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Biologia Molecolare

Struttura, proprietà chimico-fisiche e funzioni degli acidi nucleici. Accrescimento 5’-3’degli acidi nucleici. Organizzazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti. Modalità e complessi enzimatici coinvolti nella duplicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti. Definizione del gene. Codice genetico: triplette, degenerazione del codice genetico, vacillamento della... Vedi di più

Esame di Biochimica e biologia molecolare docente Prof. P. Cascio

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Se invece facciamo delle triplette otteniamo 64 permutazioni che sono più di quelle necessarie per i 20

amminoacidi, per cui ogni singolo amminoacido deve essere specificato da tre nucleotidi (una tripletta).

Ogni tre nucleotidi sul DNA portano l’informazione per ogni singolo amminoacido. I tre nucleotidi che

portano l’informazione sono chiamati tripletta o codone. Il singolo codone porta l’informazione per il

singolo amminoacido.

CODICE GENETICO

1. Tutti i codoni sono formati da tre nucleotidi (64 triplette)

2. Delle 64 combinazioni possibili tre vengono eliminate (i codoni UAA, UAG, UGA sono segnali di stop

e non codificano per nessun aminoacido,tant’è vero che non esistono tRNA con anticodoni

complementari).

61 codoni codificano per specifici amminoacidi, più triplette diverse codificano per lo stesso

amminoacido.

3. Molti aminoacidi sono specificati da più di un codone (ci sono diversi codoni che codificano per uno

stesso aminoacido): questo fenomeno è detto degenerazione del codice genetico..

4. Tutte le proteine iniziano con una metionina (che può poi venire rimossa) il cui codone è AUG.

5. I tRNA per gli aminoacidi più abbondanti nelle proteine sono presenti in quantità maggiore rispetto

a quelli per gli aminoacidi più rari

DEGENERAZIONE DEL CODICE GENETICO

Tutti e 61 codificano per ogni amminoacido.

Il tRNA porta l’amminoacido in un determinato punto perché ha le basi complementari al codone

Quando il codone interagisce con l’anticodone solamente le prime due coppie di basi si formano secondo le

modalità classiche del DNA, mentre la terza coppia (3°base del codone, 1°base dell’anticodone perché mRNA

e tRNA sono antiparalleli) può presentare appaiamenti alternativi tra le basi (vacillamento della terza base).

Per questo motivo si dice che il codice genetico è degenerato in terza base.

*Quando si ha una degenerazione in terza base la base che cambia è la prima sull’anticodone.

Quando si ha una degenerazione in terza base,

l’aminoacido codificato non cambia perché l’mRNA,

anche se presenta una base diversa, lega sempre lo

stesso anticodone.

Es : CGG CGG

JJJ CGU GCU

III CGC CUG

Un aminoacido Più aminoacidi

La base nella posizione vacillante dell’anticodone (tRNA) subisce spesso una modificazione covalente che le

permette di formare legami H con diversi tipi di basi (Es. inosina: formata per deaminazione dell’adenina, si

appaia con A,C,U). La base modificata è in realtà la prima base sull’anticodone. Questo fenomeno

contribuisce a spiegare perché 61 codoni differenti codificano per soli 20 aminoacidi.

Anche solo la modifica di un aminoacido in una proteina può causare gravi danni alla proteina; per

esempio, l’anemia falciforme è causata dalla mutazione di uno dei 146 aminoacidi presenti nell’emoglobina.

 A più codoni può corrispondere un solo aminoacido ma un singolo codone può codificare sempre e solo

per un solo aminoacido. 10

Il codice genetico per il DNA cromosomico è

universale, cioè è comune dai procarioti più

semplici agli eucarioti più complessi. Fa

parzialmente eccezione il DNA mitocondriale

nel quale il codone UGA viene letto come

triptofano (invece che stop) e quello AUA come

metionina (invece che isoleucina).

Tutte le catene di DNA e di RNA si allungano in

direzione 5’-3’ (cioè i nuovi nucleotidi vengono

sempre aggiunti all’estremità 3’).

DUPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI

Il DNA batterico è un DNA ad anello; la duplicazione di tutti i batteri inizia sempre e solo in un unico punto,

ORI-C. Perché il DNA si possa duplicare è necessario che si formi una bolla di denaturazione, e ciascun

filamento faccia da stampo per la sintesi del filamento complementare. Man mano che la duplicazione

prosegue la bolla si ingrossa, e la duplicazione termina quando la bolla arriva sul lato opposto e quindi il DNA

è completamente denaturato andando a

formare due anelli. Il punto in cui avviene

la nuova sintesi, e quindi il DNA

parenterale si divide, prende il nome di

forcella di duplicazione.

