Riassunto esame Biologia molecolare, prof. Altieri

Biologia molecolare

Gli acidi nucleici, DNA e RNA, furono scoperti nel 1869 da Miescher il quale riuscì a ottenerli come un precipitato che si forma quando degli estratti nucleari vengono trattati con acido.

Componenti degli acidi nucleici

Un acido nucleico è composto da un alto contenuto di P e C, N, O. Venne chiamato così perché presente nei nuclei cellulari. Sono costituiti da catene polinucleotidiche cioè polimeri lineari costituiti da unità chiamate nucleotidi. I nucleotidi sono molecole costituite da tre componenti:

• Uno zucchero pentoso
• Una base azotata
• Un gruppo fosfato

Gli zuccheri pentosi possono essere due: il deossiribosio nel caso del DNA o il ribosio nel caso dell’RNA. I due zuccheri differiscono solamente per un gruppo OH presente sulla posizione 2 del ribosio che invece manca nel deossiribosio. Questo gruppo OH conferisce maggiore instabilità alla molecola di RNA.

Basi azotate e nucleotidi

Le basi azotate che si trovano negli acidi nucleici possono essere con forma purinica (a doppio anello eterociclico) o pirimidinica (a singolo anello). Le puriniche sono adenina e guanina mentre le pirimidiniche sono citosina, timina (presente solo nel DNA) e uracile (presente solo nell'RNA). La differenza tra timina e uracile è la presenza di un gruppo metilico in posizione 5.

Quando una di queste basi lega in posizione 1 uno zucchero, abbiamo i nucleosidi ai quali può legarsi un gruppo fosfato dando così un nucleotide. Il gruppo fosfato può legarsi in posizione 5 o in posizione 3 sullo zucchero. Inoltre, un nucleotide può essere costituito da 1 o più gruppi fosfato legati in sequenza e indicati con le lettere α, β, γ. Per esempio, la ATP adenosina trifosfato è un ribosio che lega un’adenina e tre gruppi fosfato.

Legami e struttura del DNA

I nucleotidi si legano tra loro a formare delle catene polinucleotidiche. In queste catene ciascuna base è legata allo zucchero in posizione 1 con legame glicosidico che interessa l’azoto 1 nelle pirimidine e l’azoto 9 nelle purine.

Tra uno zucchero e un altro è presente un solo gruppo fosfato; infatti, durante la sintesi degli acidi nucleici ciascun nucleoside trifosfato perde due dei suoi gruppi fosfato e l’unico fosfato rimasto forma un legame estere con uno zucchero in posizione 5 e un altro legame estere con un altro zucchero in posizione 3. Questo legame è chiamato legame fosfodiesterico e conferisce alla molecola una certa polarità poiché ha due diverse estremità.

Cioè ad una estremità troviamo lo zucchero che ha il carbonio 5’ libero, mentre all’altra avremo il carbonio 3’ libero. Per convenzione le sequenze di acidi nucleici si scrivono in direzione 5’ → 3’ cioè dall’estremità 5’ libera a quella 3’.

Regole di Chargaff

Nel 1940 Erwin Chargaff, dopo numerosi studi arrivò a stilare delle regole sulla struttura del DNA:

• La composizione in basi del DNA varia da una specie all’altra;
• Le molecole di DNA isolate da tessuti diversi hanno la stessa composizione in basi;
• La composizione del DNA non si modifica con l’età e lo stato nutrizionale;
• In tutte le molecole di DNA la somma dei residui purinici è uguale alla somma dei residui pirimidinici (cioè A+G = T+C).

Struttura a doppia elica del DNA

Il 25 Aprile del 1953 Watson e Crick pubblicarono un articolo nel quale spiegavano la struttura del DNA. Secondo il loro modello il DNA ha una struttura a doppia elica (duplex) regolare. L’elica è destrorsa, compie un giro completo ogni 34 Å (ci sono circa 10 coppie per ogni giro), ha un diametro di 20Å e la distanza tra le due eliche è di 3,4Å. Inoltre, le due eliche sono antiparallele cioè una ha direzione 5’ → 3’ mentre l’altra 3’ → 5’.

Le basi che si legano tra loro formando i “pioli” della scala sono sempre una purina ed una pirimidina ed in particolare l’adenina lega sempre la timina e la guanina la citosina. Questo legame tra una pirimidina e una purina permette di spiegare la distanza sempre costante dell’elica.

