Biologia Molecolare - Replicazione del DNA

DNA polimerasi è costituita da 4 subunità, 2 delle quali ad attività primasica e 2 ad attività

α

DNA polimerasica; l'attività primasica consiste nella capacità di sintetizzare una piccola sequenza

di mRNA, importante nella formazione del primer; il primer è una piccola sequenze di

nucleotidi costituita da 10-20 ribonucleotidi iniziali, seguiti da 15 deossiribonucleotidi; il primer

costituisce l'innesco per l'avviamento dell'attività delle altre DNA polimerasi; la DNA polimerasi

non possiede attività proof reading, e quindi non può controllare se i deossiribonucleotidi

α

aggiunti sono effettivamente quelli corretti; per tale motivo, la sequenza di 15

deossiribonucleotidi del primer viene eliminato assieme ai 10-20 ribonucleotidi. Le DNA

polimerasi e (la prima probabilmente dimerica, con una subunità ad attività elicasica, e la

δ ε

seconda monomerica), invece, posseggono oltre all'attività polimerasica anche attività proof

reading, e con essa un sito di espulsione idrolitica, che consente l'idrolisi dei legami

fosfodiesterei tra nucleotidi errati e la loro eliminazione. Il livello di correzione di queste 2 DNA

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polimerasi è pari a 10 , di cui un fattore 10 determinato dall'attività proof reading (attività 3'-5'

5

esonucleasica) e un fattore 10 determinato dalla capacità della DNA polimerasi di riconoscere il

nucleotide corretto da aggiungere; ad esso si associa un sistema proteico di correzione che

2

aumenta il livello di guardi della DNA polimerasi di un fattore pari a 10 , che consente una

correzione perfetta.

La struttura della componente polimerasica è comune a tutte le DNA polimerasi, ed è simile ad

un pungo di una mano destra, costituito da 3 domini, il dominio del palmo, il dominio delle

dita ed il dominio del pollice.

Nel dominio delle dita è presente il sito catalitico ed il canale in cui è inserito il DNA template

ed il primer, a costituire una doppia elica; nel sito catalitico devono inoltre giungere i

deossiribonucleotidi necessari per l'allungamento del primer. Come nella RNA polimerasi, nel

2+

sito catalitico della DNA polimerasi sono presenti 2 ioni Mg , entrambi coordinati, uno

responsabile della deprotonazione del 3'-OH del primer (migliorando il suo carattere

nucleofilo) e l'altro responsabile del legame con il pirofosfato e dell'avanzamento della

reazione. Il deossiribonucleotide è sprovvisto del 2'-OH, e quindi ha dimensioni più ridotte

rispetto ai ribonucleotidi; ciò costituisce una garanzia, poiché i ribonucleotidi, essendo di

dimensioni maggiori, hanno difficoltà ad entrare nel canale di ingresso, avente un diametro

ridotto grazie alla presenza di 2 aminoacidi, una arginina ed una istidina, che consentono quindi

l'ingresso dei soli deossiribonucleotidi, nonostante la concentrazione di questi ultimi sia

decisamente più bassa rispetto a quella dei ribonucleotidi. Altri aminoacidi sono invece

responsabili del riconoscimento dei gruppi fosfato e e solo quando vengono stabiliti legami

β γ,

a idrogeno con questi gruppi fosfato il deossiribonucleotide viene stabilizzato all'interno del sito

catalitico dell'enzima. La base viene discriminata grazie alla corretta formazione dei legami a

idrogeno con il DNA template; quando la formazione dei legami a idrogeno è quello ottimale,

il sito catalitico raggiunge il suo livello termodinamicamente favorevole e l'attività catalitica si

innesca. Contestualmente, il dominio delle dita subisce una variazione conformazionale che

piega l'elica di cui è costituito, verso il dominio del palmo, schiacciando il deossiribonucleotide

e sequestrandolo nel sito catalitico nella posizione corretta, ovvero con il suo 5'-fosfato in

prossimità del 3'-OH del primer o dell'ultimo deossiribonucleotide del filamento in crescita;

l'appaiamento scorretto delle basi provoca invece un ripiegamento del dominio delle dita molto

lento, che consente al ribonucleotide errato di allontanarsi dal sito catalitico; tanto più corretto

è l'appaiamento delle basi, tanto più veloce è la catalisi (meccanismo di selezione cinetica). Oltre

ad avere attività polimerasica, il dominio del palmo ha anche attività 3'-5' esonucleasica (tranne

la DNA polimerasi Tornando all'attività polimerasica, il deossiribonucleotide da aggiungere

α).

dovrà trovarsi perfettamente appaiato con la prima base libera del DNA template; infatti, se il

DNA template fosse lineare, il deossiribonucleotide libero potrebbe appaiarsi alla prima base

libera del DNA template così come ad altre basi con cui può instaurare il numero di legami a

idrogeno ottimale, ma poiché l'appaiamento deve avvenire solamente con il primo

deossiribonucleotide libero del template, è necessario che sia esposto solo tale

deossiribonucleotide e che il resto del DNA template venga occultato; la presenza di alcuni

aminoacidi nel sito catalitico piegano di 180° il filamento template a livello del primo

deossiribonucleotide libero, consentendo al sito catalitico di rendere disponibile solamente

questo deossiribonucleotide del DNA template, in modo tale che l'aggiunta del

deossiribonucleotide si complementi con esso. A seguito della formazione della nuova coppia di

basi, a causa di una variazione conformazionale del palmo, la doppia elica si sposta di 3,4 Å,

esponendo quindi il successivo deossiribonucleotide libero del template, pronto per appaiarsi

con il prossimo deossiribonucleotide corretto in aggiunta; la nuova coppia di basi formata,

inoltre, prenderà contatto con altri aminoacidi tramite il solco minore; qui vengono controllati

il diametro interno ed esterno della coppia, nonché l'angolazione dei 2 zuccheri; se le

dimensioni non corrispondono a quelle desiderate (regole di Chargaff), la coppia errata viene

indirizzata in un altro sito di espulsione del nucleotide errato, ed il doppio filamento viene

nuovamente spostato nel sito catalitico, in attesa dell'arrivo del deossiribonucleotide corretto.