Per ogni bolla di duplicazione (zona in cui

si duplica il DNA), ci sono 2 forcelle di

duplicazione. La replicazione inizia in un

punto di origine fisso e procede in

direzioni opposte fino a che le forcelle di

replicazione si incontrano.

Perché il DNA si possa duplicare ci devono essere degli enzimi (catalizzatori) che prendono il nome di DNA

polimerasi.

Esistono tante DNA polimerari, ognuna con un compito specifico.

Quella che duplica il DNA nella forcella di duplicazione è la DNA POLIMERASI III.

DNA polimerasi I: Ripara le lesioni subite dalla catena di DNA e interviene nel processo di saltature dei

- frammenti Okazaki

DNA polimerasi II: partecipa alla riparazione della catena di DNA.

- DNA polimerasi III: E’ responsabile dell’allungamento della catena del DNA durante la duplicazione.

-

Gli enzimi della DNA POLIMERASI III sono enzimi multimerici formati da più proteine 11

La DNA polimerasi III esiste in una forma più semplice (con attività minima e di tipo distributivo) formata da

ε, θ)

tre subunità (α, e in una forma molto più attiva (nota come oloenzima) costituita da 11 subunità (proteine)

di 10 tipi differenti.

Le varie subunità dell’oloenzima hanno ciascuna una funzione specifica:

α

1. la subunità aggiunge nucleotidi all’estremo 3’ catalizza il trasferimento di un gruppo nucleotidico in

direzione 5’→3’. (sintesi del legame fosfoesterico)

β

2. la subunità aggancia saldamente l’oloenzima alla catena di DNA, è quindi responsabile del

meccanismo progressivo dell’oleonzima.

τ

3. la subunità ha il compito di tenere unite come dimero 2 molecole di DNA POLIMERASI III.

ε

4. la subunità ha attività esonucleasica 3’→5’, corregge eventuali errori di duplicazione.

γ.

5. le rimamenti 6 subunità formano il complesso

β β,

La subunità conferisce alla DNA polimerasi III il suo meccanismo d’azione progressivo. Due subunità

infatti, formano un dimero ad anello attorno al DNA che scorre lungo l’α-elica trascinando con sè tutto

β γ.

l’oloenzima. L’iniziale formazione dell’anello richiede l’idrolisi i ATP ad opera del complesso

La DNA polimerasi sintetizza il legame fosfoesterico nella catena di accrescimento.

L’enzima sintetizza il DNA aggiungendo un nucleotide per volta all’estremità 3’ (OH) della catena in

accrescimento.

Il nucleotide aggiunto deriva da un desossiribonucleoside -5’-trifosfato (dNTP). Per questa reazione è, inoltre,

++

necessario Mg , poiché i dNTP per poter essere utilizzati devono essere complessati con il magnesio.

Lo scheletro zucchero-fosfato si forma per trasferimento di un gruppo nucleotidico da un dNTP al gruppo

ossidrilico 3’ del residuo nucleotidico terminale della catena di DNA in allungamento.

Poiché il nucleotide si possa legare all’OH in 3’ serve molta energia, fornita dai legami di anidride. L’idrolisi

del pirofostato (si scinde prima il legame PPP e poi quello tra PP) ad opera di una pirofosfatasi, fornisce

l’energia necessaria alla reazione e l’enzima (DNApolimerasi III) opera a una velocità di circa 1000 residui

nucleotidici al secondo (in 20 minuti E.coli duplica il suo DNA). I nucleotidi aggiunti alla catena rimarranno

monofosfati.

Quando la DNA polimerasi duplica il DNA aggiunge un nuovo nucleotide, e teoricamente potrebbe agire con

due meccanismi diversi:

1. processo di sintesi definito distributivo: dopo che un nuovo residuo è stato aggiunto alla catena,

l’enzima potrebbe staccarsi e legarsi a caso su di un’altra catena incompleta.

2. processo definito progressivo: una volta che la polimerasi ha iniziato la sintesi del DNA su un filamento

che funge da stampo, rimane legata ad esso finche’ tale filamento non viene completamente

reduplicato.

Si è dimostrato sperimentalmente che la DNA polimerasi III ha sempre un meccanismo progressivo, quindi le

forcelle non si staccano finché non arrivano sul lato opposto e l’intero cromosoma è stato completamente

reduplicato. 12

La DNA-polimersai III è capace di correggere gli errori sulla catena di DNA in formazione causati da un non

ε

corretto accoppiamento delle basi. Questo è possibile perché la subunità possiede un’attività

5’

esonucleasica 3’ che idrolizza il legame fosfodiestere tra il residuo terminale e il resto della catena.

