Riassunto esame Biologia molecolare, prof. Altieri

TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

Il flusso dell’informazione genica va dal DNA all’RNA e da questo alle proteine. Il processo

che sintetizza l’RNA da uno stampo di DNA è chiamato trascrizione ed è attuato da un

enzima detto RNA polimerasi. Questo enzima è costituito da varie subunità e dopo essersi

legata al DNA lo apre creando una zona detta bolla di trascrizione.

l’RNA prodotto però non rimane legato al DNA ma si stacca ad una distanza di pochi

nucleotidi da dove è stato aggiunto l’ultimo ribonucleotide. Così l’RNA è pronto per

sintetizzare nuove proteine.

Dopo che il DNA è separato nelle due eliche, l’RNA polimerasi, che sintetizza in direzione

5’3’, utilizza solo uno dei due filamenti come stampo. Il filamento utilizzato come stampo

sarà quindi complementare al filamento di RNA messaggero, mentre l’altro filamento sarà

uguale al RNA messaggero ed è detto filamento codificante.

L’RNA polimerasi inizia la trascrizione legandosi a particolari sequenze sul DNA dette

promotori, situate all’inizio del gene da trascrivere. Inoltre il gene contiene anche un sito

da cui inizia la sintesi dell’RNA detto sito di inizio della trascrizione la quale procede poi

fino ad una sequenza definita terminatore.

Quindi la RNA pol a differenza della DNA pol non ha bisogno di un primer per iniziare la

trascrizione.

La trascrizione può essere suddivisa in una serie di passaggi:

Inizio : in cui avviene il riconoscimento del promotore e il DNA si apre formando la

- bolla di trascrizione.

Allungamento : in cui la polimerasi e la bolla si muovono lungo il DNA sintetizzando

- la nuova catena di RNA.

Terminazione : in cui l’RNA pol si arresta una volata arrivata al terminatore.

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L’RNA polimerasi è un enzima con forma a pinza e suddiviso in diverse subunità: 2α, 1β e

1β’ ed infine 1ω.

Le due subunità α sono responsabili dell’assemblaggio del complesso e contengono due

domini con due diverse funzioni:

Un dominio C-Terminale che si lega ad una zona del promotore chiamata UP-

- element.

Un dominio N-Terminale che è responsabile dell’interazione con le altre subunità.

-

La subunità β contiene il sito catalitico che sintetizza l’RNA, la β’ si lega al DNA ed infine la

ω ha la funzione di promuovere e mantenere stabile il complesso.

Oltre a queste, alla RNA polimerasi è legata un’altra subunità σ che permette all’enzima di

riconoscere il promotore.

Ciò che permette l’inizio della trascrizione è il riconoscimento tra promotore e una subunità

dell’enzima σ che si associa alla polimerasi formando l’oloenzima αα’ββ’ωσ. Il fattore σ

riconosce sequenze che si trovano a monte del sito di inizio della trascrizione.

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In realtà esistono diversi tipi di fattori σ, il più usato è il σ che riconosce un promotore che

contiene due sequenze conservative lunghe sei nucleotidi che si trovano in posizione -10

e -35.

Queste sequenze sono dette “sequenza consenso” è una sequenza ideale che

rappresenta le basi che più frequentemente si trovano in una determinata posizione. Per

esempio la sequenza in posizione -10, denominata Pribnow box, è caratterizzata da

un’elevata quantità di T e A.

Il fattore σ si lega alla RNA polimerasi occupando la zona interna tra le due parti della

pinza cioè tra le due subunità β occupando in parte il canale dove si posizione il DNA.

Il fattore σ è a sua volta diviso in diverse regioni chiamate σ1, σ2, σ3 e σ4.

La regione che riconosce l’elemento -10 è la

σ2, ma nei promotori che presentano

l’elemento -10 più esteso esso entra in contatto

anche con la σ3. Mentre quella che riconosce

la -35 è la σ4 70

Quindi il σ è il fattore che promuove

principalmente la trascrizione legando la

polimerasi al promotore. Ma esistono anche

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altri tipi di fattori σ. Un esempio è il σ il quale

in Escerichia Coli, dirige la polimerasi a trascrivere geni che codificano per proteine che

proteggono il batterio dalla shock termico.

Invece, in alcuni promotori procariotici è presente un elemento aggiuntivo sulla sequenza

in posizione -35 chiamato elemento UP. In questo caso la sequenza non viene

riconosciuta da il fattore σ, ma direttamente dalla subunità α della polimerasi. Questa

subunità α è legata al resto della RNA polimerasi tramite una struttura proteica detta

“giunto flessibile” che permette di raggiungere l’elemento UP anche se non si trova

immediatamente vicino alla regione -35. 30

Nella fase iniziale della trascrizione l’RNA pol sintetizza e rilascia dei corti filamenti di 9-12

nucleotidi. Cioè la RNA polimerasi si muove avanti e indietro su un corto filamento,

allungandosi e accorciandosi secondo un modello chiamato a “bruco”. Questa fase iniziale

è detta anche fase abortiva.

Dopo la fase abortiva quando l’RNA raggiunge la lunghezza di 9-12 nucleotidi alcuni

cambiamenti conformazionali della subunità σ permettono lo scorrimento lungo il DNA.

