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LA SOUTHERN BLOT

E’ una procedura in disuso, utilizzabile per fare diagnosi, anche se spesso viene sostituita con la PCR, che è

più veloce, più sensibile, meno laboriosa e non radioattiva.

Serve per trovare se in una miscela di molecole di DNA separate per elettroforesi siano o no presenti

molecole identiche o simili a una molecola di interessa.

1. Purificazione e digestione del DNA genomico Il DNA è purificato e diviso in elementi discreti tramite

digestione con enzimi di restrizione in modo tale che diano bande utilizzabili per analisi (es BAMH1)

2. Elettroforesi con gel d’agarosio faccio il solito procedimento e controllo con i coloranti

3. Denaturazione è necessario avere un’ibridazione, ma per averla è necessario denaturare il DNA.

Per farlo servirà calore, quindi il gel d’agarosio non è utilizzabile. Quindi per denaturarlo viene messo in

soda (pH alto); a questo punto bisogna trasferire il tutto su un altro supporto, in particolare su un filtro (di

nylon, cellulosa, materiali sintetici..).

Il DNA, essendo idrofobico, si lega alla nitrocellulosa con interazioni.

4. Rinaturazione Si passa dal pH alto, lo faccio scendere a pH neutro, che comporta una rinaturazione

5. Trasferimento / Blot Avviene per capillarità, in una vaschetta in cui c’è un tampone

E’ messo cartoncino che può toccare il tampone passando per parte mediana

La carta assorbente di tampone fa da ponte

Sopra c’è gel

Sopra gel filtro di nylon tagliato della stessa dimensione del gel

Sopra al filtro tanti strato di carta assorbente e un peso

Lasciato riposare ottengo che carta assorbente richiama tampone dal gel, c’è flusso di tampone che passa

dal basso verso la carta assorbente e col tampone si muove il DNA

6. Preibridazione DNA è incolore, non si vede nulla, è necessario poterlo rilevare.

Il filtro di nitrocellulosa o nylon è affine al DNA a singolo filamento ed è un problema, perché ci sono dei

punti dove DNA c’è e altri non c’è, se metto sonda a singolo filamento va ad attaccarsi al filtro e otterrei

una cosa al rovescio, perché si attaccherebbe dove non mi serve

Va bloccata possibilità che la sonda si leghi dove non c’è DNA, per farlo uso preibridazione, ovvero un

momento in cui filtro rimane a contatto con una soluzione altamente concentrato di acido nucleico a

singolo filamento non radioattivo che non interferisce con l’esperimento

Otterrò bande nuove e non ci saranno più disponibili ad appaiarsi in maniera specifica con la sonda perché

occupate da questo DNA

Viene utilizzato il DNA di sperma di salmone

7. Ibridazione a temperatura non troppo elevata cerco filamento appaiabile alla sonda

Se troppo elevata non si appaierà nulla perché è T di denaturazione

Se troppo bassa (37°) porta ad appaiamenti parziali e ciò fa sì che si appai un po’ ovunque

Tutto il gioco è che avendo le sonde in largo eccesso bisogna maneggiare la temperatura per trovare una

cosa completamente complementare

Userò quindi una temperatura abbastanza elevata 24

8. Lavaggi Si fa passare tanto tampone in quantità elevata, che stacca così i residui e l’aspecifico

9. Rivelazione del segnale mediante autoradiogradia con lastra radiografica, che è sensibile a

radioattività, la si lascia per un tot in scatola, il filtro emette le radiazioni, eccita molecole in lastra e tramite

sviluppo fotografico si avrà un segnale

Oggi l’ibridazione con Southern serve a:

- individuazione del gene che si sta cercando

- osservazione di transgeni inseriti

- diagnosi , esempio anemia falciforme,dove il cambio di base è sito di un enzima di restrizione

Se io taglio il gene di una globina normale l’enzima di restrizione MST1 effettuerà tagli e poi si utilizzerà

sonda, che riconoscerà un solo frammento di 1.15Kb.

Se invece uso mutata l’enzima taglia in posizioni diversi e sarà di 1.35 Kb

Se è eterozigote avrà un 1.15Kb e un 1.35Kb

controllo positivo: è sano o malato? Malato

controllo negativo: paziente sano Un’altra possibile

applicazione è quello

rappresentato dalla PCR o

dal sequenziamento.

DNA FINGERPRINT: sfrutta

le sequenze ripetute, in

questo disegno ci sono 8

presunti frammenti di

restrizione ne avremo 3 che

si possono ibridare alla

sonda

Sfrutta DNA satellite, FBI ha

identificato 12 tipi di DNA

satellite il cui insieme son

statisticamente validi per

definire se il DNA

appartiene a uno o all’altro

individuo.

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BIOLOGIA MOLECOLARE – LEZ 6

Ricordiamo che cos’è una sonda:

Una sonda per ibridazione è una molecola di DNA marcata, con una sequenza complementare al DNA

bersaglio da individuare.

Poiché la sonda e il DNA bersaglio sono complementari, esse possono appaiarsi e ibridare, e affinché ciò

possa avvenire sia il DNA trasferito sia il DNA sonda devono essere denaturati a filamenti singoli.

La marcatura di una sonda può essere ottenuta utilizzando traccianti radioattivi sotto forma di dNTP o NTP

radioattivi, oppure traccianti fluorescenza, enzimatici o chemioluminescenti.

32 35

Nella marcatura radioattiva si usa generalmente il P dNTP o lo S dNTP.

In tutti i casi si pone il problema di incorporare i dNTP modificati (solitamente radioattivi) in un frammento

di DNA; dobbiamo, cioè, preparare una sonda da utilizzare in esperimenti di ibridizzazione molecolare.

LA PREPARAZIONE DI UNA SONDA: Random priming

- Stabilire chi è la sonda

- Rendere radioattiva la sonda, qui è possibile usare la PCR, ma la

macchina si sporca di radioattività

La tecnica largamente utilizzata è la random priming, ovvero viene

utilizzato un innesco (primer) a caso, vale a dire che si utilizzano dei

primer casuali, in una miscela composta di esanucleotidi a singolo

filamento con sequenze casuali, in modo tale che almeno uno sia

complementare

- Denaturazione e aggiunta di esanucleotidi

- Abbasso della temperatura a temperatura ottimale (max 18 legami H)e

appaiamento con una sonda su entrambi i filamenti, uno o più primer

diventano innesco

- Fornisco DNA-pol e i deossinucleotidi trifosfati e a 37° (ideale per pol)

c’è attacco di deossinucleotidi e vedrò marcatura

Marcatura delle estremità

Nel momento in cui si vuole ottenere una marcatura evidente solamente alle estremità e non in tutto il

filamento si utilizzeranno diversi procedimenti:

① Trattamento con fosfatasi: in questo caso viene utilizzata dapprima la

fosfatasi, che è un enzima, il quale rimuove i

gruppi fosfati ai 5’ ed è poi rimossa tramite

proteinasi o alzando un po’ la temperatura (questo

perché la maggior parte delle proteine è

termosensibile 60°) oppure con l’etanolo.

Successivamente viene aggiunto il polinucleotide

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chinasi, ATP marcato in con P, sale, magnesio e

tamponi.

La chinasi fosforila il DNA, staccando il fosfato

dalle posizioni e posizionandolo sul 5’, che risulterà in questo modo marcato.

② Primer marcato + PCR

③ Con enzima di restrizione (UNA ESTREMITA’)

Prendiamo in considerazione un campione di DNA a doppio filamento non marcato che ha a una delle

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estremità un sito per un enzima di restrizione.

3’ OH ______5’P

5’P ______ 3’ OH

Una volta che è stato utilizzato l’enzima di restrizione si avrà che al 3’ ci sarà un attacco per la DNA

polimerasi, che può ora copiare fino a dove ha il filamento complementare; per permettere questo

vengono forniti i dNTP, di cui uno sarà marcato.

In questo processo si sfrutta l’enzima di Klenow, che è un frammento del DNA di E.Coli, che aiuta la

polimerasi del DNA, in quanto questa ha attività polimerasica 5’ 3’ e attività esonucleasica.

Qualora il laboratorio volessi marcare il DNA utilizzerò questo frammento di proteòlisi, in quanto esso non

possiede attività esonucleasica, ma solo polimerasica.

In base al lavoro necessario si utilizzerà una marcatura diversa.

TRACCIANTI UTILIZZATI

Si può effettuare la marcatura in o in , a seconda di ciò che si vuole ottenere.

I marcatori radioattivi sono quelli costituiti da fosforo, zolfo e trizio: essi hanno diverse potenze di

radioattività, diverso raggio di diffusione e di conseguenza una diversità di segnale.

Fosforo: dà un forte segnale, ne esistono due isotopi.

32

P : è il migliore, ma ogni 15 giorni decade, quindi spesso è uno spreco di denaro.

33

P : è utilizzato più spesso perché non decade così velocemente come il fosforo 32, ha infatti un periodo di

decadimento di 60 giorni.

Zolfo: ha il vantaggio di una vita media lunga e fornisce un segnale più debole ma più nitido.

Trizio: è una molecola con la capacità di diffondere molto limitata.

I marcatori non radioattivi sono quelli costituiti da fluorocromi, digossigenina e biotina.

Fluorocromi: un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (ultravioletti) emette nel

visibile, in particolare nel rosso, nel blu e nel verde.

E’ una tipologia di marcatura diretta, in quanto si va subito a vedere il risultato.

Digossigenina e Biotina, invece sono marcature indirette, in quanto è necessario utilizzare una seconda

molecola per la rilevazione. Digossigenina DIG: La digossigenina (DIG) è uno steroide cardiotonico

isolato da Digitalis Purpurea. Il metodo si basa sull’incorporazione della

digossigenina nel DNA mediante random priming.

La sonda così marcata viene rivelata da un sistema immuno-enzimatico

che usa un anticorpo diretto contro la digossigenina (anti-DIG) coniugato

con la fosfatasi alcalina. Si forma così un complesso che può essere

evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o chemiluminescente

della fosfatasi alcalina.

La specificità dell’ anti-DIG per la DIG fornisce un’alta sensibilità dirilevazione.

Biotina: Si basa sull’incorporazione nel DNA di un analogo di un nucleotide contenente la biotina

mediante random priming. Dopo l’ibridazione, la sonda marcata con biotina può essere rilevata mediante il

legame forte e specifico con l’avidina,coniugata con fosfatasi alcalina.

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In teoria i nucleotidi trifosfati possono essere coniugati a qualunque tracciante a condizione che questo non

pregiudichi il normale funzionamento dellepolimerasi.

• Nucleotidi coniugati a fluoresceine

Sebbene l’eccessivo ingombro sterico non permetta l’allungamento della catena, i marcatori sono molto

utilizzati come primers o sotto forma di ddNTP in procedure di sequenziamento automatizzate.

• Nucleotidi biotinilati

Questi nucleotidi biotinilati portano un residuo di biotina legato ad un UTP in posizone 5’. La risultante

struttura mima bene quella dell’TTP e viene tollerata bene dalla DNA polimerasi durante l’alungamento

della catena.

• Nucleotidi coniugati alla digossigenina

La digossigenina è uno steroide isolato da digitalis purpurea. Anch’essa si lega al 5’ dell’UTP e, nonostante

le grandi dimensioni è ben tollerato dalla DNA polimerasi.

LA NORTHERN BLOTTING

A differenza del southern blot, sviluppato per analizzare frammenti specifici di DNA, il northern blot

permette di analizzare qualitativamente e quantitativamente la presenza di specifiche molecole di RNA

nell’insieme degli RNA di una cellula o di un organismo. Questa tecnica consente, quindi, di determinare il

livello di espressione di un gene misurando l’accumulo di RNA messaggero da questo codificato.

La Tecnica Northern permette di valutare la dimensione di un RNA messaggero di un gene, in quanto l'RNA

messaggero si differenzia dagli altri RNA (RNA transfert e ribosomiale), per la presenza di una coda di poly

A.

Si divide nei seguenti passaggi:

1) Estraggo RNA totale dalla cellula (mRNA, rRNA, tRNA..)

1b) (facoltativo) Purifico RNA poliA Da un’estrazione di RNA totale della cellula (lisi, centrifugazione,

DNAsi), faccio una cromatografia per affinità usando una resina particolare: sono presente dei poly T. (oligo

T sefarosio) In questo modo posso estrarre e purificare i miei RNA messaggeri. L’RNA purificato viene

caricato sulla colonna cromatografica e la soluzione scende, ma si fermerà poiché formerà legami idrogeno

con l’oligo T sefarosio. Lavo la colonna e poi diluisco per staccare l’mRNA dalla colonna.

Faccio poi un tampone caldo che basta a scindere i legami.

2) Preparo un gel di agarosio denaturante

3) Carico RNA sul gel di agarosio, con corsa elettroforetica

4) Trasferisco su di un filtro di nitrocellulosa o Nylon (attenzione: non serve denaturare perché è già

denaturato e la soda disintegrerebbe!)

