Biologia molecolare, prof. Landsberger

Biologia molecolare 5

Frazione media

È presente in centinaia o migliaia di copie e nell’uomo rappresenta il 25% del genoma. Sono sequenze ripetute intersperse; trasposoni e retrotrasposoni attivi o non più attivi, sequenze LINE che derivano probabilmente da un qualcosa che assomigliava a un retrovirus. È inoltre rappresentata da gruppi di geni, i cui prodotti servono alla cellula in grande quantità, come tRNA, mRNA e istoni.

Frazione veloce

È stata originariamente identificata tramite separazione secondo gradiente di cloruro di cesio, con il quale il nostro genoma veniva separato per densità. Ciò che succedeva è che le sequenze che erano a contatto con una densità diversa creavano un diverso profilo di DNA sull’analisi col cloruro di cesio; questi tratti particolari prendono il nome di satellite perché erano situati a parte rispetto al resto ed erano costituiti da una frazione altamente ripetitiva. Rappresenta una percentuale del genoma molto elevata, che costituisce il 5-6% del genoma. Se immagino di rompere il genoma in pezzi, otterrò due densità diverse, una del satellite e una normale.

Il DNA altamente ripetuto è costituito da DNA a brevi sequenze molto semplici che si ripetono molteplici volte nel nostro genoma, spesso una di fianco all’altra (in tandem). Preso quindi il genoma e avendolo rotto, si pone in una soluzione 6M di cloruro di cesio, si centrifuga per un tempo adeguato e il risultato finale sarà un gradiente di densità, la cui massima concentrazione di cloruro di cesio sarà sul fondo fino ad arrivare alla minima concentrazione che starà in alto. Con centrifugazioni si creano tanti anelli di densità diverse, su cui il DNA andrà a depositarsi in base alla propria densità. Successivamente viene fatto un forellino nella provetta, è collegato un tubo che si attacca a una pompa, che fa cadere varie gocce in varie provette, le quali verranno successivamente lette allo spettrofotometro, da cui saprò la densità e di conseguenza dove sarà sito il DNA e dove il DNA satellite. Questo metodo può essere utilizzato non solo per DNA, ma anche per altre molecole, il gradiente è all’equilibrio e bisogna fare attenzione a non agitare per creare squilibri.

Sono stati messi a punto altri gradienti oltre a questo, come quelli che separano per peso/conformazione e sono detti gradienti di saccarosio, dove si sta separando non per densità ma per quello che è il peso delle molecole e quindi la capacità di migrare in base al tempo di centrifugazione. Esse non sono all’equilibrio e non si formano in centrifugazione ma li dobbiamo preformare. Sono presenti due vasi comunicanti collegati tra loro con un tubicino ed è presente un rubinetto, che può essere chiuso o aperto. Dopo aver chiuso il rubinetto, nel primo vaso viene messo del saccarosio al 5%, e nel secondo saccarosio al 20%, questo perché si vuole ottenere un gradiente dal 5 al 20%. Le due soluzioni, essendo in equilibrio, non si muovono ma, una volta aperto il rubinetto, si causa uno scompenso e il saccarosio percola in una provetta, dove si vuole formare il gradiente. In questo modo la soluzione scende nelle varie provette, continuandosi a diluire di volta in volta.

Svedberg: rapporto tra la velocità e la forza centrifuga.

Sequenza consenso

Per ottenerla si sequenzia tante volte uno tratto di DNA e si vanno poi a vedere dove sono site le ripetizioni: per esempio, nel caso qui a fianco, su dieci sequenze lette nella prima riga, in 8/10 prevale la presenza A prima riga preferenza per la A seconda riga preferenza G terza riga preferenza C.

L'organizzazione genomica a confronto

• E. Coli: 57 geni, non sono presenti introni e nemmeno sequenze ripetute.
• Lievito: 31 geni, non sono presenti sequenze ripetute, ci sono pochi introni e il gene dell’RNA polimerasi è più grande rispetto che in E. Coli.
• Drosophila: 9 geni, c’è la comparsa delle sequenze ripetute, il gene della RNA polimerasi è cresciuto a causa della presenza di introni.
• Uomo: 2 geni, sono presenti tantissimi introni e il gene della RNA polimerasi è cresciuto ancora a causa della presenza degli stessi introni, sono presenti anche tante sequenze ripetute.

Geni omologhi: sono geni che hanno una sequenza in parte simile, questo perché probabilmente sono derivati da un simile processo evolutivo. Il tutto è indipendente dalla stessa funzione, in quanto è un’omologia di frequenza e non funzionale.

