filamenti complementari,

oppure che si creino delle anse che ne impedirebbero l’avanzamento, si inseriscono altre proteine che si

legano al filamento singolo denaturato (single strand binding proteins). 13

La DNA-polimerasi III catalizza l’allungamento della catena

di DNA solo in direzione 5’3’.

Tuttavia, un esame della forcella di duplicazione rivela che

la sintesi 5’3’ può essere continua solo su di un filamento.

Nell’altro filamento, che ha una polarità opposta, la sintesi

5’3’ procede in direzione opposta rispetto alla forcella di

duplicazione, quindi non sarebbe possibile una sintesi

continua.

C’è un filamento con 3’ giusto che può essere sintetizzato

in maniera continua, mentre dall’altro lato la DNA

polimerasi III di tanto in tanto si deve staccare e tornare

indietro sintetizzando per frammenti. Il filamento

sintetizzato in maniera continua prende il nome di filamento guida, l’altro formatosi per polimerizzazione

5’3’ in direzione opposta alla forcella filamento lento.

Il filamento lento deve necessariamente essere sintetizzato in

frammenti (di kazaki), ciascuno dei quali viene polimerizzato

in direzione 5’3’. Solo in un secondo momento i frammenti

neosintetizzati vengono legati tra loro a formare un

filamento completo (sintesi discontinua del DNA).

Per ogni forcella di duplicazioni vi sono due DNA polimerasi

III.

Esiste, però, un ulteriore problema. Nessuna DNA-polimerasi

è in grado di iniziare la polimerizzazione del DNA ex novo

(senza un filamento di stampo), ma tutte richiedono per

poter agire la presenza (di un acido nucleico) del gruppo

ossidrilico 3’ di un corto RNA innesco.

Perciò la sintesi di tutti frammenti di Okazaki (così come del filamento guida) comincia con quella di un RNA

innesco 5’3’ al quale la DNA-polimerasi III può, poi, aggiungere desossiribonucleotidi.

l’RNA innesco viene

sintetizzato da un enzima

detto primasi (o dnaG) che

sintetizza un corto RNA

innesco (< 15 nucleotidi) al

secondo.

Poiché la forcella di

duplicazione si muove ad

una velocità di circa 1000

nucleotidi al secondo, la

primasi produce un innesco

ogni 1000 nucleotidi.

A mano a mano che altro DNA a filamento singolo compare dietro ad essa, la primasi avanza con la forcella

di duplicazione e sintetizza nuovi inneschi per nuovi frammenti di Okazaki.

La primasi è un componente del primoso