5) Preibrido in modo tale da coprire gli spazi liberi e poi ibrido con una sonda a DNA radioattiva

6) Lavo tutto ciò che si è legato aspecificatamente

7) Autoradiografia

Controllo:

verificare che il carico di RNA sia di uguale quantità in entrambe le parti, vale a dire che qualora io stessi

comparando i livelli di due elementi comparo i livelli di espressione di un gene.

Per verificare questo punto vengono utilizzati dei geni House Keeping, che sono quei geni sempre espressi e

di conseguenza fondamentali, per questo vengono utilizzati come punti di riferimento.

Viene effettuata un’ibridazione con HouseKeeping e si cerca il gene in entrambi i

campioni; se non c’è significa che il gene non è espresso e che di conseguenza è stato

degradato.

NB: I geni HK devono avere un peso diverso rispetto al gene target.

Una successiva colorazione con etidio di bromuro viene effettuata prima di caricare il

campione sul filtro.

Questo permetterà di capire se le quantità sono uguali e quindi se l’RNA è o meno

integro. 28 Se nel target ho presente un gene 10X rispetto al

controllo e so che lo standard interno è 2X rispetto

al controllo, il gene sarà espresso 5X

10/2=5

29

BIOLOGIA MOLECOLARE 7

DENSITOMETRIA Uno dei modi per rilevare la radioattività dal punto di vista quantitativo è

rappresentato dalla densitometria.

Si prende una lastra, la si appoggia su una fonte di luce in modo tale che si

vedano bene i segnali e, tramite una macchina detta densitometro, viene

rilevata quanta luce è passata sul nostro campione (autoradiografia), in

quanto la quantità di luce assorbita è proporzionale al segnale.

Il risultato sarà un grafico, dove risultano dei picchi in corrispondenza dei

punti dove l’assorbanza risulta maggiore.

La densitometria è un tipo di misura indiretta, in quanto non è misurato

direttamente il numero di radiazioni che ha colpito la lastra, ma i segnali

presenti sulla lastra.

ll problema qual è? E’ che questa è una lastra fotografica e si satura, vale a dire che anche se la lastra

radiografica possiede dei punti in cui la radiazione può eccitare e lasciare il segnale, a un certo punto, se le

radiazioni sono tantissime, non ci sarà più nulla di eccitabile, quindi se viene colpito 10 volte o 10000 volte

non cambia nulla il segnale è stato saturato.

Il problema è quindi che, se effettuo una densitometria, sarà impossibile sapere se il sistema è arrivato o

meno alla saturazione.

Il sistema è valido solo se sono sicura che non raggiunga saturazione.

Non è il metodo più veloce, né migliore, ma certamente più economico.

PHOSPHORIMAGING Questo metodo è in grado di misurare la radioattività e ha la caratteristica

di non saturarsi.

Il campione viene messo a contatto non con la lastra radiografica, come

avveniva con il densitometro, ma con una lastra particolare, dove le

radiazioni vanno ad eccitare la macchina del phosphorimaging.

Il filtro radioattivo viene messo a contatto con la piastra di

phophorimaging, sulla quale avrò bande radioattive che emettono

radiazioni, le quali colpiscono la piastra in maniera tale da eccitare le

molecole della piastra stessa che rimangono in uno stato eccitato.

La piastra è messa nello scanner (che appartiene sempre alla stessa

macchina), dove è presente un laser, che passa punto per punto sulla

piastra eccitandola e le eccitazioni saranno proporzionali alle radiazioni

ricevute. Durante l’emissione di luce le molecole che erano state eccitate

tornano a uno stato basale ed emettono energia sotto forma di luce; si avrà

quindi un’emissione di energia e da questa sarà possibile rilevare quante

volte è stato colpito quel punto.

Il risultato finale è un’immagine che ai nostri occhi appare come un’autoradiografia.

E’ un’ottima macchina, che funziona benissimo, ma costa 50 000 euro.

SCINTILLATORE

Si utilizza quando non ho un materiale solido da studiare, ma liquido.

Per capire meglio facciamo un esempio.

Se si volesse effettuare una sintesi del DNA e capire in due organismi quale delle DNA Pol polimerizza

meglio effettuerò il seguente procedimento:

In una provetta si inseriranno dei dNTP, di cui uno radioattivo, primer per il DNA, DNA complementare a

singolo filamento, tampone, NaCl e Magnesio. 30

In entrambe le provette avviene a questo punto la sintesi e bisognerà capire quale delle due è più

efficiente, di conseguenza bisognerà liberarsi del nucleotide in eccesso e per farlo viene utilizzato l’etanolo

e gettare via il tutto previa centrifugazione.

Avendo ora il pellet nella provetta è necessario misurarne la radioattività.

Per farlo si utilizzo uno strumento detto scintillatore, che è una macchina in

grado di prendere una provetta alla volta, portarla dentro di sé in una

camera apposta e misurarne le emissioni di luce che rispecchiano la

radioattività. Ciò che accade è che, preso il liquido radioattivo, si mette in

un’opportuna sostanza (toluene) che, quando è colpita da radiazioni, emette

un quanto di luce.

Provetta A: 20 radiazioni, 20 quanti di luce 20 c.p.m. (conte per minuto)

Provetta B: 200 radiazioni, 200 quanti d luce 200 c.p.m.

Non si satura mai.

L’IBRIDAZIONE IN SITU E’ un’altra tecnica che permette di studiare

l’espressione genica.

Anche se viene effettuata la northern blot, essa non ci

dice se il campione è espresso o meno in una cellula,

quindi si effettua l’ibridazione in situ, tramite la quale

si può andare a vedere molto finemente quali cellule

hanno il campione di interesse e quali no.

Per esempio, preso un campione, si potrà andare a

vedere se questo ha espresse o meno le cellule

tumorali, oppure, preso un gene nel cervello, si potrà

testare la sua presenza nelle varie fasi dello sviluppo.

Tutte queste sono informazioni che nella Northern si

perdono dal momento che si fa una miscela di cellule.

Si chiama ibridazione in situ poiché avviene sul luogo, sul tessuto o sulle cellule.

Per esempio, analizziamo il caso di RNA su un tessuto, cercando di capire dove esso è espresso.

Innanzitutto bisognerà ibridare con l’RNA, questo poiché la sonda deve essere il più specifica possibile e

dovrà dare un segnale altrettanto specifico e la doppia elica più stabile che esiste è quella tra RNA-RNA (più

stabile anche di DNA-DNA). Questo tipo di sonda è detta SONDA ANTISENSO o RNA ANTISENSO.

Il DNA è normalmente trascritto in direzione 5’ 3’.

L’RNA antisenso si appaia perfettamente con l’RNA di interesse e quindi dovrà essere antiparallela, ma

questo tipo di molecola nella cellula non esiste ed è allora necessario costruirla.

Come faccio a fare l’antisenso dell’RNA messaggero?

31

Immaginiamo di voler fare un esperimento di

trascrizione in vitro in cui voglio cercare se è

espresso il gene della miosina.

Trascrizione in vitro

Per farla è necessario mettere in una provetta un

RNA Pol, in particolare RNA Pol di fago, nel dettaglio

T3 o T7, che sono economiche ed efficienti.

Si aggiungono poi dei ribonucleotidi, di cui uno

dovrà essere radioattivo (es: A marcato in fosforo ),

Si mette il DNA in un plasmide, dove è sito il gene

della miosina, ovvero una sequenza che codifichi per

la proteina e un promotore, che non sarà però

quello della miosina, dal momento che, avendo una

polimerasi di fago non funzionerebbe, di

conseguenza bisognerà mettere un promotore d T3 o di T7.

A questo punto si pone la provetta a 37°, di conseguenza l’RNA Pol si attacca riconoscendo il promotore e

comincerà a trascrivere. Tuttavia sussiste un problema, vale a dire che la miosina è un gene umano, quindi

dei segnali di trascrizione umani l’RNA Pol di T7 non se ne cura e questo porterebbe a una sonda

lunghissima e inutile. Questo problema è risolto in laboratorio tramite un enzima di restrizione, che

interrompe lo stampo. Questo passaggio è chiamato RUN OFF, quindi l’RNA Pol si attacca, trascrive e cade

dallo stampo.

In tutto ciò viene utilizzato il cDNA, che è una copia a DNA del trascritto maturo, che è senza introni e

contiene quindi solo gli esoni.

Creazione dell’antisenso

Anche l’RNA Pol segue un percorso che va dal 5’ al 3’, non curante di cosa stia scrivendo, l’importante è che

abbia un promotore a cui potersi attaccare.

L’antisenso sarà fatto:

- girando di 180°

- comprando dei plasmidi che hanno due promotori, uno per l’RNA Pol e uno per l’altro, a questo punto

utilizzo il promotore T7 per il senso e l’SP6 per l’antisenso.

Per l’ibridazione in situ vengono studiati campioni che possono essere:

- Cellule (raramente)

- Fettine di tessuto (specialmente). In questo caso viene prelevata una sezione del paziente, congelata e

successivamente tagliata dal criostato per poi deporre il campione sul vetrino.

Se tutto è proceduto secondo i piani l’RNA non si è degradato e viene fatta l’ibridazione in maniera tale che

l’RNA si appai solo con il suo filamento complementare.

Viene poi lavato via dal vetrino tutto ciò che si è legato in maniera aspecifica.

Infine viene fatto uno sviluppo, in particolare, se la sonda è radioattiva, viene fatta un’autoradiografia al

microscopio (non sulla lastra ovviamente), è una radioattività che emette poco (trizio).

Se non c’è radioattività, invece, nella maggior parte delle volte viene utilizzata la digossigenina.

Whole mount (intero organismo): topolini piccoli appena concepiti

vengono deposti su un vetrino (14gg dal concepimento sono piccoli, a

18gg nascono)

Nell’immagine qui a fianco

l’RNA si è legato con la sonda in

embrioni di drosophila, in base

all’mRNA legato si capisce

quale parte del corpo sarà

cosa. Se la sonda è radioattiva si usa lastra autoradiografica e si

guarda poi al microscopio. 32

Con questa colorazione di ematossilina-eosina ci si chiede se il gene della

malattia Ratt è espresso in tutte le fasi del cervello o solo in alcune.

I topi vivono di notte e durante essa si accoppiano; per questo vengono

posti nella stessa gabbia un esemplare maschio e uno femmina. Il giorno

dopo, alzando la coda della femmina, di verifica l’accoppiamento.

Nel caso positivo questo è detto tempo zero ed è rappresentato con la E;

dopo la nascita invece viene utilizzata la P e viene sempre tenuto in

considerazione un tempo zero.

E 18.5 : 18.5 giorni dal concepimento.

P10: 10 giorni dalla nascita.

La paura è che la sonda si stia attaccando a qualcosa che non interessa, per controllare utilizzo un controllo

negativo, per il quale viene utilizzato il senso.

Il senso viene utilizzato quindi come controllo negativo, in quanto solo l’RNA antisenso può appaiarsi col

mio gene e di conseguenza see questo tratto si appiccica è perché c’è qualcosa che non è andato come

sarebbe dovuto andare.

FISH (Fluorescence in Situ Hybridization)

Questa tipologia di procedura, detta Fish, è utile per individuare aberrazioni cromosomiche,

traslocazioni, duplicazioni.. in quanto permette di visualizzare la posizione di una sequenza

specifica sulla molecola di DNA ed è quindi utile per vedere su quale cromosoma si trova una

sequenza (oggi sfruttata per trovare le patologie).

I cromosomi vengono deposti su un vetrino da microscopio, denaturati e ibridati con sonde

fluorescenti.

L’immagine qui a fianco rappresenta una fish fatta su un nucleo e rappresenta

una patologia dove c’è un gene duplicato. La teoria è quindi quella di

duplicazione di un gene.

Viene presa una sonda ed è marcata in rosso, mentre un’altra sonda (per il

cromosoma Y) è marcata in verde.

Se tutto fosse normale dovremmo avere un segnale rosso e uno verde, invece

questo paziente ha tre volte lo stesso gene la diagnosi è confermata.

Il controllo viene fatto tramite una cellula di un paziente sano maschile e

femminile. LA PCR

E’ una tecnica veloce, che permette di amplificare una quantità di

DNA.

La generazione di un grande numero di identiche molecole di DNA

mediante costruzione e clonazione di molecole di DNA

ricombinante fu resa possibile negli anni ’70.

Le tecniche di clonazione, tuttavia richiedono tempo, in quanto

coinvolgono l’inserzione di DNA in vettori di clonazione e,

33

tipicamente, l’analisi di banche per trovare specifiche sequenze di DNA.

Verso la metà degli anni ’80 fu sviluppata la tecnica di reazione a catena della polimerasi, conosciuta come

PCR, che ha rivoluzionato il modo in cui i geni possono essere analizzati.