Il legame tra le basi azotate è costituito da due legami idrogeno tra adenina e timina e tre legami idrogeno tra guanina e citosina. La doppia elica è una spirale destrorsa. Con l'avvitarsi su sé stessi dei due filamenti, restano esposti dei solchi tra i diversi gruppi fosfato. Il solco maggiore è largo 22 Å, mentre il solco minore è largo 12 Å. Con solchi si intende la distanza di un filamento tra i vari “giri” dell’elica.

La differente ampiezza dei due solchi si traduce in una differente accessibilità delle basi, a seconda che si trovino nel solco maggiore o minore. Infatti, come si nota nella foto nel solco maggiore le basi azotate (in blu) sono più visibili e quindi è più facile andare a rompere il legame tra loro. Proteine che legano il DNA, come i fattori di trascrizione, dunque, solitamente prendono contatto con le basi presenti nel solco maggiore. Ed inoltre le proteine con struttura ad α-elica hanno la grandezza giusta per interagire con il solco maggiore.

Una catena polinucleotidica ha una parte idrofila, cioè lo scheletro zucchero-fosfato, e una parte idrofoba ovvero le basi azotate. Quindi nella struttura a doppia elica abbiamo la parte idrofoba al centro e quelle idrofile esterne.

Stabilità della doppia elica

Nel suo insieme la stabilità della doppia elica dipende da varie forze. Gli atomi di fosforo, infatti, hanno delle cariche negative che tendono a respingersi ma queste cariche vengono controbilanciate da due forze: i legami ad idrogeno (più sono più è stabile) e l’effetto idrofobico dovuto all’impilamento delle basi (infatti le basi impilandosi mantengono il minimo contatto con l’acqua aumentando la stabilità). Quindi la stabilità del DNA a doppia elica non è costante ma varia da DNA a DNA ovvero a seconda del numero di legami ad H e dal tipo di impilamento. Per esempio, se ho più basi C e G avrò più doppi legami e quindi più stabilità.

Inoltre, a causa dell’impilamento delle basi e al grado di flessibilità dei legami chimici tra nucleotidi, il parallelismo dell’elica non è quasi mai perfetto e quindi per determinare la posizione delle basi sono stati stabiliti alcuni parametri:

• Twist: l’angolo tra due coppie di nucleotidi in rapporto all’asse dell’elica.
• Roll: è l’inclinazione che si forma a causa delle forze di repulsione tra due coppie di nucleotidi rispetto all’asse dell’appaiamento delle basi azotate.
• Tilt: l’angolo che si forma rispetto alla posizione dello scheletro zucchero-fosfato.

Strutture alternative del DNA

Il modello a doppia elica, ottenuta in condizione di alta umidità o soluzione acquosa, com’è la situazione in vivo, non è l’unico tipo di struttura esistente per il DNA ma ne esistono altre. Quella a doppia elica è anche indicata come forma B. Se si riduce l’umidità il DNA assume la forma A. Questa è destrorsa come la B ma differisce da essa per altri aspetti:

• Le coppie di basi hanno una maggiore angolatura rispetto all’asse della doppia elica.
• Ci sono 11 coppie di basi per ogni giro di elica.
• Il passo dell’elica è di 25Å e il diametro di 23Å.

La struttura A si trova anche in vivo nel caso di duplex formati da un filamento di RNA e uno di DNA o da due di RNA, poiché la presenza dell’ossidrile sul carbonio 2 del ribosio impedisce alla struttura di assumere la forma B.

La struttura Z invece è un’elica sinistrorsa, ha un diametro di 18Å e un passo di 46Å, quindi è più allungata e sottile della B. È una forma di DNA tipica delle zone ricche di G e C. Ciò che genera la struttura Z è il cambiamento di orientamento del legame glucosidico tra la guanina e il deossiribosio. Infatti, mentre nella forma B lo zucchero e la base sono presenti in conformazione anti, nella forma Z assumono la rara conformazione syn. Il passaggio da una conformazione all’altra avviene per rotazione intorno al legame glicosidico. Si ottiene quindi una struttura zig-zag tipica della forma Z è dovuta proprio all’alternarsi di conformazioni syn e anti.

La Tripla elica è una struttura in cui un tratto di catena duplex, che presenta un filamento di sole pirimidine e l’altro di purine, può accogliere nel solco maggiore una terza catena polinucleotidica, composta di sole pirimidine che presentano la stessa sequenza del primo filamento. Quindi le base azotate del filamento di purine formeranno legami ad H con due filamenti invece che con uno solo. Questi legami H non canonici sono detti appaiamenti di Hoogsteen. La forma a Quartetti di G è una particolare struttura a singolo filamento in cui sono presenti 3-4 guanine a breve distanza tra loro. Le quattro basi si vanno a disporre parallelamente tra loro e vanno a formare dei legami H guanina-guanina (appaiamenti di Hoogsteen).