Inizia quindi la fase di allungamento. Nonostante la processività dell’RNA pol,

l’allungamento non è affatto un processo continuo e senza interruzioni, anzi spesso il

processo rallenta o si blocca.

Può succedere anche che la polimerasi incorpori un nucleotide sbagliato e per risolvere

questo problema esistono due tipi di correzioni:

Editing pirofosforico : meccanismo che è in grado di eliminare il nucleotide sbagliato

- legando ad esso una molecola di pirofosfato, provocando così la reazione invera

che porta al rilascio del nucleotide a cui sono legati tre gruppi fosforici.

Editing idrolitico : l’enzima in questo caso torna indietro di uno o più nucleotidi

- provocando il distacco della catena contenente errori. 4

In media durante la trascrizione viene fatto un errore ogni 10 nucleotidi.

La struttura topologica del DNA ha un ruolo importante nella trascrizione. Infatti, nel DNA

superavvolto negativamente (condizione fisiologica) è più facile aprire i due filamenti e

quindi formare la bolla di trascrizione. Durante la fase di allungamento, mentre l’RNA

polimerasi avanza il DNA si apre davanti all’enzima

ma allo stesso tempo si richiude dietro all’enzima

nelle zone che sono già state trascritte. Questo

fenomeno genera dei superavvolgimenti positivi

davanti e negativi dietro che vanno a determinare il

modello dei domini gemelli per la trascrizione che

può portare ad una eccessiva compattazione del

DNA che andrebbe a bloccare la trascrizione.

Quindi anche nella trascrizione è molto importante

l’azione delle topoisomerasi.

L’RNA polimerasi termina la trascrizione quando raggiunge delle zone dette terminatori.

L’arresto impedisce l’aggiunta sull’enzima di altri nucleotidi e quindi esso si dissocia. È

quindi necessario separare il filamento di DNA da quello di RNA neosintetizzato.

Questo può avvenire attraverso due meccanismi:

Attraverso sequenze denominate terminatori intrinseci che inducono i polimeri a

- staccarsi e rilasciare la catena di RNA. Un tipico terminatore intrinseco è

caratterizzato da un tratto di DNA ce contiene delle sequenze palindromiche ricche

in G e C seguite poi da un tratto ricco di A e T.

Oppure se la sequenza di terminazione non è in grado di promuovere il distacco

- interviene la proteina Rho che va a legarsi in una zona ricca di citosine andando poi

ad agire come un’elicasi.

REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI 31

Le cellule procariotiche sono particolarmente sensibili alla presenza di segnali esterni, per

lo più molecole presenti nel terreno di coltura che entrano nella cellula e interagiscono con

proteine regolatrici sia di tipo positivo che

negativo.

Le prime sono chiamate attivatori, sono implicate

nella regolazione positiva, ovvero vanno ad

incrementare la trascrizione. Le seconde invece

sono dette repressori, sono implicate nella

regolazione negativa e vanno quindi ad inibire la

trascrizione. In genere in assenza di proteine

regolatrici il legame della RNA polimerasi al

promotore è debole e ne risulta un livello di

espressione definito basale.

Questi fattori influenzano l’attività della RNA

polimerasi andandosi a legare su specifici siti in

prossimità del gene da codificare. In particolare la

trascrizione viene inibita dal legame del

repressore su una sequenza di DNA che prende

il nome di operatore. Mentre, l’attivatore ha due

siti di legame, uno interagisce con la RNA

polimerasi, l’altro riconosce una sequenza sul

DNA vicino al promotore, promuovendo un legame stretto e cooperativo della proteina sul

DNA scatenando una spontanea isomerizzazione nella conformazione aperta che

favorisce l’inizio della trascrizione.

Nel genoma dei procarioti i geni sono organizzati in operoni. Un operone è un gruppo di

geni adiacenti, trascritti insieme in una singola molecola di mRNA che viene chiamato

policistronico.

Nella gran parte dei casi i geni di un operone, oltre ad essere disposti sequenzialmente nel

genoma sono anche funzionalmente correlati poiché codificano proteine implicate in

un’unica via metabolica.

Un tipico operone è costituito da:

Uno o più geni strutturali che codificano proteine;

- Un unico promotore a monte che lega la RNA pol;

- Un operatore, che può andare ad interferire con la pol regolando l’espressione;

- Un gene regolatore che codifica per la proteina regolatrice, questo però può anche

- trovarsi lontano dall’operone.

La struttura dell’operone venne descritta nel 1961 da Jacob e Monod i quali studiarono

l’utilizzo del lattosio come fonte energetica in Escherichia coli e da quel momento

l’operone lac è considerato il modella di regolazione genica nei procarioti. Esso è soggetto

a due meccanismi di regolazione:

Una regolazione specifica da parte di un repressore: controllo negativo.

- Una regolazione globale da parte di un attivatore: controllo positivo.

-

Controllo negativo

Questa regolazione è responsabile della sintesi degli enzimi necessari quando la cellula si

trova a dover utilizzare lattosio come fonte di energia. Il metabolismo del lattosio necessita

di due enzimi: la β-galattosidasi ( che scinde il attosio in galattosio + glucosio) e la

permeasi espressi rispettivamente dai geni strutturale lacZ e la