PROCEDIMENTO

I. Denaturare il DNA a singole eliche incubandolo a 94° per circa 15 secondi.

II. Raffreddare fino a 50-55° per circa 30 secondi: questo farà associare la specifica coppia di primer, A e B,

che fiancheggiano il DNA in questione.

III. La temperatura è rialzata a circa 72° e i primers sono espansi mediante DNA polimerasi. Per questo

procedimento è utilizzata una speciale DNA polimerasi, detta Taq polimerasi (derivante dal batterio

thermophilius aquaticus) che ha la caratteristica di funzionare alla temperatura di 72°.

E’ necessaria una temperatura alta per evitare la chiusura del DNA.

Questo ciclo è identificabile come primo ciclo; nel secondo ciclo la sequenza sarà limitata dagli

oligonucleotidi, in quanto fungeranno da templato, mentre nel primo ciclo il templato era un intero

filamento di DNA.

Lo svantaggio della PCR è che la taq polimerasi non ha attività di correzione di bozze per cui, a bassa

frequenza, possono venire introdotti errori nelle copie di DNA.

Naturalmente, se un errore viene introdotto nel ciclo precoce di PCR, allora tutte le copie successive di

quella molecola avranno l’errore.

Viene effettuata tramite una macchina detta termociclatore, la quale ha la capacità di alzare a abbassare la

temperatura molto velocemente.

Il concetto alla base di questo processo è rappresentata dal fatto per cui se prendo una molecola di DNA, la

denaturo e ci attacco un primer da una parte e un primer dall’altra, la polimerasi si estenderà creando due

copie, poi quattro..otto..sedici..

In provetta: filamento stampo, primers, magnesio, sale, tampone, dNTP.

STEP 1: c’è la denaturazione dello stampo che diventa

a singolo filamento

STEP 2 attacco di primer, che sono sequenze a singolo

filamento comprate

STEP 3 la polimerasi stende e fa due copie

MELTING – 94°: Si ha un primer in una provetta in largo

eccesso;

ANNEALING – 50°: se si tiene una temperatura troppo alta

non si appaierà nulla, ma se si sta a una temperatura

troppo bassa avremo eccessivi appaiamenti e anche

sbagliati;

EXTENSION – 72°: è il momento in cui DNA polimerasi si

attacca, 72° è la temperatura ideale a questa temperatura

perché la DNA Pol di queste provette deriva da organismi

34 termofili che sopravvivono ad alte temperature e

la sua temperatura ottimale di estensione è 72°

(se tenessi 37° come l’uomo non succede nulla).

L’estensione dura per X tempo, questo tipo di Pol

fa 1000 bp al minuto.

Al massimo si avranno 25-30 cicli, perché poi

comincia il malfunzionamento, dal momento che

la polimerasi comincia a mettere errori e in

quanto amplificando DNA ci sarebbe una

conseguente amplificazione errori.

La PCR è un sistema ottimale per amplificare il DNA ma non lo è per quantificare il DNA in partenza.

Se dovessi, per esempio, prendere in esame il sangue di un paziente e volessi sapere se è presente o meno

un virus nella provetta farò una PCR. Se da questo procedimento otterrò del DNA amplificato significa che è

presente il virus, altrimenti non lo otterrò.

Tuttavia non è possibile sapere quanto virus era presente e questo perché a un certo punto l’amplificazione

è tale da non permetterci di risalire a quanto DNA si aveva inizialmente.

RESA EFFETTIVA effetto plateau, è quello che si ottiene.

E’ tale perché il valore teorico non è mai raggiunto, dal momento che c’è una competizione tra i filamenti

figli complementari per l’annealing con i primers, c'è perdità dell’attività enzimatica della polimerasi dovuta

alla denaturazione termica; anche non considerando la denaturazione, la DNA polimerasi diventa limitante

negli ultimi cicli (troppo target da amplificare).

n

RESA TEORICA: 2 , dove n è il numero di cicli, tuttavia il sistema smette di rispondere in maniera lineare,

per questo è stata messa a punto la Real Time PCR

La macchina per la PCR è molto empirica, in quanto è molto sottile il gioco che viene fatto con

l’appaiamento dei primer, che devono andare ad appaiarsi su quel gene e non sui restanti miliardi che sono

presenti su quel genoma.

Tempratura, Sali e Magnesio determinano l’annealing

35

BIOLOGIA MOLECOLARE 8

Applicazioni della PCR

Introduzione di siti peculiari

Clonaggio di geni o frammenti genici: i prodotti clonati vanno sequenziati, perché nel clonaggio su 300

nucleotidi circa c’è un errore

(stessa specie o gene omologo da specie diversa)

Diagnosi genetica - Rivelazione di mutazioni: quando si diagnostica lo stesso gene viene amplificato per

vedere le eventuali mutazioni, si fa prelievo del campione e si amplifica

(base per il sequenziamento del DNA finalizzato

all'identificazione di mutazioni)

Mutagenesi di proteine: per delezioni interne, esterne..

(mutagenesi sito-specifica, costruzione di chimere)

Quantificazione delle differenze nell'espressione genica: se è un gene e trascritto e se è più o meno

trascritto in una certa situazione

(reverse transcription (RT)-PCR)

Identificazione di cambiamenti nell'espressione di geni sconosciuti

(differential display (DD)-PCR)

Analisi forense di situazioni criminose

Controllo di qualità industriale

Pcr Elettroforesi su agarosio dopo 3-4 ore UV Rilevazione

Sintesi del cDNA e RT-PCR Definito cDNA come copia a DNA di un trascritto maturo,

vediamo ora la sua sintesi e la RT-PCR.

Per giungere ad avere un cDNA è necessario effettuare

innanzitutto la copia del gene sotto forma di mRNA immaturo,

che, tramite splicing, verrà poi trasformato in mRNA maturo.

A questo punto è possibile ottenere una copia di questo RNA

messaggero in forma di DNA utilizzando una DNA Polimerasi

speciale: la trascrittasi inversa, che è un enzima RNA dipendente

SINTESI DEL cDNA

L’RNA viene estratto nella sua totalità da un tessuto e non

è necessario purificarlo, dal momento che gli mRNA si

distinguono dagli altri per la presenza coda poly-A.

Dopo aver scaldato, è lecito quindi aggiungere un largo

eccesso di oligonucleotidi primer le cui sequenze sono

rappresentate da un’elevata quantità di T, a cui si

appaieranno, logicamente, i poly-A (successivamente verrà

fatta l’ibridazione).

Dopo aver ottenuto l’appaiamento, si otterrà un 3’ OH,

che fungerà da innesco per la polimerasi.

Si aggiunge trascrittasi inversa e dNTP (uniti ai soliti sali e

al magnesio). A questo punto la trascrittasi inversa copierà

tutto lo stampo creando un filamento di DNA.

Al termine della reazione si otterrà un eteroduplex, dove un filamento è di RNA e uno di DNA di nuova

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sintesi che è cDNA.

RT-PCR:

Viene prima messo l’eteroduplex in una provetta e poi inserito in una PCR. E’ osservabile che al primo

ciclo l’eteroduplex si aprirà.

L’RNA normalmente si degrada nella provetta e, se non lo dovesse fare, si utilizza la Tac Polimerasi, che

si lega solamente al DNA, escludendo l’RNA dai passaggi successivi.

Per sapere se un gene è espresso è messo un primer specifico che segue il gene e un secondo primer,

che può essere sempre per quel gene oppure per la poli-A che si appaierà con l’oligonucleotide poli-T.

Al primo giro si appaierà un primer.

Al secondo ciclo, avendo due molecole, si appaia anche l’altro e si entra in una normale PCR.

ESEMPIO DI RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR e non Real Time!)

In questa figura sono rappresentati diversi

mRNA prelevati da diversi tessuti, dove sono

stati aggiungi primer diversi in base a cosa di

vuole studiare.

Controllo: per il controllo negativo viene

sfruttata l’RNA trascrittasi (indicata con + o – in

base alla presenza), che non viene messa e

dall’immagine è visibile che, in caso di presenza

di RT, ci sarà anche un segnale, senza RT,

invece, no. Perché viene utilizzato l’RNA trascrittasi? Perché così facendo viene verificato che tutto il

segnale derivi dall’RNA che è stato copiato in DNA e che non ci siano contaminazioni.

GADPH: è un gene che appare in tutti i campioni dove ho messo la trascrittasi inversa, è un gene

housekeeping, che verifica che il DNA sia integro e che la trascrittasi funzioni.

La PCR ha migliorato parecchio il mondo diagnostico, in quanto in 15 minuti si possono trarre dei risultati, il

che risulta utile anche negli interventi chirurgici.

E’ stata inoltre utile in ambito storico, per esempio per la verifica della paternità di Cristoforo Colombo; è

stato infatti riesumato il corpo del nonno di Cristoforo Colombo, estratto dei campioni di DNA dall’osso,

amplificato con la PCR e analizzato.

La PCR è quindi una rivoluzione pazzesca non solo per la medicina, ma anche per la storia e altre discipline,

come il campo forense, dove è utilizzata spesso con l’innesco di due primer posti esternamente rispetto a

dove sono site le sequenze ripetute, che variano a seconda

degli individui, e sarà possibile ricavarne la componente

paterna e quella materna.

REAL-TIME PCR

Poiché con la RT-PCR non possiamo quantificare il cDNA iniziale, si è sentita l’esigenza di inventare una

tecnica che permettesse di leggere la PCR durante la fase lineare di amplificazione, ovvero quel momento in

cui si ha un’esatta corrispondenza tra la molecola sintetizzata e la molecola di stampo iniziale.

Durante la fase esponenziale c’è una stretta relazione tra l’ammontare di DNA e il numero di cicli.

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Durante una PCR, i reagenti sono limitanti dopo pochi cicli e di conseguenza il numero di copie diventa

costante.

Solo una parte molto precoce della curva rappresenta la correlazione lineare.

La Real Time implica che la collezione dei dati e l’analisi avvenga contemporaneamente al procedere della

reazione, ciò è utile per verificare in tempo reale l’andamento della reazione e verificare che si sia ancora

nella lineare.

La macchina ha un termociclatore, sopra al quale è montato un sistema di lenti, utile dal momento che la

macchina va a misurare la fluorescenza, indice di quanta sintesi di DNA c’è stata.

E’ dotato di un sistema ottico, un laser che emette nella fluorescenza e un rilevatore di fluorescenza.

COMPONENTI DELLA REAZIONE:

1) DNA target

2) DNA polimerasi

3) Due primers

4) dNTPs

5) Probe fluorescente/syber green (in questo caso)

Il sistema più comune di tutti è quello che coinvolge il SYBR Green,

che è un intercalante denaturante fluorescente, che si intercala

solamente durante la sintesi del DNA.

Nella provetta metto sali, tamponi, magnesio, filamento stampo,

primers, enzimi, dNTP e sybr green.

La fluorescenza è inizialmente zero perché non ho replicazione senza

denaturazione e di conseguenza l’intercalante non si è ancora

inserito.

Nel primo ciclo si denatura il filamento e la Pol estende e, mentre lo

fa, il sybr green può intercalarsi e di volta in volta misurerò quanta fluorescenza viene emessa.

Nella rilevazione effettuata nell’immagine qui a fianco è

possibile affermare che dopo 16 cicli cominciano a

comparire delle emissioni, che vanno progressivamente

aumentando.

Il campione è più abbondante è l’azzurro, perché è il

primo segnale rilevato.

Il segnale che compare prima è il cDNA più abbondante,

dopo il 30° ciclo generalmente non si guarda più nulla.

Ci sono poi opportune formule matematiche per poi

comparare le quantità presenti nel campione e dire

quanto sono espressi.

NB: la macchina non dà valori assoluti, ma confronta una situazione con l’altra.

Controllo: gene housekeeping

Vantaggi Real Time PCR

Estremamente veloce, si vede in un tempo reale di 15 minuti, senza bisogno di gel né altro.

Essendoci poca manipolazione, è minore la probabilità di eventuali contaminazioni, se è il campione con cui

si sta lavorando è infettivo.

E’ molto più sensibile rispetto a un gel, quindi può essere utilizzata una minor quantità di materiale.

Svantaggi PCR

Il costo è molto elevato, sia per quanto riguarda il prezzo della macchina sia per il procedimento (SYBR).

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Sia nella Northern, sia nella Real Time PCR, sia nell’ibridazione in situ si sta prendendo in analisi un gene alla

volta, ma è un errore concettuale considerare quello che succede nella cellula gene per gene, in quanto

dobbiamo considerare l’insieme; se per esempio nel cervello si avrà una patologia quasi mai è per via di un

gene, ma essa è il risultato della somma di effetti di più geni.