ε

Se il nucleotide aggiunto è sbagliato, non può formare i ponti H e la subunità si comporta come un

enzima idrolasi: aggiungendo H 0 degrada il filamento di DNA.

2

Si tratto di un enzima nucleasi: enzima che idrolizza un acido nucleico aggiungendo H 0; se taglia il

2

filamento in un punto qualsiasi si parla di endonucleasi, se invece lo taglia a partire dalle estremità si chiama

esonucleasi.

L’oloenzima incorpora una base sbagliata circa una volta ogni 10.000 reazioni di allungamento (tasso di

-4 ε

errore 10 ). Questi errori vengono corretti dall’attività esonucleasica della subunità che, a sua volta, ha un

-3

tasso di errore di 10 . La combinazione di queste due reazioni sequenziali produce un tasso complessivo di

-7

errore di 10 (uno dei più bassi mai riscontrati per un enzima). Quindi enormi molecole di DNA vengono

reduplicate con pochissimi errori.

Un errore ogni tanto viene fatto, troppi sarebbero pericolosi per la cellula, ma ogni tanto alcune mutazioni

sono utili all’evoluzione.

Altre proteine collaborano, inoltre, con la DNA-POLIMERASI III.

1. le elicasi catalizzano lo svolgimento dell’α-elica a livello delle forcelle di duplicazione.

2. Le topoisomerasi impediscono l’accumulo di tensione evitando dei superavvolgimenti che

bloccherebbero lo scorrimento della denaturazione

3. La proteina che si lega ad un singolo filamento (SSB) impedisce ai filamenti di DNA denaturati di

riformare l’α-elica o delle anse a forcina, che arresterebbero l’azione della polimerasi.

Per evitare che i due filamenti del DNA si richiudano prima di far da stampo per i due filamenti complementari,

oppure che si creino delle anse che ne impedirebbero l’avanzamento, si inseriscono altre proteine che si

legano al filamento singolo denaturato (single strand binding proteins). 13

La DNA-polimerasi III catalizza l’allungamento della catena

di DNA solo in direzione 5’3’.

Tuttavia, un esame della forcella di duplicazione rivela che

la sintesi 5’3’ può essere continua solo su di un filamento.

Nell’altro filamento, che ha una polarità opposta, la sintesi

5’3’ procede in direzione opposta rispetto alla forcella di

duplicazione, quindi non sarebbe possibile una sintesi

continua.

C’è un filamento con 3’ giusto che può essere sintetizzato

in maniera continua, mentre dall’altro lato la DNA

polimerasi III di tanto in tanto si deve staccare e tornare

indietro sintetizzando per frammenti. Il filamento

sintetizzato in maniera continua prende il nome di filamento guida, l’altro formatosi per polimerizzazione

5’3’ in direzione opposta alla forcella filamento lento.

Il filamento lento deve necessariamente essere sintetizzato in

frammenti (di kazaki), ciascuno dei quali viene polimerizzato

in direzione 5’3’. Solo in un secondo momento i frammenti

neosintetizzati vengono legati tra loro a formare un

filamento completo (sintesi discontinua del DNA).

Per ogni forcella di duplicazioni vi sono due DNA polimerasi

III.

Esiste, però, un ulteriore problema. Nessuna DNA-polimerasi

è in grado di iniziare la polimerizzazione del DNA ex novo

(senza un filamento di stampo), ma tutte richiedono per

poter agire la presenza (di un acido nucleico) del gruppo

ossidrilico 3’ di un corto RNA innesco.

Perciò la sintesi di tutti frammenti di Okazaki (così come del filamento guida) comincia con quella di un RNA

innesco 5’3’ al quale la DNA-polimerasi III può, poi, aggiungere desossiribonucleotidi.

l’RNA innesco viene

sintetizzato da un enzima

detto primasi (o dnaG) che

sintetizza un corto RNA

innesco (< 15 nucleotidi) al

secondo.

Poiché la forcella di

duplicazione si muove ad

una velocità di circa 1000

nucleotidi al secondo, la

primasi produce un innesco

ogni 1000 nucleotidi.

A mano a mano che altro DNA a filamento singolo compare dietro ad essa, la primasi avanza con la forcella

di duplicazione e sintetizza nuovi inneschi per nuovi frammenti di Okazaki.