Geni ortologhi: sono dei geni che hanno omologia funzionale ed evolutiva.

Geni paraloghi: sono dei geni collegati da una relazione all’interno della stessa specie; probabilmente derivano da una duplicazione genica di uno stesso genoma.

Sintenia genica: si parla di sintenia genica quando si trova una correlazione tra un cariotipo di una specie e il cariotipo di un’altra specie che fa pensare ai genetisti che questi cromosomi siano derivati da uno stesso antenato che ha avuto tantissime mutazioni che possono essere delezioni, traslocazioni e li ha diversificati in vari modi; per esempio nel topo e nell’uomo il cariotipo è simile. I genetisti hanno quindi pensato che ciò fosse dovuto a una derivazione comune del cariotipo e si sono diversificati con 80/120 mutazioni in generale.

La Southern Blot

È una procedura in disuso, utilizzabile per fare diagnosi, anche se spesso viene sostituita con la PCR, che è più veloce, più sensibile, meno laboriosa e non radioattiva. Serve per trovare se in una miscela di molecole di DNA separate per elettroforesi siano o no presenti molecole identiche o simili a una molecola d'interesse.

• Purificazione e digestione del DNA genomico: il DNA è purificato e diviso in elementi discreti tramite digestione con enzimi di restrizione in modo tale che diano bande utilizzabili per analisi (es BAMH1).
• Elettroforesi con gel d’agarosio: faccio il solito procedimento e controllo con i coloranti.
• Denaturazione: è necessario avere un’ibridazione, ma per averla è necessario denaturare il DNA. Per farlo servirà calore, quindi il gel d’agarosio non è utilizzabile. Quindi per denaturarlo viene messo in soda (pH alto); a questo punto bisogna trasferire il tutto su un altro supporto, in particolare su un filtro (di nylon, cellulosa, materiali sintetici..). Il DNA, essendo idrofobico, si lega alla nitrocellulosa con interazioni.
• Rinaturazione: si passa dal pH alto, lo faccio scendere a pH neutro, che comporta una rinaturazione.
• Trasferimento / Blot: avviene per capillarità, in una vaschetta in cui c’è un tampone. È messo cartoncino che può toccare il tampone passando per parte mediana. La carta assorbente di tampone fa da ponte. Sopra c’è gel. Sopra gel filtro di nylon tagliato della stessa dimensione del gel. Sopra al filtro tanti strati di carta assorbente e un peso. Lasciato riposare ottengo che carta assorbente richiama tampone dal gel, c’è flusso di tampone che passa dal basso verso la carta assorbente e col tampone si muove il DNA.
• Preibridazione: DNA è incolore, non si vede nulla, è necessario poterlo rilevare. Il filtro di nitrocellulosa o nylon è affine al DNA a singolo filamento ed è un problema, perché ci sono dei punti dove DNA c’è e altri non c’è, se metto sonda a singolo filamento va ad attaccarsi al filtro e otterrei una cosa al rovescio, perché si attaccherebbe dove non mi serve. Va bloccata possibilità che la sonda si leghi dove non c’è DNA, per farlo uso preibridazione, ovvero un momento in cui filtro rimane a contatto con una soluzione altamente concentrato di acido nucleico a singolo filamento non radioattivo che non interferisce con l’esperimento. Otterrò bande nuove e non ci saranno più disponibili ad appaiarsi in maniera specifica con la sonda perché occupate da questo DNA. Viene utilizzato il DNA di sperma di salmone.
• Ibridazione a temperatura non troppo elevata: cerco filamento appaiabile alla sonda. Se troppo elevata non si appaierà nulla perché è T di denaturazione. Se troppo bassa (37°) porta ad appaiamenti parziali e ciò fa sì che si appai un po’ ovunque. Tutto il gioco è che avendo le sonde in largo eccesso bisogna maneggiare la temperatura per trovare una cosa completamente complementare. Userò quindi una temperatura abbastanza elevata.
• Lavaggi: si fa passare tanto tampone in quantità elevata, che stacca così i residui e l’aspecifico.
• Rivelazione del segnale: mediante autoradiografia con lastra radiografica, che è sensibile a radioattività, la si lascia per un tot in scatola, il filtro emette le radiazioni, eccita molecole in lastra e tramite sviluppo fotografico si avrà un segnale.