Proprio per questo è sempre più diffuso parlare di ‘’omica’’, che è ‘l’insieme di tutto’:

Metabolomica: tutti i metaboliti;

Epigenomica: tutte le modificazioni dell’epigenetica;

Trascrittomica: tutti i trascritti;

Proteomica: tutte le proteine;

Interattomica: tutte le interazioni..

La trascrittomica

Per analizzare tutti i trascritti, e quindi capire cosa succede complessivamente, bisogna analizzarli tutti

contemporaneamente; tuttavia i metodi finora analizzati non sono idonei, esistono però degli aprocci utili

per l’analisi di un trascrittoma.

Analisi di tutti i trascritti: trascrittomica

Il micro array

La prima tecnica sperimentata fu quella del micro array.

Viene preso un vetrino di microscopio, che è suddiviso in

tanti settori; su queste griglie, in cui in ogni posizione è

stata posta una sonda di DNA, è rappresentato un

particolare gene.

In un vetrino sono spottati meticolosamente, posizione per

posizione (note), tutti i cDNA del potenziale genoma dell’organismo che si sta

prendendo in considerazione (virtualmente tutti, in realtà non tutti perché non

ci stanno).

ESEMPIO: Voglio confrontare lo stato A (di cellula normale) con lo stato B (di cellula tumorale) per vedere

cosa cambia nell’espressione genica. Cellula in stato A: sana

Cellula in stato B: tumorale

Le due tipologie di cellule vengono coltivate

contemporaneamente e in stesse quantità;

Viene estratto l’RNA totale, da cui è estratto l’mRNA

codificante con poly-T.

E’ fornita la trascrittasi inversa, che copia il

trascrittoma della cellula mantenendo le proporzioni

relative qualora ci fosse qualche deficienza

nella trascrizione.

Il tutto viene effettuato con

polinucleotidi che emettono fluorescenza.

Quindi alla fine avrò che nella provetta A

dove si è copiato il trascrittoma in cDNA

che, se eccitato, emette nel rosso, mentre

nella provetta B nel verde.

E’ presa poi un’uguale quantità di cDNA sia sano sia

tumorale e vengono mescolati insieme, utilizzando poi

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questo come sonda che se trova il cDNA complementare ci si appaia.

A+A= rosso Ciò sta dicenco che questo gene è trascritto solo nella cellula sana (marcata nel rosso);

A+B= giallo Ciò sta dicendo che nella cellula sana e nella cellula tumorale quel gene è ugualmente

rappresentato;

B+B= verde Ciò sta dicendo che questo gene è trascritto solo nella cellula tumorale (marcata nel verde).

Oggi tutti questi procedimenti sono automatizzati, in quanto fa tutto una macchina, la quale è provvista di

una specie di pennino che entra esattamente in ogni buco del microtyper, dove aderisce perfettamente il

DNA, viene lavato va pian piano a riempire tutti gli spots.

Tuttavia il microarray sta cadendo in disuso, perché si inizia a scoprire che, tante volte, è più utile fare un

sequenziamento dell’RNA.

IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA SECONDO IL METODO DI SANGER

Sequenziamento: leggere uno per uno i nucleotidi su un gene/genoma/promotore/…

Sanger ha pensato di poter capire come fosse la sequenza di DNA bloccando la polimerizzazione in punti

definiti. Nel sequenziamo secondo Sanger si parte col

presupposto che la replicazione del DNA avviene

per il dNTP, che è il mattone di base.

Il dNTP ha infatti il 3’OH a cui si aggancia la

polimerasi permettendo il legame

fosfodiesterico.

Nel momento in cui viene fornito un

, cioè lo zucchero

dideossiribunucleotidetrifosfato

viene privato del 3’OH, la polimerasi non ha più

OH su cui attaccarsi e non può fare un legame fosfodiesterico.

Nella provetta Sanger pose il filamento stampo, primer, enzimi ecc.. tre dNTP normali e una miscela di

ATP in cui c’è un po’ di dATP e un po’ di dideossiATP; ne conseguirà che a volte è incorporato quello senza

OH e in quel caso si bloccherà il processo.

Alla fine di un tempo adeguato si saranno prodotte tante molecole di lunghezza differente dal momento

che statisticamente ogni volta ci si sarà fermati a una A diversa.

Operativamente

Si parte dal DNA che si vuole sequenziare, che sia

per esempio esso un gene clonato all’interno di un

plasmide, che è in una provetta.

Viene denaturato in modo tale che sia a singolo

filamento e gli viene allegato un primer, che sarà

esterno alla zona che si vuole sequenziare.

A questo punto la reazione è divisa in quattro, in

ognuna di esse sono presenti quattro nucleotidi

normali e un didesossi di una base. Posso quindi

affermare di aver allestito quattro reazioni

differenti, nelle quali i didesossi hanno

concentrazioni statistiche in modo tale che si

incorporeranno ogni volta in un punto diverso.

La provetta viene posta a 37° per 5 minuti, la

polimerasi si attacca al primer e si estende.

Bisogna sempre tenere in conto che il tutto deve

essere rilevato, quindi è necessario che il primer o il

didesossi siano radioattivi.

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Per l’analisi del prodotto viene effettuata un’elettroforesi, nella quale non può essere usato l’argarosio

perché non sa discriminare molecole che differiscono per un solo nucleotide, quindi usiamo la

poliacrilammide denaturante, in modo tale che uno correrà come frammento e uno come plasmide e

successivamente verrà effettuata un’autoradiografia, con la quale eventuali bolle rallenteranno.

Se io volessi leggere 150 nucleotidi e sono in provetta della A, quante molecole di desossi devo mettere

rispetto all’adenina? A= 1 su 4 nucleotidi, rapporto 1:150

Dal momento che è preferita la fluorescenza ed è meglio leggere 4 nucleotidi in una stessa provetta si

utilizza una tecnica automatizzata. Il genoma è stato sequenziato tramite tecnica di Sanger automatizzata,

ovvero quella che tutti noi stiamo prevalentemente sfruttando ogni qual volta che si manda il DNA a

sequenziare.

L’idea alla base è quella di

mettere didesossi marcato con

sostanza fluorescente:

Didesossi A in verde

Didesso G in giallo

Didesossi C in blu

Didesossi T in rosso

L’enzima si attacca al primer,

inizia a sintetizzare e incorpora

didesossi, emettendo nei vari

colori.

La differenza col metodo Sanger

sta nel fatto che i diversi

frammenti sono di lunghezza

diversa, non sono radioattivi,

ma sono fluorescenti.

Vengono fatti dei capillari di

poliacrilammide denaturante

per l’analisi ed è poi eseguita

un’elettroforesi.

In un punto preciso dove le bande non sono né troppo lontane né troppo vicine è puntato un laser.

Un rilevatore rileva la lunghezza d’onda delle quattro fluorescenze man mano che passano.

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LA WESTERN BLOT

Tecnica di analisi biochimica che permette di identificare una determinata proteina all’interno di una

miscela di proteine mediante riconoscimento con anticorpo, è detta anche immunofissazione o

immunoblot.

Le proteine vengono prima separate per peso molecolare/gel di poliacrilammide, poi trasferite su un

supporto di nitrocellulosa e poi riconosciute con un anticorpo.

NB: oggi esistono tecniche che permettono il riconoscimento diretto dalla matrice del gel.

Il metodo: - Estrazione di proteine (sane e malate) da tessuti o da cellule.

Se da tessuti devono essere frantumati con frullatori o omogenizzati per

sonicazione.

Se da cellule viene fatta lisi cellulare con detergenti, Sali.

Tutto a basse temperature per andare in degradazione.

- Elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) che permette di

mantenere i polipeptidi in uno stato denaturato (è un gel denaturante),

una volta trattate con agenti riducenti per rimuovere strutture

secondarie e terziarie e separate perpeso molecolare.

Inoltre tutte vengono dotate di carica (-)

NB: Più il gel è concentrato migliore è la risoluzione per proteine e basso

peso molecolare.

Le proteine sono caricate in pozzetti di cui uno è uscito per un marcatore

(miscela di proteine a peso molecolare definito)

- Trasferimento delle bande così ottenute dalla corsa elettroforetica da

gel a filtro di nitrocellulosa elettrico (elecroblotting): le proteine

vengono trasferite non per capillarità, la maglia di poliacrilammide è

minore di quella di agarosio, ma per corrente elettrica, migrano verso il

polo positivo, poiché il SDS le ha fornite di carica negativa e così, attratte

dalla carica positiva dell’anodo, ifninei alla membrana.

Sul filtro non vedo nulla, se non lo standard di riferimento che evidenzia il procedimento, fin qui corretto.

- Prima di passare all’uso di questo anticorpo ad alta affinità per la proteina di interesse, essendo il filtro

affine all’anticorpo lui stesso deve essere ricoperto (di solito si usa latte scremato in polvere) per bloccare

tutti i siti di legame aspecifici, cioè quei siti che non hanno interagito con le proteine in analisi in modo che

l’anticorpo che si va a utilizzare non possa interagire con il filtro direttamente perché già occupato. Si tratta

di saturazione del filtro. 42

- E’ aggiunto l’anticorpo primario, ovvero un anticorpo specifico nella proteina di niteresse, generato

quando la cellula ospite (o colture di cellule immunitarie) sono esposte alla materi di interesse.

Esso costituito da: due catene leggere e due catene pesanti, regioni uguali negli individui della stessa

specie, ma differenti da specie a specie. E’ la ragione che lo rende specifico.

Solitamente una soluzione diluita di anticorpo primario (soluzione tampone + bassa % di detergenti + latte

in polvere) è incubata con la membrana a differenti tempi e temperature (T più alta, legami più forti).

NB: incubare=fornire quel tempo necessario perché avvenga quel dato passaggio.

Lavo con tampone l’intero filtro per rimuovere le aspecificità (anticorpo primario non legato).

- E’ aggiunto l’anticorpo secondario, un anticorpo specifico di una data specie di anticorpo primario.

(ex: anticorpo secondario prelevato da topo si lega a qualsiasi anticorpo primario di topo)

Esso riconosce il proprio anticorpo primario e vi si lega, anche geni durante l’incubazione.

Alla fine, anche in questo caso, lavo con tampone.

L’anticorpo secondario è legato a un enzima (fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano), che durante una

redox biobuobo luce , proporzionale all’ammontare di proteina.

- Aggiunta di una lastra fotografica sul filtro che si impressiona (diventa nero) in corrispondenza a dove c’è

l’anticorpo la rilevazione fluorescente avviene quando il primo è eccitato dalla luce e ne emette altra

rilevata dalla fosfatasi.

Il controllo è effettuato con uno standard interno, una proteina housekeeping, utilizzando un anticorpo che

la rilevi così da verificare che ci siano uguali livelli di tale proteina negli studi analizzati.

Nomenclatura:

anticorpo abbreviato in Ab o Ig (immunoglobina).

Sono molecole che si trovano nel sangue e sono usate dal sistema immunitario per identificare e

neutralizzare sostanze estranee, come batteri e virus.

antigene Qualunque sostanza che introdotta in un organismo stimola la produzione di un anticorpo.

saggio enzimatico tecnica di laboratorio che si avvale del legame tra antigene e il suo anticorpo omologo

per identificare e/o quantificare uno specifico antigene o anticorpo in un campione.

GLI ANTICORPI

Sono molecole presenti nel sangue e che neutralizzano sostanze estranee.

In biologia cellulare e molecolare si fa uso di anticorpi policlonali, ovvero

miscele di anticorpi diversi che riconoscono molteplici epitopi nella stessa

molecola, maggiormente nelle regioni dello stesso antigene.

epitopi regioni di proteine o molecole capaci di sviluppare risposta

anticorporale; per cui se purifico la proteina di interesse (clonata) e la

inietto nell’organismo (ex: coniglio) in grado di produrre un anticorpo contro

di esse, poiché ne riconosce più siti antigenici, non serve selezionare gli

anticorpi poiché quelli che riconoscono tale antigene hanno tutti lo stesso

anticorpo secondario, perciò più anticorpi legano lo stesso antigene in siti

diversi. 43

Gli anticorpi monoconali sono invece miscele di anticorpi tutti dello stesso tipo che

riconoscono un unico epitopo della molecola di interesse (hanno tutti la stessa

porzione della componente variabile).

Sono più specifici per il riconoscimento; sono prodotti da cellule immortali perciò

sono anticorpi sempre disponibili. Solitamente anticorpi monoclonali sono prodotti

nei topi, che sono organismi piccoli e semplici,

secondo un dato procedimento:

Immunizzazione di un topo con antigene più

richiami per scatenare in esso la risposta

immunitaria specifica (ex: piccolo taglio sulla

coda)

Asportazione della milza (splenectomania) dal

topo poiché è l’organo che produce il maggior

numero di anticorpi;

Per ottenere cloni di linfociti B devo coltivare

gli splenociti per capire quali producono anticorpi.