Il motivo per il quale la DNA polimerasi necessita di un primer per poter iniziare la sua attività

polimerasica, sta nel fatto che cominciare con un primo nucleotide libero presuppone la

presenza contemporanea di un 3'-OH e di un 5'-fosfato entrambi liberi, rendendo possibile

quindi l'attacco in entrambe le estremità; per poter essere certi che venga riconosciuto come

unico gruppo reattivo il 3'-OH, il nucleotide deve essere già inserito in un filamento

preformato, ovvero il primer, che impedisce così errori di posizionamento del primo nucleotide

da parte della DNA polimerasi. Il dominio del pollice è quel dominio che blocca al proprio

interno l'innesco appaiato con il filamento template; questo dominio, infatti, lega

esclusivamente doppi filamenti.

Durante la replicazione intervengono anche altre proteine, con scopi vari. La proteina HSSB,

chiamata anche fattore di replicazione A, agisce esclusivamente sul filamento lagging, con lo

scopo di coprire tale filamento ed evitare che questo rimanga esposto nel momento in cui si

trova singolo, a causa del ritardo della sua duplicazione, proteggendolo dall'attacco delle

endonucleasi. Un'altra proteina che interviene durante il processo di duplicazione è la proteina

PCNA (antigene nucleare di proliferazione cellulare) o proteina stabilizzatrice della DNA

polimerasi; la DNA polimerasi, infatti, come la RNA polimerasi, ha difficoltà a restare

posizionata sul DNA template; la PCNA ancora l'enzima al DNA; nell'uomo si trova sotto

forma di trimero, che si assembla sulla DNA polimerasi come una ciambella, all'interno della

quale scorre il DNA template; la DNA polimerasi non lega la PCNA, ed infatti, dopo aver

α

sintetizzato un filamento di circa 30 nucleotidi, si distacca dal DNA. Ogni peptide costituente la

PCNA possiede un dominio di legame PIP (legame per proteine); uno di questi lega la DNA

polimerasi, mentre gli altri legano proteine accessorie, quali ad esempio la proteina HSSB. Il

dominio di legame PIP lega, oltre all'enzima e alla proteina HSSB, anche altre proteine quali la

DNA ligasi, che ha lo scopo di legar fra di loro i vari frammenti di Okazaki, gli enzimi di

riparazione del DNA chiamati proteine mismatch, o le HAT, le HDAC ed i complessi di

rimodellamento.

Come detto precedentemente, i complessi Mcm 2 e 7, quando vengono attivati, essendo delle

elicasi aprono il doppio filamento di DNA e reclutano la DNA polimerasi sulla forcella di

α

replicazione; l'apertura dell'elica causa la formazione di superavvolgimenti sia a monte che a

valle dell'apertura, e quindi saranno presenti anche topoisomerasi che correggeranno i

superavvolgimenti in eccesso. La DNA polimerasi agisce sia sul filamento leader, sintetizzando

α

il primer, che sul filamento lagging, sintetizzando un primer per frammento di Okazaki (ogni

100-200 nucleotidi circa); mancando della PCNA, subito dopo la sintesi del primer si allontana

dal DNA. Un fattore proteico responsabile dello switching delle polimerasi (RF-C), sostituisce la

DNA polimerasi con la nel filamento lagging e con la nel filamento leader. Le PCNA

α δ ε

interagiscono con la RF-C e resteranno legate alle DNA polimerasi per tutto il processo di

sintesi. La DNA polimerasi interromperà di volta in volta la sua azione ogni volta che va in

δ

contro ad un primer sintetizzato dalla DNA polimerasi nell'avanzare, la DNA polimerasi

α; δ

scalzerà di volta in volta le HSSB che proteggevano il filamento lagging, che si legheranno con il

PCNA, e si arresterà nel momento in cui incontrerà nella sua direzione di sintesi un nuovo

primer. Poiché il filamento lagging possiede più di un primer, portatori di errori, esso necessita

di un meccanismo di riparazione particolare; esso è mediato dalla RNAasi H, che idrolizza i

legami fosfodiesterei che tengono uniti 2 ribonucleotidi, e che consente quindi l'eliminazione

di 9 dei 10 ribonucleotidi del primer, e dalla DNAasi ad attività FLAP, che riconosce i legami

fosfodiesterei tra ribonucleotidi e deossiribonucleotidi e tra 2 deossiribonucleotidi; quest'ultimo

enzima possiede una bassa processività e si arresta dopo 10-15 nucleotidi, evitando così

l'eliminazione di deossiribonucleotidi aggiunti dalla DNA polimerasi La FLAP 1 agisce in

δ.

associazione con la DNA polimerasi la FLAP, infatti, posiziona la polimerasi sul 3'-OH

δ; δ

dell'ultimo nucleotide del filamento precedente, allo scopo di riparare il gap dovuto

all'eliminazione del primer. L'ultimo legame tra il 3'-OH libero e il 5'-fosfato, entrambi legati al

filament