Biologia molecolare, prof. Landsberger

① FASE DI INIZIO PRINBOW

Prinbow si dedica alla ricerca della sequenza promotore, cercando com’è

fatta. A questo scopo fa selezionare il promotore in vitro all’oloenzima in

modo tale da formare complessi chiusi sul genoma di Coli; procede poi

isolando le sequenze su cui l’enzima è situato. Ciò viene fatto digerendo

con delle esonucleasi il DNA che non è protetto dall’enzima,

successivamente si isolano e si clonano queste sequenze.

Ciò è permesso perché le esonucleasi mangiano le estremità libere del

DNA fino al momento in cui non incagliano nell’RNA Po, che funge da

ingombro sterico.

Prinbow sequenza in questo modo 5-6 frammenti.

Di qui si accorge, contrariamente a ciò che si aspettava, che la sequenza riconosciuta dall’RNA Pol non era

sempre la stessa, ma queste sequenza hanno tra loro caratteristiche che le accumunano:

- L’inizio della trascrizione è sempre una purina;

- Se si allineano le cinque sequenze si nota che esiste una sequenza ricca in

T e A, ovvero una sequenza consensus, sita in prossimità del -10 (a monte

dell’inizio di trascrizione), dove c’è sequenza di 6 nucleotidi.

TATAAT, detta ‘sequenza -10’ o ‘Prinbow box’.

Altri scienziati sospettano tuttavia che le conclusioni di Prinbow non siano altro che semplificazioni;

quindi tramite il clonaggio e il sequenziamento, si sequenziano a monte dell’inizio di trascrizione alcuni

nucleotidi per 100 frammenti di DNA differenti che sanno essere promotori.

Allineando 100 promotori differenti trovano caratteristiche del promotore di Coli:

- Purina a punto +1 di trascrizione

- Seq. -10 Prinbow Box

- Esiste un’altra consensus a -35

- Una distanza ottimale tra seq. -10 e -35 di 16/19

paia di basi.

- Elementi UP

Il promotore di coli è quindi molto semplice, presente su tutti i geni riconosciuti dall’RNA polimerasi.

Tramite esperimenti di mutagenesi si vede che la sequenza riconosciuta per prima dal è il -35, sequenza

chiave per aumentare l’affinità e quindi quella più coinvolta per il complesso chiuso; di qui, eventuali

mutazioni su questa sequenza, riducono la frequenza del complesso chiuso, ma non influenzano la

conversione in modello aperto. Nel complesso aperto, invece, è maggiormente coinvolta la sequenza -10

quindi, eventuali mutazioni su questa sequenza, riducono la frequenza del complesso aperto, ma non

influenzano la conversione in modello chiuso. 72

La sequenza intorno al punto di inizio influenza inoltre la velocità con cui si ha il rilascio del promotore,

quindi non possiamo prevedere la forza totale di un promotore solo in base alle sue sequenze a -10 e -35.

La sequenza del promotore influenza l’efficacia di trascrizione, la forza di un promotore, definita come

l’affinità della RNA Pol per il promotore, oppure definita come il numero di trascritti che parte da quel

promotore nell’unità di tempo, concetto che racchiude capacità di fare complesso chiuso, complesso

aperto e promoter clearance. In Coli possiamo riconoscere promotori forti e

promotori deboli in base a quanto sono vicini;

in questo organismo, inoltre, la maggior parte della

trascrizione è quella definita trascrizione basale, ovvero

quella che avviene solo con promotore e RNA Pol (non

sono infatti necessari fattori trascrizionali aggiuntivi).

Questi geni trascrivono il gene semplice in funzione

delle sequenze -10, -35 e la loro distanza relativa. Ci

sono casi in cui il promotore è così debole che deve avvalersi di fattori trascrizionali, in questo caso sono

promotori regolati e si parla di trascrizione regolata.

L’RNA Pol è caratterizzata da una protrusione che va verso

le sequenze a monte (elemento up), ciò è importante

perché permette di capire come l’elemento up può

attivare il promotore.

Se il promotore è debole è necessaria una nuova

interazione che trattenga l’RNA Pol sul promotore: si

mette un sito di legame per un fattore trascrizionale, che è

una proteina che riconosce una sequenza di DNA e vi si

lega. Questo fattore interagirà sia con il DNA sia con l’RNA

Pol a livello della coda con interazione proteina-proteina,

garantendo maggiore affinità di RNA Pol con promotore

aumentando il tempo in cui il complesso si mantiene aperto.

Se il promotore è forte a sufficienza, così come in Coli, non sono necessari i fattori di trascrizione.

La trascrizione regolata quindi può prevedere attivazione o repressione. Nel caso della repressione in Coli si

ha a che fare con un repressore che si lega a una sequenza denominata operatore, quella è sequenza legata

dai repressori nel promotore dell’RNA Pol di coli e, in genere in questo caso, esso inibisce la trascrizione

perché il fattore trascrizionale si lega e costituisce un ingombro sterico.

Nel caso dell’attivazione è facilitazione del binding, nel caso della repressione è l’opposto.

Ci sono altri meccanismi di attivazione trascrizionale in Coli. Esistono fattori trascrizionali che facilitano

l’apertura della doppia elica a -10, su questi fattori il DNA si attorciglia su di essi, mutando la propria

topologia, facilitando così la formazione da complesso chiuso a complesso aperto.

Tutto questo discorso vale per i procarioti, negli eurcarioti i meccanismi sono di gran lunga più complessi.