Oggi l’ibridazione con Southern serve a:

• Individuazione del gene che si sta cercando
• Osservazione di transgeni inseriti
• Diagnosi, esempio anemia falciforme, dove il cambio di base è sito di un enzima di restrizione. Se io taglio il gene di una globina normale l’enzima di restrizione MST1 effettuerà tagli e poi si utilizzerà sonda, che riconoscerà un solo frammento di 1.15Kb. Se invece uso mutata l’enzima taglia in posizioni diversi e sarà di 1.35 Kb. Se è eterozigote avrà un 1.15Kb e un 1.35Kb controllo positivo: è sano o malato? Malato controllo negativo: paziente sano.
• Un’altra possibile applicazione è quella rappresentata dalla PCR o dal sequenziamento.

DNA Fingerprint

Sfrutta le sequenze ripetute, in questo disegno ci sono 8 presunti frammenti di restrizione, ne avremo 3 che si possono ibridare alla sonda. Sfrutta DNA satellite, FBI ha identificato 12 tipi di DNA satellite il cui insieme sono statisticamente validi per definire se il DNA appartiene a uno o all’altro individuo.

Biologia molecolare – Lez 6

La sonda

Ricordiamo che cos’è una sonda: Una sonda per ibridazione è una molecola di DNA marcata, con una sequenza complementare al DNA bersaglio da individuare. Poiché la sonda e il DNA bersaglio sono complementari, esse possono appaiarsi e ibridare, e affinché ciò possa avvenire sia il DNA trasferito sia il DNA sonda devono essere denaturati a filamenti singoli.

La marcatura di una sonda può essere ottenuta utilizzando traccianti radioattivi sotto forma di dNTP o NTP radioattivi, oppure traccianti fluorescenza, enzimatici o chemioluminescenti. Nella marcatura radioattiva si usa generalmente il ³²P dNTP o lo ³⁵S dNTP. In tutti i casi si pone il problema di incorporare i dNTP modificati (solitamente radioattivi) in un frammento di DNA; dobbiamo, cioè, preparare una sonda da utilizzare in esperimenti di ibridizzazione molecolare.

La preparazione di una sonda: Random priming

• Stabilire chi è la sonda
• Rendere radioattiva la sonda, qui è possibile usare la PCR, ma la macchina si sporca di radioattività. La tecnica largamente utilizzata è la random priming, ovvero viene utilizzato un innesco (primer) a caso, vale a dire che si utilizzano dei primer casuali, in una miscela composta di esanucleotidi a singolo filamento con sequenze casuali, in modo tale che almeno uno sia complementare.
• Denaturazione e aggiunta di esanucleotidi
• Abbasso della temperatura a temperatura ottimale (max 18 legami H) e appaiamento con una sonda su entrambi i filamenti, uno o più primer diventano innesco
• Fornisco DNA-pol e i deossinucleotidi trifosfati e a 37° (ideale per pol) c’è attacco di deossinucleotidi e vedrò marcatura

Marcatura delle estremità

Nel momento in cui si vuole ottenere una marcatura evidente solamente alle estremità e non in tutto il filamento si utilizzeranno diversi procedimenti:

1. Trattamento con fosfatasi: in questo caso viene utilizzata dapprima la fosfatasi, che è un enzima, il quale rimuove i gruppi fosfati ai 5’ ed è poi rimossa tramite proteinasi o alzando un po’ la temperatura (questo perché la maggior parte delle proteine è termosensibile 60°) oppure con l’etanolo. Successivamente viene aggiunto il polinucleotide chinasi, ATP marcato con ³²P, sale, magnesio e tamponi. La chinasi fosforila il DNA, staccando il fosfato dalle posizioni e posizionandolo sul 5’, che risulterà in questo modo marcato.
2. Primer marcato + PCR
3. Con enzima di restrizione (UNA ESTREMITA’): Prendiamo in considerazione un campione di DNA a doppio filamento non marcato che ha a una delle estremità un sito per un enzima di restrizione. Una volta che è stato utilizzato l’enzima di restrizione si avrà che al 3’ ci sarà un attacco per la DNA polimerasi, che può ora copiare fino a dove ha il filamento complementare; per permettere questo vengono forniti i dNTP, di cui uno sarà marcato. In questo processo si sfrutta l’enzima di Klenow, che è un frammento del DNA di E. Coli, che aiuta la polimerasi del DNA, in quanto questa ha attività polimerasica 5’ 3’ e attività esonucleasica. Qualora il laboratorio volessi marcare il DNA utilizzerò questo frammento di proteòlisi, in quanto esso non possiede attività esonucleasica, ma solo polimerasica. In base al lavoro necessario si utilizzerà una marcatura diversa.