A questo scopo devo immortalizzare queste

cellule con cellule immortali (derivanti da mieloma HGPRTI) per fusione: ho la sospensione di splenociti in

terreno senza siero, ho la sospensione di cellule HGPRT -1 immortali in terreno senza siero (hanno una

mutazione genica pe ril siero perciò se lo pongo in terreno con esso, muoiono), per cui piastrandolo si

avranno tre tipi di cellule:

I. Solo linfociti (hanno gene contro il siero, vivi)

II. Solo mielomi (hanno mutazione per il siero, morti)

III.Cellule derivanti da fusione, sono un ibridoma vitale, poiché hanno la immortalità dei mielomi e il gene

contro il siero, presente nel terreno dei linfociti

Per cui nel terreno vengono posti diversi cloni di cellule diverse immortali per selezionare solo le cellule

fuse, immortali e che producono anticorpo.

Estrazione di cellule clonate e posizionamento in pozzetti su piastre (tutte le cellule indistintamente): se

danno reazione positiva all’antigene producono anticorpi che vengono secreti nel mezzo di coltura e

riconosciuti da tecnica ELISA.

LA TECNICA ELISA (Saggio Immuno Assorbente legato a un enzima)

E’ il metodo di analisi immunologica usato per rilevare la presenza/quantità di una sostanza, usando uno o

più anticorpi a cui è legato un enzima (o un radionuclide).

Esistono diversi metodi: 1. LA TECNICA ELISA DIRETTA

E’ utilizzata per rivelare la presenza e la quantità

di un antigene:

- Rivestire il fondo del pozzetto con l’anticorpo

specifico contro l’antigene da identificare

(pozzetto del microtiter o altro)

- Aggiungere al pozzetto, dopo averlo lavato, il

siero o l’urina del paziente e incubare per un dato

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tempo così da permettere all’antigene, se presente nel siero di legarsi all’anticorpo.

- Eliminazione del siero e lavaggio;

- Al complesso anticorpo – antigene che ho ottenuto, aggiungo un secondo anticorpo, sempre contro

l’antigene, ma diverso dal primo, dotato di maggior selettività, che si lega a formare una sorta di ‘sandwich’

anticorpo-antigene-anticorpo.

Questo secondo anticorpo ha legato a sé covalentemente un enzima, capace di compiere una reazione

colorimetrica.

- Aggiunta del substrato per l’enzima legato all’anticorpo così che avvenga la reazione enzima-substrato e ci

sia una colorazione, segno ella presenza dell’antigene. Tale colore è rilevato con lo spettrofotometro e più

intensa è la colorazione, maggiore è la quantità di antigene presente.

Controllo negativo: allestisco un pozzetto con un anticorpo primario diverso da quello per l’antigene o,

addirittura, privo di anticorpo per cui, se aggiungo l’antigene, non si deve formare nulla.

Controllo positivo: confronto i pozzetti in cui è già stato legato l’antigene in quantità note così da settarli.

2. TECNICA ELISA INDIRETTA

E’ utilizzata per rivelare la presenza e la

quantità di un anticorpo.

- Ricoprire il fondo del pozzetto con

l’antigene specifico per l’anticorpo da

misurare;

- Aggiungere al pozzetto, dopo aver

lavato l’eccesso di antigene, il siero del

paziente e incubare per dare tempo

all’anticorpo, se presente, di legarsi

all’antigene;

- Lavare per eliminare l’eccesso

-Aggiungere un secondo anticorpo (anti-anticorpo), marcato con enzimi, che lega il complesso;

- Aggiungere substrato per l’enzima, così che la reazione substrato-enzima dia un prodotto che causa

cambiamento di colore rilevato dagli spettrofotometri.

L’IMMUNOISTOCHIMICA

Tecnica che permette di evidenziare la formazione del complesso antigene-anticorpo specifico

direttamente sul tessuto.

Se si usano fettine di tessuto: isto-

Se si usano cellule: immuno-

Il metodo diretto si serve di un unico anticorpo diretto contro la molecola da ricercare e questo stesso

anticorpo è marcato da una sostanza colorata che ne permette la visualizzazione.

E’ il più usato in laboratorio perché è il più rapido.

Il metodo indiretto si serve invece si due anticorpi: un anticorpo primario, contro la molecola da ricercare,

prodotto da un animale immunizzato contro quella molecola e un

anticorpo secondario, marcato da una sostanza colorata, in grado

di riconoscere e legarsi al primo.

L’anticorpo secondario deve essere prodotto da un organismo

diverso da quello da cui è stato prodotto il primo così che

l’anticorpo primario venga riconosciuto dal secondario come

antigene. 45

NB: E’ possibile utilizzare lo stesso campione (molecola da ricercare) con anticorpi differenti.

Marcature multiple: se gli anticorpi sono prodotti da organismi differenti e possiedono due fluorocromi

differenti, cioè non legano allo stesso modo.

Esistono diverse tecniche immunoistochimiche:

tecniche immunofluorescenti: usano fluorocromi, non enzimi, come marcatore della reazione antigene-

anticorpo;

tecniche immunoenzimatiche: usano enzimi legati direttamente o indirettamente all’anticorpo che lega

l’antigene da visualizzare.

L’IMMUNOFLUORESCENZA

Tecnica utilizzata per vedere quali regioni esprimono la proteina (se si tratta di un organismo intero) o quali

distretti subcellulari (se si tratta di una cellula) e se la sua localizzazione cambia in funzione di opportuni

stimoli.

Usa un metodo indiretto (ma esiste anche il diretto): un anticorpo primario lega l’antigene e ad esso si lega

un anticorpo secondario fluorescente che assorbe onde di una data frequenza (alta) ed emette frequenze

minori.

Il fluorocromo più usato è la fluorescina, che assorbe raggi uv e con l’ausilio di microscopio illuminato,

emette luce nel verde.

NB: E’ possibile compiere marcature multiple dello stesso preparato.

esempio: molecola bersaglio insulina – glucagone

Anticorpo ottenuto in capra anti-coniglio ha fluorocromo verde e mira l’insulina;

Anticorpo ottenuto in anti-topo ha fluorocromo rosso e mira il glucagone.

Perciò la stessa molecola bersaglio lega più anticorpi prodotti in organismi differenti e perciò marcati

differenti.

L’IMMUNOPRECIPITAZIONE

E’ una tecnica che permette di isolare una proteina tramite il suo anticorpo.

- Si ricerca una proteina particolare presente in piccole quantità nel preparato in esame per cui viene

purificata/concentrata;

- Isolamento dei complessi proteici in miscele grazie al loro anticorpo; si fanno precipitare dalle soluzione

uno specifico antigene perché viene utilizzato un anticorpo che lo riconosce così da ottenere nel pellet un

antigene superconcentrato e isolato. 46

Il metodo:

- Alla provetta contenente l’estratto grezzo di proteine totali della cellula, si aggiunge l’anticorpo contro la

proteina di interesse in eccesso;

- Incubare per tempo sufficiente affinché l’anticorpo interagisca e si leghi all’antigene della proteina di

interesse, circondato dalle altre proteine libere più l’anticorpo in eccesso;

- Il complesso antigene-anticorpo

così formato è leggero perciò è

necessario farlo precipitare per

estrarlo: lo si appesantisce

aggiungendo la proteina A o G che

legano in catena pesante

dell’anticorpo (sono proteine

estratte dalla parete di un batterio e

sono affini a qualsiasi catena pesante

di qualsiasi anticorpi N sono

appesantiti)

ex: proteina A + anticorpo primario + antigene di interesse complesso ternario pesante;

NB: Proteina A prima era legata covalentemente a sfere di agarosio/sefarosio

- Centrifugazione a bassa velocità permette di ottenere nel pellet il complesso ternario, mentre nel

surnatante ci saranno proteine libere, con anticorpo in eccesso;

- Lavare

- Caricare su gel il complesso terziario ottenuto così da visualizzarlo:

mRNA polimerasi di E.Coli è composta da 7 subunità ed è stato scoperto per cromatografia.

COIMMUNNOPRECIPITAZIONE Permette di visualizzare la subunità di un complesso

(come in questo caso) e le interazioni proteina-proteina, i

partner funzionali e regolatori.

Subunità di un complesso: l’uso di anticorpi contro una

subunità del complesso fa precipitare anche tutte le altre.

Le subunità sono poi visibili nella SDS PAGE.

Interazione proteina-proteina (deve perdurare il

tempo necessario perché sia visualizzabile) dall’estratto di partenza, aggiungo l’anticorpo contro la proteina

di interesse (una delle due) e immunoprecipito così da avere nel pellet la proteina legata all’anticorpo più

l’altra proteina, perché interagente con la prima.

Si tratta di un candidate-approch; sono già a conoscenza di quale proteina interagisce con la mia di

interesse e ne voglio la conferma.

Se invece non ho idea del parner ancorato a una proteina, la immunoprecipita e poi compio

sequenziamento (o spettrometria di massa) e osservo che è legato.

Ciò è fondamentale per l’interattomica. 47

CHIP: Chromatin Immunoprecipitation

Tecnica per identificare dove la data proteina si lega su una sequenza di DNA in

vivo (il fattore trascrizionale, quali geni regola).

Tutto basato sull’interazione DNA-proteine in vivo.

Metodo:

- Cellule in coltura trattate con formaldeide (agente cross linkante) che forma

legami covalenti tra proteina e DNA solo se la proteina si trova già vicino al DNA,

cioè se stanno già interagendo tra loro poiché la formaldeide ha un raggio

d’azione molto corto. In questo modo si bloccano le interazioni proteina-DNA e

ciò che stava interagendo si immobilizza e il resto non può più legarsi.

- Le cellule così uccise vengono raccolte, si compie lisi della membrana e poi del DNA (cromatina) in

frammenti per sonicazione per il tempo adeguato.

- Incubazione dei frammenti con un anticorpo specifico contro la proteina di interesse: l’anticorpo lega la

proteina sia che essa non leghi DNA sia che lo leghi (complesso anticorpo+antigene+DNA)

- Utilizzo della proteina A sefarosio per appesantire i complessi;

- Centrifugazione allo scopo di ottenere nel pellet anticorpo+preoteine di interessa+DNA

- Purifico il DNA: si scinde prima il legame covalente tra proteina e DNA (legame formaldeide) alzando la

temperatura, essendo termosensibile al calore si spezza così da avere in provetta le proteine denaturate e il

DNA.

Purifico il DNA con le proteinasi K e cloroformio + etanolo

- Individuazione del frammento di DNA di interesse con diverse tecniche (pcr, realtime, westernblot) a

seconda di ciò che cerco.

ex: PCR se voglio amplificare il target

CONTROLLI:

controllo negativo: compio PCR da knokout background cioè da un topo che non possiede il gene di

interesse; si fa tutto l’esperimento senza usare l’anticorpo primario perciò non bisogna avere precipitazione

del frammento (oppure con un anticorpo diverso.

controllo positivo: non ci deve essere contaminazione sul DNA.

La chip-seq può essere utilizzata anche per un approccio omico

(globale) cioè se si vuole capire con quali frammenti del DNA la

proteina di interesse sta interagendo.

Si ripetono i passaggi della Chip fino a ottenere il DNA

purificato, poi utilizzato come sonda fluorescente su microarray

in cui sono stati spostato tutti i promotori.

chip-chip

Si definisce (chip on chip) cioè la chip è compiuta su

un (micro)chip.

In questo modo è possibile vedere a quali promotori si lega la

sonda, cioè quali sono i target (le sequenze di DNA) diretta

della proteina di interesse.

48

chip-seq

Oppure compio cioè sequenzio tutti i frammenti del genoma

(trascrittoma)

E’ possibile studiare una proteina anche se non si possiedono gli anticorpi per

riconoscerla e seguirla grazie a dei tag (etichette).

Tali tag sono sequenze amminoacidiche che vengono legate alla proteina di

interesse così da formare un’etichetta (epitope tag) contro cui ho un

anticorpo così da riconoscerlo e seguire il processo.

Il tag viene aggiunto alla proteina tramite un plasmide: ad un plasmide che

contiene il tag (per cui ho l’anticorpo), ori, resistenz a un antibiotico, un

promotore viene inserito il gene della proteina di interesse, a monte o a valle

del tag da clonare – tutto in frammenti – così da ottenere un plasmide

ricombinante, espresso poi negli organismi come proteina, chimera, poiché è

proteina + tag riconoscibile.

GLI IMMUNOTAGS

Sono utili per purificare e per identificare una proteina da un estratto grezzo.

Sono molto utilizzati per purificare la proteina da un estratto complesso perché a elevata specificità di

legame.

I tags più usati sono: FLAV (8AA), HA

(9AA), MYC, GFP (238AA)

LA GFP (Green Fluorescent Protein)

Scoperta da Chalfie e Tsien, a cui valse il premio Nobel per la chimica nel 2009.

