Biologia Molecolare - Replicazione del DNA

Duplicazione del DNA

La duplicazione o replicazione del DNA è il meccanismo molecolare attraverso cui viene prodotta una copia del DNA cellulare. Ogni volta che una cellula si divide, infatti, l'intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso alla progenie. La replicazione del DNA negli eucarioti possiede tre caratteristiche:

• Semiconservativa: ogni nuova molecola di DNA contiene un filamento del vecchio DNA ed un filamento neosintetizzato.
• Semidiscontinua: quando il DNA parentale viene separato nei due filamenti, le DNA polimerasi possono sintetizzare i filamenti complementari; poiché i due filamenti del DNA parentale hanno andamento antiparallelo, e poiché la polimerizzazione da parte della DNA polimerasi avviene solo in direzione 5'-3', uno dei due filamenti verrà duplicato con continuità ed il filamento neosintetizzato prenderà il nome di filamento leader, mentre il filamento antiparallelo è duplicato a segmenti tra loro separati ma ciascuno nella direzione corretta; i frammenti di Okazaki così ottenuti, una volta legati tra loro dall'enzima ligasi, danno origine al filamento antiparallelo del filamento leader, prendendo il nome di filamento lagging.
• Bidirezionale: la crescita dei due filamenti avviene in entrambe le direzioni dall'origine di replicazione.

Il cromosoma umano è costituito da 3 miliardi di paia di basi; considerando che la processività della DNA polimerasi è bassa, con una velocità di sintesi di 50-100 nucleotidi al secondo, si potrebbe concludere che per la sintesi di un nuovo filamento di DNA è necessario parecchio tempo. La sintesi del DNA avviene durante la fase S del ciclo cellulare, che dura 3-4 ore; all'interno di un cromosoma, quindi, non esiste una sola origine di replicazione.

Il DNA umano si suddivide in unità replicative autonome chiamate repliconi, in numero variabile da 10.000 a 100.000 nel genoma umano e costituiti da 30.000 a 300.000 paia di basi per replicone. All'interno di un cromosoma esistono sequenze di repliconi che si duplicano prima di altre; i gruppi di repliconi che si duplicano indipendentemente tra loro ma contemporaneamente costituiscono un'unità replicativa; le unità replicative aventi sequenze codificanti (trascrizionali) si duplicano più velocemente.

Non sono state ancora trovate sequenze promoter di origine delle replicazione di un replicone, pur essendoci. Probabilmente tali sequenze sono particolarmente ricche in adenina e timina, dal momento che queste due basi si legano con due soli legami a idrogeno e sono quindi più facilmente scindibili; inoltre le sequenze trascrizionali, più velocemente duplicate, sono ricche in queste basi (vedi la TATA box, sito promoter trascrizionale), così come i DNA linker.

Complessi proteici chiamati ORC (complesso di riconoscimento dell'origine) si organizzano in fase G1 e restano inattivi fino all'inizio della fase S; gli eventi molecolari che avvengono durante la fase G1 modificano la conformazione del complesso ORC, attivandolo e consentendogli il reclutamento della DNA polimerasi. Il complesso ORC è costituito da sei subunità ad attività ATPasica, che sono responsabili del riconoscimento dell'origine di replicazione, assieme a un dimero associato ad esso a costituire un trimero, costituito dalle proteine Cdc 6 (componente di divisione cellulare) e Cdt 1 (inibitore del trimero).

Successivamente al riconoscimento dell'origine di replicazione, vengono reclutati due complessi proteici, chiamati Mcm 2 ed Mcm 7, entrambi costituiti da sei subunità, che si associano al DNA in una struttura circolare cava all'interno (struttura a ciambella), attraverso la quale viene alloggiato il doppio filamento di DNA integro. Viene così a costituirsi il complesso prereplicativo Pre-RC.

A questo punto intervengono cicline di fase S ad attività chinasica, che fosforilano le serine e le treonine di proteine target, tra cui il complesso ORC, la Cdc 6 e la Cdt 1; la fosforilazione di Cdt 1 consente il legame di questa proteina con la proteina geminina, che conduce la Cdt 1 al suo processo di degradazione; l'assenza di Cdt 1 consente la fosforilazione di Cdc 6, che fosforilata perde l'affinità verso il complesso ORC e si allontana da esso; infine, viene fosforilato anche il complesso ORC, che subisce una modifica conformazionale delle subunità ATPasiche che ne attiva le loro attività idrolitiche, con conseguente attivazione dei complessi Mcm 2 e 7, aventi a loro volta attività elicase.

L'attività elicase dei complessi Mcm determina l'apertura dell'elica del doppio filamento di DNA, il fattore scatenante il reclutamento della DNA polimerasi, perché quest'ultima necessità di un DNA stampo, e l'apertura dell'elica ne fornisce due. Viene a costituirsi la cosiddetta forcella di replicazione.

Il processo di duplicazione non solo deve avvenire in un momento particolare del ciclo cellulare, ma deve avvenire anche una sola volta; per questo motivo durante la fase S il livello di fosforilazione delle proteine è mantenuto alto, per impedire che sul complesso ORC vengano reclutate più di una DNA polimerasi.

Sono state isolate più di 15 tipologie di DNA polimerasi; tra queste, quelle coinvolte nella duplicazione del DNA sono la DNA polimerasi avente attività specifica.