Biologia molecolare - macroarrays

I macroarray

I macroarray costituiscono una tecnologia omica ,nel senso che permettono di valutare

sistematicamente la situazione di un gene, che sia un’espressione o una mutazione oppure

l’espressione differenziale di isoforme di mRNA, anche se molto difficile.

A livello di DNA genomico si possono vedere lo stato di organizzazione del genoma, quindi dei

geni, mutazioni ma anche ripetizioni e perdite. Si può fare per ogni RNA o DNA presente in una

cellula.

Se applicata a cellulle di tessuti diversi, si può costruire un atlante dell’espressione di tutti i geni di

tutti i tessuti. E questo può essere fatto anche per tutte le forme tumorali, tant’è che esistono già

online degli atlanti di cancer genome.

Cos’è un macroarray? È un vetrino come quelli per preparati istologici, molto piccola, con tanti

puntini che non si vedono ad occhio nudo, che contengono ognuno una sequenza di DNA diversa,

che può essere un gene, ecc.. In genere si hanno due campioni, si estraggono gli RNA e l’ RNA

viene trasformato in cDNA. Uno di questi viene marcato in un modo, l’altro in un altro, tipicamente

con fluorofori diversi. Quindi si ha tipicamente un cDNA rosso e un cDNA verde, si prendono, si

mischiano e si pongono sopra il vetrino e si permette al cDNA di ibridizzare con il DNA, con le

sequenze complementari. Questo vuol dire che uno spot si colorerà di rosso o di verde a seconda

se la propria sequenza era complementare ad un cDNA colorato di rosso o di verde. Poi si prende

il vetrino, si fa una scansione per la lunghezza d’onda rossa e per la lunghezza d’onda verde e

quindi poi si sovrappongono le immagini e ci sono gli spot gialli quando l’intensità di fluorescenza

rossa e verde è uguale. Se l’intensità di fluorescenza non è uguale, allora il colore è più spostato

sul verde o sul rosso a seconda della sequenza.

E’ una tecnica di ibridizzazione di acidi nucleici. Dal southern in poi, passando per la PCR, quando

vai a valutare acidi nucleici c’è sempre uno step che è l’ibridizzazione, perché la specificità degli

acidi nucleici la controlli in quel modo.

I macroarray permettono di far questo. Ma vediamo adesso in maniera più sistematica.

I macroarray son in genere dei vetrini che contengono spot microscopici di sequenze di DNA,

ognuna delle quali può presentare un gene. Sostanzialmente, su un vetrino puoi avere tutti i geni di

un genoma.

Questi DNA sono legati alla superficie del vetrino, perché durante l’ibridizzazione non si staccano.

Puoi integrare sistemicamente il genoma e di questo puoi identificare i geni, valutare l’espressione

genica, utilizzarli per identificare mutazioni e polimorfismi. Per la prima e la terza cosa è un po’

superata dal sequenziamento parallelo, molto più veloce e meno dispendioso.

DI macroarray ce ne sono vari e differiscono per il materiale in cui sono fatti e per il DNA presente

sullo spot. Devi estrarre il DNA o l’RNA e marcare i campioni (sia per marcatura diretta o indiretta

l’RNA o con il nick translation per quanto riguarda il DNA). Dopo di che bisogna fare

l’ibridizzazione, solitamente competitiva (descritta prima), ma potrebbe essere anche non

competitiva, cioè ogni cDNA rosso e verde vengono ibridizzati su vetrini diversi, ma con gli stessi

spot con gli stessi DNA.

La prima differenza tra i vari macroarray esistenti è cosa c’è sullo spot, cioè se è un DNA lungo

( preparati “in casa” o ad hoc da ditte specializzate) o se il DNA è sintetizzato chimica