E’ una proteina derivante da una medusa fluorescente (30Kb) e costituita da 238 aa, uniti insieme in una

lunga catena ripiegata su se stessa in modo da disporre i gruppi chimici che assorbono gli UV e la luce blu,

nella zona centrale. Questi rilasciano, se illuminati, luce verde indipendentemente dal contesto in cui si

trova. 49

E’ una proteina che può legare i vivo, non è letale, perciò largamente usata per studiare la localzizazione di

una proteina e i suoi movimenti nella cellula: la proteina di fusione (proteina di interesse) viene prodotta da

un vertice dotato di:

- promotore forte

- MCS (sito di clonaggio multiplo)

- GFP che può essere a valle della proteina di interesse: promotore-MCS-GFP, cioè in coda

a monte della proteina di interesse: promotore-GFP-MCS cioè in testa

- sito di poliadenilazione

- ori di replicazione

- resistenza a amp caratteri vettore shuffle

NB: E’ fondamentale che le due proteine siano in frame, cioè abbiano la stessa cornice di lettura, affinché

siano funzionanti scelgo il tipo di vettore che, se tagliato da enzimi di restrizione, inserisce la proteina di

interesse in frame con GFP. 50

GLI ORGANISMI MODELLO

Si chiamano organismi modello quelle specie che vengono studiate, da più laboratori, per comprendere i

fenomeni biologici supponendo che le informazioni ottenute possano fornire indicazioni su altri organismi

affini.

Ciò è possibile poiché i principi biologici fondamentali sono conservati in tante specie (ex: 99% dei geni di

topo sono omologhi a quelli umani) e si sceglie uno specifico organismo in relazione al problema in esame.

Concentrare l’attenzione su pochi organismi diversi, studiati in più laboratori, è importante a livello pratico

poiché per comprendere l’organismo e acquistare familiarità con il suo ciclo vitale, le modalità di crescita e

di conservazione è un processo dispendioso in tempi e denaro.

La scelta di un organismo come modello viene effettuata in base ad altre caratteristiche, utili agli studi:

deve essere economico, sia da usare/manipolare sia da mantenere;

deve essere facile da allenare o coltivare;

deve avere un ciclo vitale rapido, per poterlo osservare, e che porti a un’ampia progenie in cui potrei

trovare anche eventi genetici rari;

deve avere dimensioni fisiche contenute poiché se genera ampia progenie, in poco tempo occuperebbe

troppo spazio (difficile conservazione)

non deve presentare problemi di sicurezza;

deve essere ceduto a tecniche di manipolazione genetica, ovvero modificazioni genomiche, oltre a

tecniche per conservare in modo conveniente a lungo termine in ceppi, per studi successivi;

deve conservare i meccanismi biologici per i quali lo si sta studiando;

devono avere un genoma sequenziato.

Vengono utilizzati sia organismi pluricellulari sia organismi unicellulari (scoperta successiva), in quanto sono

adatti per studi mirati al metabolismo cellulare:

Gli organismi unicellulari costituiscono un materiale di partenza migliore perché sono cellule identiche

tra loro e sono usate per studi sui processi vitali fondamentali quali replicazione, riparazione DNA,

ricombinazione..

Si tratta di: batteriofagi, E.Coli, Neurospora Crassa (lievito), drosophila, Saccaromices Cerevisiae.

- Gli organismi pluricellulari, però , possono fornire informazioni riguardo lo sviluppo degli organismi

pluricellulari a livello corporeo e delle malattie.

Si tratta di piante, zebrafish, topo* e rane.

* Il topo è l’organismo modello più usato per studiare le malattie, è facile da allevare e manipolare il suo

DNA.

Il 99% dei suoi geni ha omologhi all’uomo, ma è costoso da mantenere e da alterare geneticamente.

NB: Gli studi sulle malattie umane a oggi vengono eseguiti secondo tre metodi:

1. Usando organismi modello che possiedono omologhi di geni umani, di cui possiamo studiare una

mutazione che altera processi molecolari/cellulari anche nell’uomo;

2. Conoscenza della sequenza del genoma umano e quella della genetica sono fondamentali per

comprendere i geni coinvolti nelle malattie umane, così da poter trovare una cura;

3. Coltivazione di cellule umane in vitro (Quelle tumorali possono essere fatte crescere per numero infinito

di generazioni – immortalizzate – così anche le sane, se infettate con un virus. Ciò è mirato a trarre

importanti informazioni. 50

GLI ORGANISMI MODELLO UNICELLULARI

1. BATTERIOFAGI

I virus possiedono una testa contente il genoma , un collare e

una coda, dotata di estroflessioni.

Il virus si attacca alla superficie della cellula ospite (batterio)

per interazione coda-proteine superficiali può indurre:

un ciclo litico comprende la lisi dei batteri.

un ciclo lisogenico, ovvero il fago, ora profago, coesiste

con il batterio che ne integra il genoma nel proprio (genoma

fago piccolo)

I virus più studiati sono:

FAGO T Batteriofago virulento che compie ciclo litico.

- Il fago inietta il proprio genoma nel batterio;

- Il genoma batterico è rotto da enzimi del fago;

- La replicazione del cromosoma fagico avviene usando materiale batterico ed enzimi del fago;

- Assemblaggio dei nuovi fagi;

- Lisi parete batterica indotta dai fagi così che il batterio muoio e i fagi siano liberati.

FAGO Batteriofago temperato che compie sia ciclo litico sia ciclo lisogenico.

- Il fago inietta il proprio genoma nel batterio;

- Il genoma fagico si inserisce in quello batetrico in forma quiescente;

- Il batterio si replica contenendo entrambi i DNA (è detto PROFAGO).

2. ESCHERICHIA COLI

E’ un organismo unicellulare (batterio) procariota che risiede normalmente

nell’intestino animale (non dannoso) Si usano solitamente ceppi che

hanno perso la capacità di vivere nell’intestino – colon -

E’ gram negativo: ha due membrane, quella esterna presenta dei flagelli.

Il citoplasma interno contiene ribosomi, DNA (nella regione del nucleosione)

è aploide, ovvero ha un solo cromosoma, non ha nucleosomi.

Si riproduce velocemente per scissione binaria: la replicazione del DNA, la

separazione dei filamenti alle estremità opposte della cellula, citochinesi e formazione delle cellule figlie. Il

9

ciclo di replicazione dura circa 20 minuti a 37°C (una cellulare in 10 ore diventa 10 cellule).

La replicazione può avvenire:

Su piastre di Agar (solide), dove si formano colonie, decine di milioni di cellule in un giorno

(Colonia=clone di cellule identiche). 9

Su terreno liquido fino ad avere una densità di 10 cellule/mL.

Se mantenuti a 37°C (T ottimale) si riproducono,

a 4°C sono tenuti vivi per alcune settimane;

a -80°C sono virtualmente tenuti vivi per sempre;

se subiscono trasformazione con plasmide (resistenza a batteriofagi, resistenza ad antibiotici) ed è posto in

glicerolo, resta vivo per decenni. 51

La curva di crescita ha una prima FASE LAG, dove i batteri si adattano alle

condizioni di crescita; una fase ESPONENZIALE di crescita, una fase

STAZIONARIA in cui i nutrienti diventano limitanti e i batteri rilasciano

metaboliti nel terreno di crescita.

I batteri sono abbastanza grandi (circa 2 m tra 0.1 - 10 m) per

rifrangere la luce e poter seguire la crescita di una colonia per aumento

della densità ottica.

E. coli viene utilizzato per

Mutagenesi: è possibile aumentare la frequenza di mutazione con sostanze chimiche o raggi UV, per

selezionare poi le cellule mutate per fenotipo o piastratura su mezzi di coltura diversi;

Plasmidi, possono contenere DNA estraneai clonazione di DNA

Complementazione: dimsotrare che una mutazione è contenuta in un gene particolare;

Espressione proteina ricombinante: tecnololgia del DNA ricombinante

Knockout Genico: plasmidi privi di ori di replicazione ma con un gene resistente all’antibiotico possono

essere selezionati e incorporati in E.Coli

E’ usato per gli studi indotti sui processi cellulari di base.

3. SACCAROMYCES CEREVISIAE - LIEVITO

E’ un organismo unicellulare (Lievito), eucariote, aploide o diploide, detto

LIEVITO GEMMANTE, lievito del pane o lievito di birra.

Essendo eucariote è dotato di: nucleo distinto con cromosomi linkati multipli

assemblati in cromatina e citoplasma con organelli (ex: mitocondri) e struttura

citoscheletrica. 6

E’ lungo 12Mbp e contiene 6000 geni (genoma: 13 10 bp).

Sequenziato nel 1990, di cui alcuni omologhi di geni umani responsabili di

malattie, però non è usato come modello di sviluppo perché unicellulare.

Si riproduce velocemente, il suo ciclo di riproduzione dura 90 minuti a

temperatura ottimale e può crescere sia su terreno liquido, dando vita a una grande quantità di cloni sia su

terreno solido (agar).

NB: replicazione in 90 minuti su terreno ricco e T ottimale;

replicazione in 140 minuti su terreno sintetico.

Poiché il lievito può esistere sia in stato aploide (1N) sia in stato

diploide (2N), entrambi stati stabili, esso si riproduce per divisione

per gemmazione:

stato diploide, ovvero come vive normalmente nel terreno ricco:

- Su una cellula diploide si forma una protuberanza che contiene una

copia del DNA della cellula stessa.

- Tale protuberanza, detta ‘gemma’, cresce fino a diventare grande

come la cellula madre.

In fase G2 resce, in fase M riceve DNA copiato e viene poi rilasciata.

NB: Sulla cellula madre, ogni cicatrice è segno di gemmazione

stato aploide, è indotto per mancanza di nutrienti (starvation)

- In condizioni non favorevoli, la cellula diploide entra in meiosi e

sporula, porta cioè alla formazione di quattro cellule aploidi

(progenie) all’interno di spore (=sacchetti) dotati di parete, racchiuse

tutte e quattro in una strtuttura ad asco.

- Al microscopio apposito le quattro spore sono visibili ed è possibile

52

prelevarne una alla volta e separarle, così che ciascuna possa crescere indipendentemente su piastra solida.

tetrad dissection

Da ciascuna, mantenuta allo stato aploide, si ottengono colonie.

Ciò permette di verificare se la mutazione avvenuta è stata favorevole o meno – dominante o recessiva – a

seconda che dalle singole spore ci sia o meno proliferazione.

- Le cellule aploidi possono poi subire coniugazione e tornare allo stato diploide solo se si fanno coniugare

insieme due spore di ceppi sessuali differenti (M+F) che si fondono tra loor e poi si riproducono per

gemmazione.

- Esistono librerie di 6000 ceppi del lievito, ciascuno con delezione di singoli geni.

- Questo lievito è poco utilizzato per glis tudi biotecnologici perché è unicellulare e dotato di parete; è

invece molto usato per gli studi sui meccanismi di base del metabolismo umano, essendo simile all’uomo

(tra geni omologhi) è migliore di E.Coli. E’ usato per comprendere funzioni di base dei prodotti genici

coinvolti in alcune malattie alcune malattie umane derivano da distruzione di processi vitali; non è però

un modello di sviluppo. -E’ usato molto anche perché si può mutagenizzare a

livello del singolo gene (esistono librerie dei 6000 ceppi,

con mutazioni a carico di un singolo gene):

I. DNA esogeno può essere introdotto per

trasformazione (con plasmidi) e può replicare in essa

autonomamente o essere integrato nel genoma del

lievito.

II. E’ possibile poi selezionare le cellule trasformate usando marcatori

presenti sul plasmide che rendono le cellule capaci di crescere in

assenza di un dato AA o precursore di nucleotide esempio: ceppi

auxotrofici (di S. cerevisiae) per uno specifico AA e li pongo in un

terreno privo di quel dato AA, così che crescano solo quelli che hanno

integrato il plasmide e hanno acquisito così la capacità di sintetizzare

su di sé quel AA.

NB: Le librerie con ceppi a singole delezioni geniche diverse servono a capire se due mutazioni su diversi

geni combinate tra loro fanno variare di molto il fenotipo: si combinano ceppi mutanti su geni diversi per

vedere se interagiscono tra loro così da codificare per proteine della stessa via metabolica.

RICORDO:

Gli zuccheri vengono metabolizzati, cioè usati dal batterio che si trova nel terreno.

Se il batterio non sa metabolizzare un dato zucchero, questo non deve essere aggiunto al terreno, sarebbe

inutile. + + -

Per esempio: Glu / Gal / Lac Glu e Gal devono esserci nel terreno (metabolizzati), Lac no.

Gli amminoacidi vengono sintetizzati dal batterio a partire dal terreno minimo. Se il batterio non li sa

sintetizzare devono essere aggiunti.

+ + +

Per esempio: Met /Arg /Tyr Met e Arg non aggiunti (li sintetizza lui), Tyr è invece da aggiungere.