Tuttavia, Coli ha inventato un artificio per il quale, in alcune

condizioni particolari, non utilizza più il classico fattore sigma,

ma ne utilizza di alternativi.

Se Coli viene messo in un ambiente con variazioni di

temperatura, tollera questo calore creando proteine che

permettono di mantenere tutte quelle funzioni vitali. La cellula

deve quindi affrontare un problema di fronte a uno shock termico in modo repentino e lo fa tramite un

cambio di sigma, utilizzandone uno che trascrive geni che possiedono -35 e -10 differenti.

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IL FOOTPRINTING Il footprinting (impronta) è una tecnica che

permette di identificare in vitro il punto della

sequenza in cui avviene il legame tra DNA e

proteine in maniera sequenza specifica. Per

capire dove il fattore si è legato si rende il

promotore radioattivo su una sola estremità,

ovvero si marca un solo filamento.

Per marcarne solo un tratto si può usare, per

esempio, un enzima di restrizione; questo

filamento viene detto filamento sonda. La

sonda è messa in due provette diverse in

uguali quantità di cui una fungerà da controllo negativo e l’altra sarà saggiata.

Nella provetta di controllo viene messa sì la sonda (DNA radioattivo), ma non ; nell’altra la sonda con, ad

esempio, 70, oltre ai soliti sali, magnesio e tampone. Nella prima provetta il DNA resta a doppio filamento,

mentre nell’altra, se 70 interagisce con il promotore, si legherà dove riconosce la sua sequenza, per

ipotesi -35. Si formeranno quindi complessi proteina-DNA, con posizionato nella stessa maniera. Una

volta che si è legato, in entrambe si aggiunge un’endonucleasi detta DNasi I, un enzima che, senza

specificità di sequenza, idrolizza legami fosfodiesterici all’interno del DNA. Questo enzima viene fornito in

bassa quantità, in modo tale da ridurre statisticamente la sua azione a un link (un legame fosfodiesterico)

per molecola.

Come risultato si otterrà che, nel controllo, tutti i legami fosfodiesterici saranno stati staccati; nell’altra

provetta, invece, non vengono tagliati quei legami dove è situato , perché funge da ingombro sterico.

Dopo avere effettuato una precipitazione con etanolo, si carica il tutto su gel di poliacrilamide, che separa

le molecole in maniera tale da discriminare quelle molecole che differiscono anche per un solo nucleotide.

Nel controllo si otterrà come risultato che tutte le bande corrispondenti ai frammenti possono essere

tagliati dalla DNAasi I, mentre nel campione con rimane un buco, indice del sito dove c’era la proteina

70. EMSA (Elettroforetic Mobility Shift Assay)

L’altra tecnica in grado di fornire l’informazione per cui una proteina

si è legata o meno è un metodo più semplice, col difetto che non ci

informa su quali sono le sequenze dove si lega; è il cosiddetto saggio

di ritardo elettroforetico o EMSA.

Vengono allestite tre provette, la prima è quella di controllo dove c’è

solo il DNA, detto DNA nudo; la seconda contiene il DNA e 70; la

terza contiene il DNA e 38.

Ci si aspetta che nel DNA nudo non succederà nulla, mentre, dove

riconoscerà la sonda, si formerà un complesso, che sia esso con 70,

o 38.

Dopo aver effettuato l’incubazione si caricano i campioni su gel di

agarosio. Il DNA nudo correrà senza intoppi, il secondo campione

anche (vedi immagine), mentre il terzo compie un diverso decorso.

Esso fa infatti più fatica a passare attraverso le maglie, ciò significa

che il campione ha subito un ritardo elettroforetico. Ciò è la

dimostrazione che la proteina si è legata a quel frammento di DNA.

Non si sa dove, ma si sa che si è legata.

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② FASE DI ALLUNGAMENTO IN COLI

Negli anni sono stati effettuati studi che comportano la visione dell’RNA Pol sotto forma di cristalli l,

attraverso cui si è capito come funziona l’enzima.

Il cristallo è a forma di chela di granchio. In questo enzima ci sono le due subunità e ’ (blu e viola), che

dal punto di vista cristallografico si vede che delimitano un canale

di 25 Armstrong, quindi una perfetta apertura per agganciare una

doppia elica, dove vengono collocate 16bp in coli (mentre in

eucarioti ce ne stanno 25pb).

E’ inoltre visibile che i residui presenti nella parte interna verso il

canale sono carichi positivamente (DNA carico negativamente),

mentre all’esterno di e ’ ci sono cariche negative.

Sono poi presenti due subunità (verde e gialle) esterne alla chela che hanno la funzione di tenere insieme

la struttura. Il pallino rosso è il magnesio, che rappresenta il centro catalitico dell’enzima; esso è così

importante che nell’evoluzione si sono conservati quei tre amminoacidi utili alla reazione con il magnesio.

Se si mutagenizza uno solo di questi tre aminoacidi Coli muore, in quanto esso serve per legami

fosfodiesterici. Quando il DNA entra nel canale si trova a scontrarsi con un ‘cuneo’ di

aminoacidi, il quale serve a favorire la denaturazione, mantenendo i due

filamenti separati. Dopo un po’, finito l’effetto del cuneo, il DNA si

richiude ed esce a doppio filamento. Ci sono vari canali: canale di uscita

del DNA, canale di uscita dell’RNA, canale di ingresso del DNA e canale di

ingresso degli rN