La primasi è un componente del primosoma, che è un complesso multimerico che opera a livello della forcella

di duplicazione. Il primosoma contiene almeno 17 polipeptidi differenti, tra i quali (oltre alla primasi) 6

molecole di DNAb e 6 molecole di DNAc. Questi due enzimi sono delle elicasi che srotolano e separano i due

filamenti dell’α-elica utilizzando a tale scopo l’energia fornita dall’idrolisi di molecole di ATP. 14

A mano a mano che altro DNA a filamento singolo compare dietro al primosoma, la primasi avanza con la

forcella di duplicazione e sintetizza nuovi inneschi per nuovi frammenti di Okazaki. Una volta che i frammenti

di Okazaki sono stati sintetizzati, gli RNA innesco vengono idrolizzati sia dalla RNAsi H che dalla componente

esonucleasica della DNA-polimerasi I.

A questo punto il filamento lento è costituito da molti frammenti di Okazaki separati da discontinuità dovute

all’assenza di alcuni nucleotidi (dove prima erano presenti gli RNA innesco).

La DNA-polimerasi i possiede diverse attività:

Attività esonucleasica 5’ 3’ rimuove l’RNA innesco all’estremità di ciascun frammento di okazaki (esiste

- 

anche un’attività esonucleasica 3’ 5’ che corregge il filamento di DNA qualora vengano inseriti

nucleotidi erroneamente appaiati).

Attività polimerasica 5’ 3’ riempie le lacune tra i frammenti di okazaki rimaste dopo l’idrolisi degli RNA

- innesco attaccando nuovi nucleotidi

Il processo mediante il quale la DNA-polimerasi i sostituisce gli RNA innesco con DNA viene definito

traslazione delle discontinuità.

Lo stadio finale nella maturazione del filamento lento di DNA è la saldatura dei frammenti di Okazaki da parte

dell’enzima DNA-ligasi, che catalizza la formazione di un legame fosfodiestere tra il gruppo ossidrilico 3’

dell’estremità di un frammento di Okazaki e il gruppo fosfato 5’ del frammento di Okazaki adiacente.

In vivo la sintesi del filamento guida e di quello lento avvengono approssimativamente alla stessa velocità,

poiché i due processi di reduplicazione sono fisicamente accoppiati: le proteine di coinvolte nella sintesi dei

due filamenti si associano a formare un unico complesso proteico, il replisoma.

Un replisoma presente nella forcella di duplicazione risulta perciò costituito da:

2 molecole di DNA-polimerasi III (una per il filamento guida e una per quello lento). Le due

- POLIMERASI III sono legate insieme ma vanno in due direzioni opposte.

1 primosoma costituito dalla primasi (che sintetizza gli RNA innesco) e dalle elicasi (DNAb e DNAc).

- 1 proteina REP che svolge la stessa funzione di DNAb (cioè srotolare l’α-elica) ma per il filamento

- guida.

4 proteine SSB che si legano al filamento singolo che fa da stampo per il filamento lento e gli

- impediscono di riformare l’α-elica o anse a forcina.

Varie DNA-topoisomerasi che allentano la tensione che si accumula a monte della forcella per lo

- srotolamento dell’α-elica. Il flamento di DNA che fa da stampo per il

flamento lento, siccome le due polimerasi III sono

legate ma si spostano in direzioni opposte, si

ripiega all’indietro, formando un’ansa via via

maggiore. Quando la DNA-polimerasi III che

sintetizza il filamento lento incontra l’RNA

innesco attaccato al frammento di Okazaki

precedente, si dissocia dallo stampo di DNA

β

(l’anello si apre) ma rimane associata al

τ.

replisoma per mezzo delle due subunita

Questa DNA-polimerasi non è assolutamente progressiva, in quanto di tanto in tanto si stacca dal DNA.

β

Nel frattempo il primosoma produce un nuovo RNA innesco a livello del quale l’anello si riassocia e così

ricomincia la sintesi di un nuovo frammento di Okazaki. 15

DUPLICAZIONE DEL DNA BATTERICO

La duplicazione del DNA batterico ha inizio in un sito unico detto sito di origine della duplicazione (oriC in E.

coli). L’oriC consiste in una sequenza consenso di 245 nucleotidi altamente conservati in quasi tutti i batteri

studiati (questo sito si è conservato durante l’evoluzione). È uguale in tanti organismi ma ve ne sono anche

altre.

Adiacente ad oriC è presente un segmento di DNA ricco di A e T che facilitano la denaturazione dell’α-elica

(solo due ponti H tra le basi).