Perciò S.Cerevisiae è usato per:

I. Mutagenesi: lievito replicato su piastra per studiare i fenotipi mutanti per la capacità di crescere su fonti

di carbonio differenti.

II. Complementazione: mutazioni geni essenziali in lievito aploide è poi mantenuto allo stato diploide che

53

per sporulazione (due delle quattro non vitali) e le altre isolabili per studiare la ricombinazione.

III. Introduzione di DNA

IIII. Marcatori specifici: per ceppi auxotrofi solo se hanno integrato il plasmide sopravvivono in terreno

privo di un AA

IIIII. Plasmidi

Allo scopo di:

I. Studiare i meccanismi di trasfusione di informazioni (processi base)

II. Ciclo di divisione cellulare, visibile al microscopio

III. Studiare vie di trasduzione del segnale

IIII. Studiare ricombinazione meiotica poiché produce 4 spore derivanti da una cellula e se ne può seguire il

processo.

IIII: Studiare le interazioni genetiche (interazione proteina – proteina, proteina – RNA, grazie a libreria di

marcatori fluorescenti proteici posti nel suo genoma).

3. NEUROSPORA CRASSA

E’ un fungo (unicellulare) ascomicete filamentoso eucariota.

E’ dotato di genoma lungo 43 Mbp e 11000 geni.

Si riproducono velocemente (fino a 10cm in un solo giorno) e 3-4 settimane per avere un processo

completo, a partire da spora aploide per arrivare a ifa aaploide: un singolo ascomicete con spore, in ordine

di meiosi, che possono essere sperate e studiate singolarmente perciò molto usate per gli studi di

ricombinazione meiotica, meccanismi di silenziamento (un gene non appaiato in meiosi è silenziato)

MUTANTI TEMPERATURA SENSIBILI

Mutanti capaci di crescere solo alla loro temperatura ottimale e non a una temperatura più alta

T ottimale=temperatura permissiva

T troppo alta=temperatura restrittiva/non permissiva

Poiché è mutato un gene la cui proteina codificata ha conformazione corretta alla T ottimale, di fronte a

una T troppo elevata non funziona, è denaturata.

Cold-sensitive mutanti che non crescono a T più bassa di quella ottimale

NB: I geni CDC (Cell division cycle) che controllano il ciclo cellulare sono stati scoperti così.

GLI ORGANISMI MODELLO PLURICELLULARI

1. C. ELEGANS E’ un organismo pluricellulare (verme traslucido), è un nematode, non

patogeno o parassita di certi animali che vive solamente a terra.

E’ eucariote, con un genoma completamente sequenziato costituito da 6

cromosomi e 20000 geni ed è molto utile per gli studi sulla complessità

dello sviuppo poiché possiede, pur essendo semplice, SNC (320 neuroni

noti), un apparato circolatorio, muscoli, sistemi digestivi e riproduttivi e

959 cellule somatiche.

A livello sìrudimentale perciò, essendo costituito da un numero fisso di

cellule (circa 1000) il cui destino è definito alla fecondazione ed è

conosciuto – per ciascuno si conosce cosa darà vita a cosa - .

Se un gene muta, si può quindi capire cosa induce a livello fenotipico tale mutazione.

Vive sulla terra, ma può crescere anche in laboratorio su piastre di agar con E.Coli come fonte di nutrimento

54

e può essere perfino congelato. Ha un ciclo vitale di soli 3 giorni.

Gli embrioni si sviluppano in 12 ore, i vemi schiusi diventano

adulti in 40 ore in un ciclo che prevede varie fasi:

- C. Elegans ha due sessi possibili, determinati dal numero di

cromosomi X XX=ermafrodita; X0=maschio.

- Una piccola percentuale di cellule germinali (<1%)

dell’ermafrodita compie disgiunzione dei cromosomi X durante

meiosi, portando alla formazione di gameti X-nullo (X0) maschi.

- La maggiorparte delle cellule germinali ermafroditi compiono

autofecondazione, producono sia sperma sia uova, producendo

200-300 uova fecondate che vanno incontro a sviluppo in più stadi (52h – 27°)

I. embriogenesi (12h – 25°) Si producono larve con 558 cellule;

II. Stadio L2 (7h) con varie

III. Stadio L3 (7h)

IIII. Stadio L4 (9h)

Tra questi stadi ci sono varie mute, che protano all’aumento delle dimensioni della larva-

Fino a muta finale che produce berme adulto sessualmente

maturo.

- In condizioni di stress, la larva, dopo L1 può entrare in uno

stadio Dauer, che la mantiene stabile per mesi e resistente a

uno stress, aspettando che le condizioni migliorino.

- I maschi X0 possono fecondare gli ermafroditi formando

ceppi con nuove combinazioni di mutanti (variabilità

genetica)

C.Elegans viene utilizzato per:

Si è scoperto (Nobel 2002 medicina) che circa il 12% delle sue cellle muore per apoptosi durante lo

sviluppo (è una cosa programmata geneticamente).

E’ un’apoptosi di una delle due cellule della progenie ottenute per divisione cellulare; ciò è fondamentale

perché l’altra si sviluppi correttamente. L’apoptosi a livello del SN e nello sviluppo embrionale è importante

per lo sviluppo di organismi superiori.

Poiché possiede un numero di cellule definito, è stato possibile mappare i geni che controllano l’apoptosi.

Per mutagenesi: le mutazioni indotte sono osservabili al microscopio.

Sono mappati i geni che controllano l’apoptosi in animali mutanti con eccesso o ridotto numero di cellule,

inoltre ogni verme produce centinaia di discendenti che possono presentare mutazioni;

Per autofecondazione – poco tempo, molte cellule.

C. Elegans è trasparente è possibile seguire i vari stadi del suo sviluppo.

Introduzione del DNA ricombinante, inserimento casuale di un trasposone può portare a Knockout

genico;

Interferenza da RNA, identificazione di miRNA coinvolti nell’espressione genica.

Malattie umane poiché C. Elegans ha geni omologhi a geni umani responsabili di malattia.

Invecchiamento: studi su larva Dauer geni che se attivati aumentano la durata della vita;

Neurosviluppo: C.Elegans possiede 302 neuroni e 56 cellule glia con connettività semplici e osservabili;

I. Mappatura rete neuronale per anomalie;

II. Studi sulla crescita assone e sviluppo sinapsi;

III. Studi di differenziamento neuronale. 55

NB: C. Elegans appartiene a un ramo secco dell’evoluzione, cioè la loro strada evolutiva non procede.

2. DROSOPHILA MELANOGASTER E’ un organismo pluricellulare, conosciuto come anche

moscerino della frutta, è aploide e eucariota.

E’ un oranismo di piccole dimensioni, dottato di testa, torace e

addome, racchiuse in una cuticola di chitina (dura) e ricche di

particolari anatomici, quali peli.

Il suo genoma è stato interamente sequenziato nel 1998 con

15000 geni di cui (170Mbp) il 50% hanno omologhi nell’uomo (pathway conservato) e il 60% geni malattia

umani hanno un omologo in drosophila.

- E’ stato studiato per primo da Morgan per studi sulle modalità di trasmissione dei caratteri ereditari

mutazioni riconoscibili (spontanee o indotte) poiché è possibile risalire ai geni responsabili localizzati sui

cromosomi.

Poi da Sturtevant è stato il primo organismo di cui si ha avuto una mappa genica La mappatura dei geni è

stata fatta in relazione alle loro frequenze di ricombinazione per crossing over.

Infine Bridge, localizzazione esatta dei geni su cromosomi politeici (cromosomi ghiandole salivari) con

bandeggiatura tipica.

- Il suo ciclo vitale diploide dura circa 12/30 giorni.

Il sesso è determinato dal numero di copie di X.

XX = femmina

X0= maschio

La Y serve alla produzione di sperma.

L’embriogenesi dura 24g, dopo deposizione delle uova da parte delle

femmine. La più rapida di qualsiasi altro organismo pluricellulare.

Ci sono poi tre stadi larvali per la durata di 5 giorni, con mute in cui

compaiono i disordini marginali di tessuto destinati a trasformarsi nelle

appendici della mosca (occhi, antenne, ali) e nella bocca.

NB: La madre depone nelle uova gli mRNA per far capire da che

parte si svilupperà la testa rispetto al corpo distinzione parte

anteriore e posteriore del moscerino; perciò l’uomo è un sincizio

contenente le informazioni materne da cui si formano le varie

parti con l’embriogenesi.

Le ghiandole salivari secernono l’involucro della PUPA, dove

avviene la metamorfosi per 5 giorni e alla fine emerge l’insetto

adulto.

La Drosophila è usata per:

Mutagenesi: dai primi stud di Morgan, mutagenesi indotta (da radiazioni o sostanze mutagene) è visibile

56

fenotipiamente.

Introduzione DNA ricombinante;

Mosaici genetici;

Knock Out genici / interferenza da RNA

Malattie umane, per geni omologhi di quelli umani;

Piano di sviluppo del corpo, in base alla localizzazione degli mRNA materni con corrispondenti in animali

più complessi.

E’ un organismo famoso per gli studi sullo sviluppo del piano strutturale dell’organismo geni omeotici,

cioè geni che controllano l’espressione di altri geni e, se mutati, determinano malformazioni fisiche.

ex: nella Drosophila le zampe al posto delle antenne (sono nello stesso ordine di quelli umani sia su

cromosomi sia a livello cranico/caudale)

Studi comportamentali: neuroni per l’apprendimento, ciclo sonno veglia, ricerca di cibo, assuefazione da

alcool. Vale a dire stud sul SN che è molto sviluppato.

3. XENORUS

E’ un organismo pluricellulare (rospo) di cui utilizzano per gli esperimenti

due specie:

Xenorus laevis (dal Sudafrica) - tetraploide

Xenorus tropicalis – diploide, più usato.

Non vengono utilizzati per studi di genetica (mutagenesi=, ma si studia

molto il suo processo riproduttivo.

Dopo l’accoppiamento, la femmina depone le uova, attaccandole a piante

acquatiche o rocce (habitat ideale) così che esse si possano dividere in

seguito a stimoli.

Perciò vengono realizzati studi in vitro in cui è possibile stimolare la riproduzione.

Opoure è possibile schiacciare le femmine affinché depongano le uova e prelevare poi sperma dai maschi e

spingerlo sulle uova affinché ci sia fecondazine.

Poiché l’uovo intenramente è chiuso in nucleo superiore e in sostanza di riserva sottostanti, in circa 20

minuti c’è rotazione interna e tutte le uova ruotano in modo da disporsi tutte uguali (zona scura verso

l’alto) così che la fecondazione avvenga correttamente ( fecondazione esterna rapida).

Se le uova sono fecondate, alcune vengono iniettate con microiniettatore con molecole che bloccano o

attivano l’espressione di un gene, per vedere cosa accade.

esempio: inietto H O come ipotesi che non accada nulla così dimostro che non si è danneggiato nulla.

2

Oppure sopprimo la rana e prelevo gli ovociti, cellule resistenti pronte per essere fecondate; contengono il

necessario per la precoce embriogenesi: la cellula continua a dividersi e produrre istoni, ribosomi, RNA pol..

cioè gli ovociti sono campioni che possono essere usati per svilupparsi come noi vogliamo, sono usati come

provette in ‘semi-vivo’ per gli studi fisiologici.

4. TOPO Il topo è l’organismo pluricellulare più simile all’uomo. Il suo genoma ha

quasi le stesse dimensioni di quello umano e lo stesso numero di geni, il cui

00% ha un omologo in quelli umani, inoltre si ha un’alta sintenia, ovvero

una stessa distribuzione dei geni sui cromosomi.

Il suo genoma è stato sequenziato.

Pur essendo un modello più simile all’uomo per i sistemi biologici non è

affatto ecnomico e facile da mantenere, perché è costoso mantenerlo per

la stabulazione, è più grande, ha tempo di generazione lungo (8/10

57

settimane) e ha progenie poco numerosa (6/8 figli).

Il sesso nei topi è dato da X e Y.

XX è fammina, XY è maschio.

Si riproducono come l’uomo, ovvero una fecondazione produce blastocisti, ovvero cellule saminali nella

stessa masta cellulare.

Hanno una gestazione di 19-21 giorni raggiungono la maturità sessuale in 6/8 settimane.

Il loro ciclo vitale è di 1-2 anni e ogni circa 40 giorni possono accoppiarsi.

Il topo è usato:

mutagenesi sito specifica, ovvero gli incroci tra consanguinei hanno portato a ceppi mutati (oppure

mutazioni indotte da sostanze chimiche o radazioni)

Se un topo ha una malattia, esso viene mutagenizzat in modo casuale per vedere se ciò porta a guarigione o

a miglioramento, poi trasmesso ai figli (mutazione favorevole alla sopravvivenza), allora è possibile poi

isolare la mutazione favorevole.

introduzione DNA, di solito iniettata nelle uova e poi integrazione casuale con plasmide che contiene

gene fluorescente.