La struttura cruciforme si ha quando, a breve distanza o adiacenti, sono presenti due coppie della stessa sequenza in ordinamento opposto (sequenze invertite o sequenze palindromiche se è possibile leggerle da entrambi i lati allo stesso modo). Queste strutture sono molto importanti soprattutto per l’RNA poiché abbiamo la struttura a trifoglio del t-RNA che è molto importante nella trascrizione del DNA.

Topologia del DNA

La struttura a doppia elica del DNA presenta molti vantaggi, per esempio è una stabile protezione del materiale genico, ma allo stesso tempo degli svantaggi poiché la sua struttura crea dei problemi durante i vari processi che richiedono un’apertura dell’elica e la separazione dei filamenti, come nella trascrizione e nella replicazione, dove il DNA si attorciglia su se stesso a formare strutture complesse dette superavvolgimenti.

Per controllare il grado di superavvolgimento, che se eccessivo può essere dannoso, è necessario che il DNA venga tagliato su uno o entrambi i filamenti, fatto ruotare ed infine rilegato. Per questo compito gli organismi hanno sviluppato una classe di enzimi detti topoisomerasi che hanno la caratteristica di tagliare i filamenti di DNA.

Per definire il grado di superavvolgimento si utilizzano i parametri seguenti:

• Twist o torsione: indica il numero di volte che un filamento incrocia l’altro, definisce quindi il grado di avvitamento.
• Writhe o contorsione: indica il numero di volte in cui l’asse centrale dell’elica incontra se stessa formando i superavvolgimenti.

Questi valori hanno segno + se l’elica è destrorsa e – se sinistrorsa. La somma delle due grandezze indica il numero di volte che un filamento si avvolge sull’altro ed è definito numero di legame (linking number) Lk: Lk=Tw +Wr. Questa equazione descrive le possibili conformazioni che il DNA assume nello spazio tridimensionale. Se Lk = 0 la molecola è rilassata, cioè non ci sono superavvolgimenti. Inoltre, Lk è sempre un numero intero. Se invece Lk è diverso da 0 la molecola è superavvolta.

Esistono due tipi di superavvolgimenti: quello che vediamo nel DNA “nudo” che si chiama avvolgimento plectonemico e quello che si ha quando il DNA si avvolge intorno all’ottamero istonico (cromatina) che si chiama avvolgimento toroidale. Topoisomeri: due molecole con stessa sequenza di basi ma topologia diversa. Dei topoisomeri che differiscono anche per un solo numero di legame possono essere risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Ma il valore di superavvolgimento può essere sia positivo che negativo. Il superavvolgimento negativo serve come riserva di energia libera che aiuta i processi in cui è richiesta la separazione delle eliche del DNA quali replicazione e trascrizione. Il superavvolgimento positivo in natura si trova solo in particolari organismi termofili che vivono a temperature molto elevate e serve per far sì che le molecole non si denaturino. Quindi per controllare il superavvolgimento esistono le DNA topoisomerasi che sono in grado di tagliare in maniera transitoria il o i filamenti di DNA mediante una tirosina che si lega covalentemente ad un fosfato con una reazione di transesterificazione fatta dal suo gruppo fosfato.

Tipi di topoisomerasi

Le topoisomerasi sono principalmente di due tipi:

• Tipo I: che tagliano un solo filamento (aumenta il Lk di 1 e non richiede ATP). La topoisomerasi taglia un filamento e in questo modo l’altro filamento passa attraverso l’interruzione eliminando il superavvolgimento. Inoltre, possiamo dividerle in IA che si lega al fosfato 5’ e IB che si lega al fosfato 3’.
• Tipo II: sono in grado di eliminare due superavvolgimenti alla volta. (aumenta il Lk di 2 e richiede ATP). Queste hanno un meccanismo più complicato: la topoisomerasi taglia un filamento chiamato segmento gate G. L’altro segmento, chiamato segmento transport T, passa attraverso un’apertura della topoisomerasi II che si apre per accoglierlo. Poi il segmento T attraversa la topoisomerasi la quale si apre nella parte inferiore rimuovendo il superavvolgimento.