Orin-C presenta quattro siti di legame che all’inizio del processo di reduplicazione del DNA interagiscono con

dnaA, una proteina tetramerica (16 monomeri) indispensabile per l’avvio della reduplicazione.

Una volta che le prime 4 dnaA si sono legate ad oriC, molte altre se ne aggiungono e si viene così a formare

una struttura particolare, con un nucleo centrale proteico attorno al quale si avvolgono delle spire di DNA

che si deforma e determina una piccola denaturazione del DNA (bolla di denaturazione o duplicazione).

Questo processo di denaturazione richiede anche idrolisi di ATP. La bolla è ancora troppo piccola per la DNA

polimerasi III, così in questa “bolla” di DNA denaturato cominciano ad assemblarsi i componenti del replisoma

a partire dalle elicasi (DNA B e C) che allargano la bolla e le SSB che impediscono alla bolla di richiudersi. Poi

riescono a inserirsi anche le quattro DNA polimerasi III e le elicasi si staccano e se ne vanno.

Per prima cosa le primasi sintetizzano l’RNA innesco per il filamento guida della forcella opposta.

in un secondo momento la primasi comincia a sintetizzare anche l’RNA innesco per il filamento lento. in

questo modo la reduplicazione procede per ambedue i filamenti stampo in entrambe le direzioni (quindi

sono necessarie 4 molecole di DNA-polimerasi III).

Avviene la medesima cosa nell’altre forcella, ma in maniera speculare, perciò un filamento, a partire da oriC,

alla sua sinistra viene sintetizzato in maniera continua alla destra invece discontinua. Il filamento finale (due

per ogni bolla di duplicazione) saranno per metà, da oriC, filamenti guida e per metà filamenti lenti. 16

ORGANIZZAZIONE E DUPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI

All’interno di un nucleo di una cellula in interfase vi è la cromatina, sostanza amorfa formata

α

fondamentalmente da DNA. Non è più un DNA circolare ma formato da lunghissime eliche con un inizio e

α

una fine, spesso queste eliche sono decine.

La cromatina è formata da:

DNA

- RNA

- Proteine che regolano l’attività del DNA (Istoni e non)

-

La cromatina durante la duplicazione cellulare si avvolge su sé stessa formando dei bastoncelli che prendono

il nome di cromosomi.

Durante la divisione cellulare (fase M) si presentano fortemente addensati, mentre durante l’interfase (nella

quale il DNA è trascritto e si replica) i cromosomi sono così finemente dispersi da non poter essere

singolarmente individuati.

La cromatina dispersa è presente in due diverse forme:

 ETEROCROMATINA: più condensata e che non viene trascritta. È formata da fili sottili dello spessore

di circa 30 nm (fibre 30 nm).

 EUCROMATINA: meno condensata e i cui geni vengono trascritti. Probabilmente con struttura a filo di

perle.

Ciascuna cellula può attivare la trascrizione di alcuni geni oppure bloccare quella di altri.

Nei nucleoli avviene la sintesi del DNA ribosomiale

Le principali proteine presenti nella cromatina sono gli istoni. In ogni cellula sono presenti circa 60 milioni di

copie di ciascuno dei cinque tipi di istoni (chiamati H1, H2A, H2B, H3, H4).

In tutti gli istoni sono presenti molti residui di arginina e di lisina. Di conseguenza gli istoni risultano dotati

di una carica netta positiva (sono cioè basici) che gli permette di interagire facilmente con l’impalcatura

fosfodiestere del DNA (che ha, invece, carica negativa).

Quando la cromatina viene trattata con una soluzione

a forza ionica molto bassa (acqua distillata, cioè molto

diluita, 0-5 mm) forma una struttura che al microscopio

elettronico appare come un “filo di perle”.

Ciascuna “perla” è un complesso di DNA e istoni detto

nucleosoma.

Il nucleosoma è costituito da 4 coppie di ciascun istone

H2A, H2B, H3, H4 (ottamero istonico) complessate con

circa 146 coppie di basi del DNA. La lunghezza del DNA

interposta tra i nucleosomi varia da 15 a 55 coppie di

basi.

Un segmento pari a 1.8 giri di DNA si avvolge intorno all’ottamero istonico. In questo modo la lunghezza

complessiva del DNA si riduce di circa 6 volte. 17

L’istone H1 è invece associato con la parte esterna del nucleosoma.

I nucleosomi hanno un diametro di circa 10 nm,

quindi la fibra di cromatina con la forma di un

“filo di perle” è una fibra di 10 nm di diametro.