Knock Out genico, su cellule staminali ingenierizzati (trasformate con DNA linaere che conteiene una

copia mutata del gene in esame) poi iniettate in un embrione ospite wild-tipe (una chimera) poi fatti

accoppiare in modo selezionato per ottenere topi knock out.

Mappatura dei geni mutati: incrociando ceppi di topi simili per produrre ibridi

Studi del comportamento

Sviluppo del mammifero con topi trasgenici

I modelli di topi più prodotti sono TOPI TRASGENICI E TOPI KNOCK-OUT.

① TOPI TRASGENICI:

Sono topi a cui è stato introdotto un gene estraneo o alterato che è

entrato nella linea germinale e nell’ereditato.

Perciò all’allele normale, presente nel topo, ne è stato aggiunto un altro;

nel topo il gene ha i suoi due alleli più uno nuovo.

La produzione di topi trasgenici avviene per microiniezione di DNA nel

pronucleo:

- Una cellula uovo omozigote appena fecondata presenta due pronuclei,

uno maschile e uno femminile, per un certo tempo separati.

- Il DNA ricombinante viene iniettato (microiniezione) nel pronucleo

maschile (più grosso di quello femminile) (il DNA ricombinante è un DNA

lineare contenente un transgene – ex GFP-)

- Tale DNA iniettato si integra casualmente nel genoma della cellula

ospite (ricombinazione determina integrazione)

- L’embrione modificato viene rimpiantato nell’ovidotto di un topo

femmina pseudogravida, che ha assunto ormoni per stimolare la

gravidanza.

- L’embrione di impianta e da esso vengono prodotti topi che hanno o

meno integrato il DNA estraneo

- Si compiono southern o PCR per verificare che i topi possiedono il DNA

estraneo integrata e in quel caso vengono utilizzati per successivi

accoppiamenti (sono eterozigoti).

Gli svantaggi di produre un topo transgenico sono legati al fatto che essi vengono usati per esprimere un

58

gene prima non presente nel topo (non per vedere cosa accade togliendo un presente), ma l’integrazione

del gene estraneo è casuale e potrebbe integrarsi a livello di cui gene vitale provocando la morte del topo,

oppure potrebbe produrre un fenotipo alterato non per il gene in sé ma per dove si è integrato. In questo

caso è necessario osservare più topi a cui è stato iniettato lo stesso gene e che se mostriamo la stessa

alterazione fenotipica, indicano che il carattere è determinato

dal gene inserito, non da dove si è inserito.

② TOPI KNOCK-OUT

Topi in cui un allele normale è stato sostituito da uno mutato

knock out di un gene significa togliere un gene

completamente o solo una parte, perciò l’allele normale non è

più presente.

La produzione di topi Knock Out si serve di cellule embrionali

staminali e di ricombinazione omologa:

- L’embrione allo stato di blastocista (ottenuto da topa gravida)

viene estratto e coltivato in piastra Petri.

- Le cellule staminale embrionale così ottenute possono essere

coltivate in diversi terretni di coltura così da differenziarle in

vari tipi cellulari (poste in terreni privi di diversi nutrienti);

OPPURE le cellule staminali embrionali così ottenute possono

essere mantenuti nelle petri con tutti i nutrienti necessari al fine di farle prliferare come cellule

pluripotenti;

OPPURE le cellule embrionali staminali possono essere iniettate in una blastula (embrione in sviluppo) così

da produrre un topo chimerico, cioè con alcune cellule che derivano dalle cellule staminali e alcune da

blastocista nuovo.

NB: Dopo la coltivazione iniziale su piastre Petri, si ha disaggregazione

dellamassa di cellule con tripsina priva di urilizzarle per uno dei tre

processi.

Se le cellule staminali embrionali (embrioni ibridi) vengono iniettate in un

topo ospite, da esso nascono topi chimeri distinguibili per il colore della

pelliccia topo blastocista: nero; topo cellule ricombinate: bianco.

I topi chimeri sono topi pezzati, con macchie bianche e nere e se si calcola il rapporto bianco-nero del pelo

se il bianco è minore del 30% il topo non produrrà linee germinali, ma possiede solo cellule ricombinanti

somatiche.

ESEMPIO: Si produce un topo Knock Out per il gene Myc, tramite ricombinazione miologa:

- Il plasmide che contiene il gene myc clonato deve essere reso ninattivo: lo si rompe inserendovi un gene

di resistenza alla neomicina funzionale.

Il plasmide contiene anche il gene per un marcatore (timidina-chinasi)

- Si estraggono cellule staminali da un embrione topo

- Il plasmide linearizzato viene trasfettato nelle cellule embrionali e si possono avere tre prodotti:

parte del plasmide è omologa al genoma della cellula staminale e si ha ricombinazione omologa

sostituzione del gene di tipo selvatico nel genoma cellulare con il gene interrotto (myc)

La ricombinazione non specifica con una sequenza non omologa del genoma cellulare fa sì che si abbia

inserzione casuale nel genoma del gene myc e del gene tk (entrambi integrati non completamente)

Non si ha alcuna integrazione del gene myc nel genoma cellulare

59

Le cellule risultanti da questi tre eventi sono riconoscibili per diversa

colorazione:

- omologa cellula rossa con gene bersaglio integrato interrotto

- non mologa cellula blu con gene bersaglio e gene Tk integrati a caso

- nessuna ricombinazione cellula viola

Queste cellule trasfettate vengono estratte e fatte crescere su di un terreno

contenente un antibiotico di cui timidina –chinasi, esterna al gene di

interesse, è marcatore e contenente un analogo della neomicina:

- Le cellule che non hanno subito ricombinazione muoiono poiché prive del

gene resistente alla neomicina;

- Le cellule che hanno subito ricombinazione non omologa muoiono, poiché

possiedono la timdina, marcatore dell’antibiotico che uccide le cellule;

- Le cellule che hannno subito ricombinazione omologa sono le uniche a

sopravvivere: hanno integrato il gene interrotto, perciò possiedono

resistenza ad ampicillina e sono prive del gene tk.

Selezione di cellule che hanno integrato il plasmide con il gene interrotto e

loro inserimento in un embrione allo stato di blastocisti, poi iìrimpiantato

nell’utero di una femmina pseudogravida.

La madre adottiva genera topi chimerici, con il pelo pezzato, che costituisce una conferma dell’avevnuta

integrazione del gene myc nel genoma cellule staminali nella linea embrionale che originano topi pezati.

L’accoppiamento topo chimera – topo nero (wild type) si ottengono tra i figli, topi marroni, cioè topi

eterozigoti che hanno ereditato l’allele .

Accoppiamento tra maschio – femmina marrone (fratelli) eterozigoti, produce un topo marrone omozigote

per il gene bersaglio topo Knock Out (sempre verifica geni con sotghern o PCR)

e si studia l’animale per vedere l’effetto dovuto alla mancancza del gene.

NB: Può accadere che il gene integrado sia letale in omozigosi

② TOPO CONDIZIONALE

Topo in cui il gene di interesse non viene silenziato/distrutto allo stato embrionale ma è distruggibile se

incontra le ricombinasi specifiche nelle varie zone del corpo.

Ricordo: premio nobel 2007 per l’uso di cellule come fare topi KO.

60

61

IL GENOMA I genomi occupano uno spazio molto più piccolo rispetto alla grandezza

dell’informazione genetica.

Un esempio che può essere fatto è quello del virus del tabacco (immagine), che ha

un genoma a RNA e lo spazio che occupa è molto minore rispetto alla forma del

capside. Ciò è reso possibile dal momento che l’RNA, interagendo con le proteine,

assume una forma a spirale, rendendo così possibile una condensazione.

Condensazione: è definita come il rapporto tra la lunghezza reale del genoma e quella acquisita nel

momento in cui è compattato. Le condensazioni non possono avvenire in maniera casuale, perché gli

enzimi che svolgono le funzioni devono avere accesso al DNA in maniera giusta e corretta, quindi è

necessario quindi un alto controllo.

Come possono essere compattati i genomi (genericamente)?

Avvolgimento: riduce lo spazio occupato dal DNA.

Superavvolgimento: riduce parecchio lo spazio occupato dal DNA.

Rilassato: è presente nei plasmidi, per esempio, dove tutto giace perfettamente sul

piano, è la situazione energeticamente favorita.

Nel nostro genoma sono presenti 10.5 paia di basi/giro elica; nel momento in cui si

vuole cambiare questo valore è necessario cambiare il numero di paia di basi per giro

d’elica, cosa di fronte a cui il sistema risponde superavvolgendosi. (in immagine 3

superavvolgimenti)

La forma superavvolta è quella che occupa meno spazio delle altre.

Se in laboratorio ho un plasmide di 5000 paia di basi dove ottengo le migrazioni di A, B, C

lineare:A standard A B C

rilassato: B 6000 -

superavvolto: C 5000 -

4000 -

3000 -

2000 -

1000 -

Questi superavvolgimenti si formano anche durante la replicazione e la trascrizione:

Durante la denaturazione si creano

superavvolgimenti in direzione opposta

rispetto a a quella in cui si sta aprendo

l’elastico (immagine), perché, denaturando, si

modifica il numero di paia di basi per giro

d’elica. La risposta del DNA è un

superavvolgimento.

Nelle cellule, sia procariotiche sia eucariotiche,

ci son enzimi in grado di controllare il grado di

avvolgimento del genoma e sono fondamentali

per la nostra vita, poiché senza di essi

moriremmo.

Il superavvolgimento è la diretta conseguenza

della tensione strutturale causata dallo svolgimento (avvolgimento) del DNA.

62

Per svolgimento del DNA si intende una diminuzione del numero di giri d’elica rispetto alla struttura più

stabile del DNA catalizzata da enzimi detti topoisomerasi.

Questi concetti fanno parte della topologia del DNA, nome dovuto all’esistenza di alcuni numeri

matematici che non vengono a variare finché non c’è una variazione del DNA nella sua continuità, cosa che

può essere effettuata incidendo la doppia elica e cambiando il numero di basi. L’unico modo per alterare la

sua topologia è con le topoisomerasi, che tagliano il DNA. Ciò significa che, anche se ci sono deformazioni,

la molecola torna come prima, dove con deformazioni si intendono allungamento, movimenti termici,

interazioni con proteine o altre molecole: tutto ciò non varia le proprietà del DNA.

E’ quindi necessario incidere la doppia elica (uno o entrambi i filamenti), tagliarla, per mutare quelle 10.5

coppie di basi per giro d’elica.

NB: Prendendo una molecola lineare non si può parlare di topologia perché ruoterebbe e scaricherebbe la

tensione.

Si può parlare di topologia solo per molecole di DNA covalentemente chiuse o che non possiedono

estremità libere. Questo concetto vale anche per i cromosomi (immagine cromosoma

metafasico) che si organizzano in anse, dove sono presenti proteine. E’

come se la molecola fosse circolare covalentemente chiuse, quindi si

può parlare di topologia. Un altro esempio è quello costituito da E. Coli, che possiede anse che si

superavvolgono su sé stesse occupando così poco spazio.

Effetto dello svolgimento del DNA:

Situazione rilassata 10.5 bp per elica (in immagine mostra come si

avvolgerebbe: per 8 volte un filamento passa sull’altro)

Con incisione ottengo una minor giro d’elica (per 7 volte un filamento passa

sull’altro)

Superavvolgimento o denaturazione sono i due possibili risultati; per scaricare

l’energia si hanno quindi due possibilità; se non ci sono appaiamenti possibili il

DNA si denatura e torna a 10.5.

I sistemi rispondono genericamente a variazioni nel numero di paia di basi.

(Genericamente perché fa eccezione Coli che è molto superavvolto per favorire le

denaturazioni, ciò lo aiuta nella trascrizione, utilizzando la denaturazione indotta dal superavvolgimento)

Per definire le proprietà del DNA vengono utilizzate formule

matematiche:

LINKING NUMBER (numero di legami) L E’ una proprietà

K

topologica del DNA, che non varia se non con tagli e corrisponde al

numero di volte in cui un filamento della doppia elica di DNA gira

intorno all’altro

Immagine:

A: In una molecola rilassata il numero di legame è uguale al numero di

bp totali diviso 10.5 (2100/10.5)=200

B: il numero di legame è una proprietà tipica solo di molecole integre,

se la molecola è tagliata (nick=interrompere un legame fosfodiesterico, che è break=rottura di due legami

fosfodiesterici, essendo il LK una proprietà topologica, non è contemplata.)

Se viene fatto break molecola diventa lineare, se fatto nick un legame è interrotto.

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Se viene fatto nick, togliendo 2 giri e si richiude, avremo quindi 198.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher serena.savoldi di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Landsberger Nicoletta.

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