Inibitori delle topoisomerasi

La topoisomerasi I introduce un nick, cioè un taglio, nel filamento di DNA per permettere la rotazione di un’elica rispetto all'altra. Il nick è transiente e viene rapidamente rilegato dalla stessa topoisomerasi. Farmaci come l’irinotecan si legano al complesso DNA-nick-topoisomerasi impedendo il rilascio dell’enzima che rimane legato al filamento di DNA attraverso un residuo di tirosina. Questa interruzione determina la formazione di un one-end DSB quando la forca di replicazione raggiunge il sito di interruzione.

Struttura del RNA

L’RNA chimicamente è molto simile al DNA poiché differisce solamente per un OH in posizione 2. La presenza di questo gruppo, per l’ingombro sterico, impedisce all’RNA di assumere la conformazione B del DNA, ma è più spesso presente come unico filamento. Questo gruppo ossidrilico conferisce anche un'elevata reattività all’RNA che infatti è in grado di svolgere funzioni catalitiche. Gli RNA con funzione catalitica si definiscono ribozimi. Inoltre, a differenza del DNA, contiene l’uracile al posto della timina.

L’RNA ha molteplici funzioni all’interno della cellula e questo è dovuto al fatto che può assumere numerose conformazioni che le permettono di diversificare le sue funzioni biologiche. Questo è possibile per due motivi: primo perché le basi possono ripiegarsi liberamente ed inoltre perché le basi possono formare anche altri legami oltre a quelli canonici.

Proprio per questa capacità di formare strutture diverse è possibile disegnare catene che sono in grado di adattarsi e interagire specificamente con un gran numero di molecole diverse, per esempio l’ATP e gli antibiotici, ecc. Queste molecole sono dette aptameri.

Alcune strutture che può formare l’RNA sono:

• Pseudonodi: gli appaiamenti tra le basi non avvengono tra zione contigue dando vita a strutture complesse.
• Motivo A minore: in cui l’adenina si posizione all’interno del solco minore di regioni a doppia elica.
• Struttura a trifoglio del RNA di trasporto

Il codice genetico

Una volta dimostrato che il DNA rappresenta il materiale genetico è stato subito chiaro che un gene deve avere due proprietà fondamentali: deve poter essere replicato e deve poter esprimere fenotipicamente un carattere. Per la replicazione Watson e Crick ipotizzarono, già nel loro primo trattato, un meccanismo di copiatura. Invece, per quanto riguarda la capacità di esprimere e controllare un fenotipo il discorso era più complesso.

Successivamente si consolidò l’idea della colinearità tra gene e proteina: cioè che la mutazione di un gene era collegata ad un cambiamento di amminoacidi nella catena proteica. Quindi si concluse che il gene va visto come una struttura lineare, la catena nucleotidica, che codifica per una struttura lineare di una proteina, rappresentata dalla sua sequenza amminoacidica.

Quindi il problema più grande della biologia era capire come una sequenza di 4 basi poteva essere tradotta nei 20 amminoacidi. Il “dogma centrale” proposto da Crick nel 1958 sintetizzava le informazioni di allora sul flusso dell’informazione genetica. L’ipotesi, non dimostrata e quindi chiamata dogma, prevedeva che l’informazione può essere scambiata e mantenuta tra gli acidi nucleici, ma non può essere trasferita dalle proteine di nuovo agli acidi nucleici.

Questo concetto ha subito variazioni quando nel 1970 fu scoperta la trascrittasi inversa, cioè l’esistenza di un enzima in grado di sintetizzare molecole di DNA da stampi di RNA. Ma comunque ancora oggi non c’è alcuna evidenza che l’informazione possa passare dalle proteine al DNA.

A metà degli anni '50 si iniziò ad affrontare il problema della decifrazione del codice genetico. Il fatto che questo fosse costituito da triplette di basi era stato ipotizzato sulla base di semplici considerazioni numeriche. Crick ipotizza che il codice è costituito da 64 triplette (4³) ognuna codificante per un amminoacido. La sequenza di tre nucleotidi che codifica per un amminoacido è chiamata tripletta o codone.

La decifrazione del codice genetico che consisteva nell’identificazione della corrispondenza tra codoni e amminoacidi è stata un’importante impresa scientifica che ha visto impegnati vari gruppi di ricercatori. I metodi usati furono principalmente due:

• Il primo metodo, mediante il quale venne scoperto che il codone UUU codifica per la fenilalanina, faceva uso di un sistema di sintesi proteica in vitro. Si presero delle cellule di Escherichia coli.