Questa fibra di 10 nm assume, poi, una

disposizione tridimensionale compatta che da

origine alle fibre di cromatina di 30 nm visibili

in microscopia elettronica. Interazioni tra gli

istoni H1 determinano la formazione di questa

struttura che viene definita solenoide.

La struttura del solenoide è costituita da supereliche formate da sei fibrille di nucleosomi di 10 nm. Questa

struttura è stabilizzata dagli istoni h1 che formano un polimero ad elica che corre lungo il centro del solenoide.

Notare l’asse centrale costituito dagli istoni H1 che formano un polimero che stabilizza la struttura.

DUPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI

La duplicazione del DNA negli eucarioti avviene con modalità simili a quelle dei procarioti. Anche negli

eucarioti la sintesi del filamento guida è continua mentre quella del filamento lento è discontinua.

I frammenti di Okazaki sono però più corti (100-200 nucleotidi) perché la forcella di duplicazione si sposta

più lentamente (e la primasi anche in questo caso sintetizza circa un RNA innesco al secondo).

Negli eucarioti sono presenti almeno 15 differenti DNA-polimerasi.

Le principali sono: α

DNA-polimerasi : Ha attività primasica e poi aggiunge all’estremo 3’ dell’RNA innesco un frammento di

- DNA di circa 20 nucleotidi. Sia al filamento guida che al filamento lento

β:

DNA-polimerasi catalizza processi di riparazione del DNA

- 18

δ α

DNA-polimerasi : Agisce dopo la DNA polimerasi e catalizza la sintesi del filamento lento sintetizza

- i filamenti di Okazaki

ε α

DNA-polimerasi : Agisce dopo la DNA polimerasi e catalizza la sintesi del filamento guida.

- α

La DNA-polimerasi è un complesso multimerico che presenta sia attività polimerasica che attività primasica

(infatti anche negli eucarioti per la sintesi del DNA è necessario un RNA innesco).

-9 -11

Poiché in vivo il DNA eucariotico viene duplicato con un tasso d’errore di 10 -10 ma le principali DNA-

-3 -5

POLIMERASI eucariotiche hanno un tasso d’errore di 10 -10 , devono esistere dei meccanismi che

permettono di correggere gli errori (proofreading = correzione di bozze).

δ ε

In effetti le DNA polimerasi ed presentano un’attività esonucleasica 3’ –> 5’ con cui rimuovono i nucleotidi

erroneamente inseriti.

Mentre nei procarioti inizia in un solo punto e di lì procede, la duplicazione del DNA, negli eucarioti (nei quali

la forcella di duplicazione sposta più lentamente) inizia in molti siti contemporaneamente, altrimenti sarebbe

troppo lenta perché il numero di geni è molto maggiore. Si sa poco sui siti d’inizio negli eucarioti:

probabilmente essi sono localizzati nei punti in cui la cromatina si lega alle proteine del citoscheletro nucleare.

Le forcelle di duplicazione degli eucarioti si muovono l’una verso l’altra, fondendosi e formando bolle di

dimensioni via via crescenti. La velocità di spostamento delle forcelle è circa trenta volte minore negli eucarioti

che nei procarioti, ma poiché si formano così tante forcelle, tutto il DNA di una cellula eucariotica può essere

duplicato in meno di un’ora.

Negli eucarioti la duplicazione del DNA avviene in concomitanza con la sintesi degli istoni (duplicazione

istonica). A ogni duplicazione del DNA, infatti, il numero di istoni si raddoppia. Sintesi del DNA e duplicazione

istonica richiedono, però, enzimi totalmente differenti. Probabilmente gli istoni appena sintetizzati formano

nucleosomi che si associano alla doppia elica che contiene il filamento lento, mentre gli istoni originari

rimangono associati alla doppia elica che contiene il filamento guida.

CONTROLLO TRASCRIZIONALE NEI PROCARIOTI

La funzione del DNA è quella di dire ad una cellula tutto quello che deve fare, e come deve diventare.

Fondamentalmente porta l’informazione per le proteine di quella cellula. Tra DNA e proteine si inserisce come

intermediario la molecola di RNA. Tutte e tre collaborano per la sintesi delle proteine o traduzione.

La trascrizione è la sintesi, invece, di tutte e tre le forme di DNA. Il solo DNA che viene tradotto è l’mRNA.