Traccianti utilizzati

Si può effettuare la marcatura in in situ o in vitro, a seconda di ciò che si vuole ottenere.

I marcatori radioattivi sono quelli costituiti da fosforo, zolfo e trizio: essi hanno diverse potenze di radioattività, diverso raggio di diffusione e di conseguenza una diversità di segnale.

• Fosforo: dà un forte segnale, ne esistono due isotopi. ³²P : è il migliore, ma ogni 15 giorni decade, quindi spesso è uno spreco di denaro. ³³P : è utilizzato più spesso perché non decade così velocemente come il fosforo 32, ha infatti un periodo di decadimento di 60 giorni.
• Zolfo: ha il vantaggio di una vita media lunga e fornisce un segnale più debole ma più nitido.
• Trizio: è una molecola con la capacità di diffondere molto limitata.

I marcatori non radioattivi sono quelli costituiti da fluorocromi, digossigenina e biotina.

• Fluorocromi: un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (ultravioletti) emette nel visibile, in particolare nel rosso, nel blu e nel verde. È una tipologia di marcatura diretta, in quanto si va subito a vedere il risultato.
• Digossigenina e Biotina: sono marcature indirette, in quanto è necessario utilizzare una seconda molecola per la rilevazione. Digossigenina DIG: La digossigenina (DIG) è uno steroide cardiotonico isolato da Digitalis Purpurea. Il metodo si basa sull’incorporazione della digossigenina nel DNA mediante random priming. La sonda così marcata viene rivelata da un sistema immuno-enzimatico che usa un anticorpo diretto contro la digossigenina (anti-DIG) coniugato con la fosfatasi alcalina. Si forma così un complesso che può essere evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o chemiluminescente della fosfatasi alcalina. La specificità dell’anti-DIG per la DIG fornisce un’alta sensibilità di rilevazione. Biotina: Si basa sull’incorporazione nel DNA di un analogo di un nucleotide contenente la biotina mediante random priming. Dopo l’ibridazione, la sonda marcata con biotina può essere rilevata mediante il legame forte e specifico con l’avidina, coniugata con fosfatasi alcalina.

In teoria i nucleotidi trifosfati possono essere coniugati a qualunque tracciante a condizione che questo non pregiudichi il normale funzionamento delle polimerasi.

• Nucleotidi coniugati a fluoresceine: Sebbene l’eccessivo ingombro sterico non permetta l’allungamento della catena, i marcatori sono molto utilizzati come primers o sotto forma di ddNTP in procedure di sequenziamento automatizzate.
• Nucleotidi biotinilati: Questi nucleotidi biotinilati portano un residuo di biotina legato ad un UTP in posizione 5’. La risultante struttura mima bene quella dell’TTP e viene tollerata bene dalla DNA polimerasi durante l’allungamento della catena.
• Nucleotidi coniugati alla digossigenina: La digossigenina è uno steroide isolato da digitalis purpurea. Anch’essa si lega al 5’ dell’UTP e, nonostante le grandi dimensioni, è ben tollerato dalla DNA polimerasi.

La Northern Blotting

A differenza del Southern blot, sviluppato per analizzare frammenti specifici di DNA, il Northern blot permette di analizzare qualitativamente e quantitativamente la presenza di specifiche molecole di RNA nell’insieme degli RNA di una cellula o di un organismo. Questa tecnica consente, quindi, di determinare il livello di espressione di un gene misurando l’accumulo di RNA messaggero da questo codificato. La Tecnica Northern permette di valutare la dimensione di un RNA messaggero di un gene, in quanto l'RNA messaggero si differenzia dagli altri RNA (RNA transfert e ribosomiale), per la presenza di una coda di polyA.

Si divide nei seguenti passaggi:

• Estraggo RNA totale dalla cellula (mRNA, rRNA, tRNA..)
• (Facoltativo) Purifico RNA poliA Da un’estrazione di RNA totale della cellula (lisi, centrifugazione, DNAsi), faccio una cromatografia per affinità usando una resina particolare: sono presente dei poly T. (oligo T sefarosio) In questo modo posso estrarre e purificare i miei RNA messaggeri. L’RNA purificato viene caricato sulla colonna cromatografica e la soluzione scende, ma si fermerà poiché formerà legami idrogeno con l’oligo T sefarosio. Lavo la colonna e poi diluisco per staccare l’mRNA dalla colonna.