La trascrizione dei geni sia in procarioti che in eucarioti è regolata da sequenze specifiche di DNA (che

possono essere immediatamente a monte del sito d’inizio della trascrizione, negli organismi più semplici, ma

anche all’interno del gene) che costituiscono delle regioni di controllo della trascrizione, basate su sequenze

di basi precise. Solo l’1/2% del DNA porta informazioni per la traduzione, la maggior parte è costituita da

queste sequenze. Confrontando le sequenze che precedono il sito d’inizio della trascrizione di molti geni

procarioti è possibile evidenziare delle caratteristiche comuni si possono individuare delle sequenze-

consenso (dette promotori) che derivano dall’accordo di un gran numero di esempi

CARATTERISTICHE DEL PROMOTORE DI E. COLI:

 Il primo nucleotide ad essere trascritto è di solito un nucleotide purinico.

 Nella regione –10 (rispetto al sito d’inizio della trascrizione) la maggior parte dei geni contiene una

sequenza del tipo TATAAT (sequenza tata box).

 Nella regione –35 la maggior parte dei geni ha una sequenza del tipo TTGACA (regione -35).

 Le regioni –10 e –35 sono separate da 17 nucleotidi.

Il promotore della trascrizione è formato da queste due sequenze consenso. 19

RNA-POLIMERASI NEI PROCARIOTI (enzima che sintetizza l’mRNA)

Nei procarioti è presente un’unica RNA-polimerasi che catalizza la sintesi di tutte e tre le forme di RNA.

σ)

Questo enzima è un oligomero, costituito da cinque subunità di quattro tipi diversi (α fl fl’ noto come

2

oloenzima.

Ciascuna subunita’ svolge un compito specifico:

β’ lega aspecificamente il DNA,

β’ contiene il sito attivo dell’enzima per sintesi RNA,

α lega fattori supplementari di regolazione,

70

σ avvia il processo di trascrizione.

70 ⟿

σ α ββ’σ

La subunità si dissocia abbastanza facilmente dall’oloenzima lasciando un nucleo polimerasico 2

riconosce il promotore e se ne lega strettamente è la subunità sigma.

L’RNA-POLIMERASI si lega per circa 3 secondi in maniera aspecifica con il DNA (grazie ad interazioni

elettrostatiche con lo scheletro zucchero-fosfato) e diffonde lungo l’α-elica scandagliando circa 2000 coppie

di basi. Se nei circa 3 secondi in cui rimane attaccata al DNA incontra il promotore si lega più saldamente e

inizia la trascrizione, altrimenti si stacca e si rilega da qualche altra parte.

L’enzima sintetizza l’RNA aggiungendo nucleotidi all’estremo 3’, i precursori saranno ribonucleosidi trifosfato.

Il legame che si forma è un legame fosfodiestere e si libera pirofosfato (PP).

In questo processo vengono utilizzati solo ribonucleosidi trifosfati (UTP, GTP, CTP, ATP).

Trascrizione DNA in mRNA

α

1. la subunità si lega alla sequenza tata.

2. I due filamenti di DNA si denaturano e si forma una bolla di trascrizione di 18 coppie di basi.

3. Si forma un corto RNA innesco di 10 nucleotidi (deve avere l’estremità 3’ verso il gene che deve essere

trascritto). Questa prima fase è molto lenta e spesso l’RNA innesco si distacca, perché vi sono pochi ponti

H, la trascrizione deve così ricominciare da capo.

4. Quando l’innesco raggiunge la lunghezza critica di 10 nucleotidi, l’RNA-POLIMERASI subisce una

transizione dallo stadio di inizio a quello di allungamento, si allontana dal promotore e comincia a

muoversi lungo lo stampo di DNA.

σ, σ

5. A questo punto si stacca perché in presenza di l’oloenzima non riuscirebbe ad allontanarsi dal

σ-promotore

promotore (il legame è, infatti, troppo forte).

σ

6. viene quindi sostituito da altre proteine (ad esempio NUS-A) che permettono alla trascrizione di

procedere avendo un legame meno forte col DNA e intervengono nella terminazione della catena: l’RNA-

polimerasi, arrivata in fondo al filamento, si stacca perché si stacca anche NUSA.

Durante lo stadio di allungamento l’RNA-POLIMERASI è a contatto con un segmento di DNA di 30 coppie di

basi. Di queste, 18 sono fuse (srotolate) e 12 di esse formano un’elica ibrida RNA -DNA.

Ogni qual volta un nuovo nucleotide si unisce all’estremità 3’ della catena di RNA nascente, si devono avere

le seguenti modifcazioni:

1. la lunghezza dell’ibrido RNA-DNA deve ridursi per fusione di una coppia di basi all’estremità a valle

della bolla di trascrizione.

2. Una coppia di basi del DNA deve fondersi all’estremità a monte della bolla.

3. Una coppia di basi del DNA deve riformarsi all’estremità a valle della bolla.

4. la RNA-polimerasi deve avanzare lungo il DNA di un nucleotide.

La bolla è sempre di 18 nucleotidi e l’elica ibrida di 12 nucleotidi. Ogni volta che l’oloenzima aggiunge un

nuovo nucleotide al 3’ si denatura una coppia di nucleotidi al 5’ così che l’ibrido rimanga sempre di 12. 20

Ogni volta che si denatura una coppia di nucleotidi a monte se ne chiude una a valle, quindi la bolla scorre

invece di ingrandirsi, rimanendo sempre con 18 nucleotidi.

L’energia per muovere tutto questo avviene dai nucleotidi trifosfati che fanno da promotori, permettendo la

sintesi del legame fosfoesterico e la liberazione di energia.

(L’energia necessaria per tutte queste reazioni è quella che si libera nell’idrolisi dei legami dei nucleosiditrifosfati e nella

rinaturazione dei filamenti di DNA)

TERMINAZIONE DELLA SINTESI DELL’ Mrna

La trascrizione inizia perché c’è il promotore. Il segnale per l’inizio della traduzione sono le sequenze di

consenso, l’AUG (metionina), prima della quale troviamo la sequenza di Shine - Dalgarno che segnala che

l’AUG successiva deve dare inizio alla traduzione.

Alla sequenza di Shine-Dalgarno si legano i ribosomi.

Il ribosoma scorre lungo l’mRNA generando la proteina. Quello che fa terminare la traduzione è il codone di

stop (UGA). 21

TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE

Cos’è che fa terminare lo scorrimento della DNA-polimerasi sul DNA?

Normalmente gli mRNA terminano con una sequenza palindromica seguita da parecchie U. La sequenza

palindromica (cioè con una simmetria binaria o autocomplementare) forma un’ansa forcina che rallenta

l’avanzamento di NUS-A. L’ibrido DNA-RNA è tenuto insieme solo da coppie A-U, molto deboli e che si

scindono facilmente. L’RNA-polimerasi e l’mRNA si staccano e la bolla si rinatura.

In certi mRNA mancano sia le sequenze palindromiche che le regioni ricche di U: In questi casi l’mRNA si lega

ρ.

ad una proteina esamerica detta

La proteina rho idrolizza l’ATP formando ADP+P; è una molecola che dentro di sé ha tantissima energia che

viene utilizzata in caso di necessità.

Questa proteina avvolge attorno a sé circa 80 nucleotidi dell’mRNA e in un processo ATP-dipendente dissocia

l’mRNA dalla bolla di trascrizione.

Nei batteri la trascrizione è strettamente associata alla traduzione: le cellule procariotiche non presentano

nucleo perciò il DNA non si trova all’interno di quest’ultimo, quindi la sintesi proteica può iniziare

immediatamente. eucarioti

Al contrario, negli , il DNA si trova nel nucleo e, prima di passare alla sintesi proteica, si completa la

trascrizione nel nucleo, al segmento di mRNA vengono aggiunti all’estremo 5’ un cappuccio (7metil-

Guanosinappp), una coda all’estremità 3’ di

adenosina e vengono tolti gli introni, poi l’mRNA

fuoriesce mediante i pori nucleari e una volta nel

citoplasma, prende avvio la sintesi proteica ad

opera dei ribosomi, ovviamente assenti nel

nucleo cellulare.

procarioti

Nei invece, ancora prima che la

trascrizione sia completata, i ribosomi si legano

all’mRNA e cominciano a sintetizzare proteine, di

conseguenza, i ribosomi nascondono il filamento

ρ

di mRNA e impediscono a di legarsi ad esso. Quando la trascrizione passa oltre il sito dove termina la sintesi

proteica (cioè i codoni UAA, UAG, UGA) il filamento di mRNA non è più protetto dai ribosomi e diviene

ρ

accessibile a la trascrizione a questo punto si arresta. 22


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2.03 MB

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mango13

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3 mesi fa


DESCRIZIONE APPUNTO

Struttura, proprietà chimico-fisiche e funzioni degli acidi nucleici. Accrescimento 5’-3’degli acidi nucleici. Organizzazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti. Modalità e complessi enzimatici coinvolti nella duplicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti. Definizione del gene. Codice genetico: triplette, degenerazione del codice genetico, vacillamento della terza base, codoni di Stop. Modalità e complessi enzimatici coinvolti nei processi di trascrizione e traduzione nei procarioti. Sintesi proteica nei procarioti


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in Produzione e gestione degli animali in allevamento e selvatici
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher mango13 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica e biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Cascio Paolo.

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