Biologia molecolare

Programma

• CAP 4 DNA
• CAP 5 RNA
• CAP 8 Genoma, Cromatina e Nucleosoma
• CAP 9 Replicazione
• CAP 10 Mutabilità e Riparazione del DNA
• CAP 12 Trasposoni: Trasposizione Solo
• CAP 14 Splicing
• CAP 15 La Traduzione
• Sul Gene X, CAP 19/20 Trascrizione, CAP 3 Tecniche

• 1) PCR
• 2) Nucleasi
• 3) Il Clonaggio
• 4) Vettori di clonaggio
• 5) Rilevatori degli acidi Nucleici
• 6) Elettroforesi in gel
• 7) Sequenziamento del DNA
• 8) Metodi di trasferimento, Southern, Northern, e Western Blotting
• 9) Centrifugazione
• 10) Gen Reporter
• 11) Spettrofluorimetria

Grafici da imparare a seguire:

Fino a 70° il DNA è molto stabile e non si osserva nulla. Aumentando la temp dai 75 ai 90 si osserva aumento dell'assorbanza. Questo è dovuto al fatto che prima dei 75° il DNA è ancora a doppia elica, aumentando la temp le interazioni deboli tra le basi iniziano a rompersi. Il DNA comincia a denaturarsi e così le basi sono maggiormente esposte e quindi capaci di assorbire più luce UV (ipercromicità). Si arriva poi ad un picco in cui la temp intorno ai 90° l'assorbanza rimane costante perché i filamenti di DNA sono ormai completamente separati. Questo punto è chiamato temp di fusione ed è il valore di T al quale il 50% del DNA è denaturato.

La Tm specifica è a ogni curva, ogni molecola di DNA e le coppie G:C danno un maggiore contributo alla stabilità rispetto alle coppie A:T grazie al maggior numero di legami H. Anche il PH influenza la Tm. Se il PH è acido si trovano cariche positive che si associano con il DNA rendendolo più stabile, quindi TTm sarà maggiore. Inizialmente si pensava che le molecole di DNA fossero lineari e avessero 2 estremità libere, oggi sappiamo che molte strutture molecolari di DNA sono circolari. La maggior parte dei cromosomi batterici sono circolari, molti batteri hanno piccoli elementi genetici capaci di replicarsi in modo autonomo detti Plasmidi, molecole circolari. Es il barrettaggio N in E.Coli a volte è lineare e a volte circolare.

Nelle molecole lineari di DNA, poiché le estremità sono libere, il numero di avvolgimenti di un filamento attorno all'altro può essere modificato dalla rotazione reciproca, mentre le molecole sono legate l'una all'altra formando una struttura circolare. Il numero di volte che un filamento gira attorno all'altro non può cambiare, questo DNA circolare covalentemente chiuso (cccDNA) ha una struttura vincolata. Dato che non ci sono interruzioni, i due filamenti di cccDNA non possono essere separati se non rompe un legame covalente. Se invece ci vogliamo separare senza alcun rottura permanente di un legame dell'ossatura zucchero fosfato è necessario far passare più volte un filamento attraverso l'altro filamento. Il numero di volte che verrà fatto passare influenzerà le catene possono separarsi.

Lineari di DNA le estremità sono libere e il num di avvolgimenti attorno all'altro può essere modificato tramite rotazioni reciproci.

CAP 5 RNA

L'RNA si trova principalmente come molecola a singolo filamento di acido ribonucleico. È una molecola implicata in vari ruoli biologici di codifica, regolazione e espressione dei geni.

DNA e RNA sono acidi nucleici. L'RNA è assemblato come una catena di nucleotidi ma in natura gli RNA si trovano come singolo filamento ripiegato su se stesso.

Gli organismi cellulari utilizzano l'RNA messaggero (mRNA) per trasmettere le informazioni genetiche.

L'RNA differisce dal DNA per tre specifiche caratteristiche. Primo, l'impalcatura fundamentalmente contiene il ribosio, non il deossiribosio. Il ribosio ha un gruppo ossidrilico in posizione 2. Secondo, l'RNA contiene uracile al posto della timina e vocale è la stessa struttura della timina solo un singolo anello aromatico ma privo del gruppo metilico da timina con il 2-O-metil-quacile detto U.

L'RNA è normalmente un singolo catena polinucleotidica e esso non viene usato come stampo per la sua replicazione come accade nel DNA.

L'RNA è intercettario in formato di mRNA tra il gene e la sintesi di proteine di RNA a singolo filamento non spesso pronunciata a trans di doppia elica.

Spesso il polimero si piega su se stesso formando coppie di basi tra sequenze complementari esso assume forme strutture fociera a gemma o ad aria simplee secundum

Ma dovendo formare curve che regolari, l'RNA è libero di riaggiustarsi nelle più diverse strutture tetrisiche ciò può avvenire che l'RNA abbia la possibilità di restare molto facilmente ancora ai legami fosfodiesterici e formare struttura complesse.

Alcuni RNA sono enzimi. Per molti anni si è pensato che solo le proteine venissero formate enzimatich. Un enzima deve essere in grado di leggere il substrato mediante un reazione chimica. Relasciare il prodotto di reazione e ripetere 1 urvo molte volte. Le proteine sono le alotre a questo lavorio perché sono composte da aa (2a:) possono cigiama in strutture tetrisiche complesse che forniscono tasche a accogliere il substrato ora sappiamo che alcuni RNA possono assumere strutture tetrisiche complesse ed essere enzimi fondamentalmente.

Fosfodiesterico: fosforo (P) legati covalentemente ad alte molecole.

Grafici denaturazione

• Semplice filamento
• d. filamento

Curva di denaturazione

(Sigmoide)

Dipendenza di Tm dalle coppie di basi:

(Tm è maggiore per le coppie C-G)

• 0,01M
• 0,1M
• 0,4M

Dipendenza di Tm dalla concentrazione salina

(all’aumentare della concentrazione salina aumenta Tm)

Tm > Temp di Helix?

Curva di Rinaturazione

(Spostata in funzione del Tempo)

Concentrazione tempo

Dipende dalle seq. maggiori e la presenza di C-C più energia dell’idrogeno.

Duplicazione del Cromosoma e Segregazione

Esistono elementi nei cromosomi eucariotici che non appartengono alla categoria dei geni. I geni che non sono coinvolti nella regolazione dell'espressione genica, questi sono le origini di replicazione che stimolano la duplicazione del DNA.

I cromosomi contengono una singola origine per il movimento dei cromosomi, che è il centromero che agisce come maniglie per il movimento dei cromosomi verso le cellule figlie. I telomeri che proteggono e si estendono la replicazione delle estremità dei cromosomi lineari.

Le origini di replicazione sono i siti in cui il complesso proteico necessario per la replicazione del DNA si assembla, di norma sono posizionate ogni 30-40 kb (kibobases) lungo ciascun cromosoma e sono posizionate di norma sulle regioni non codificanti.

I centromeri sono necessari per una corretta segregazione dei cromosomi dopo la replicazione essi compongono la formazione di un complesso proteico chiamato cinetocore che interagisce con dei filamenti proteici chiamati microtubuli che allontanano i due cromosomi fratelli trascinandoli nelle cellule figlie. È fondamentale che vi sia un solo centromero per ogni cromosoma.

In assenza di centromeri i cromosomi segregano in modo casuale dando vita a cellule figlie che hanno perso un cromosoma o ne possiedono due coppie. I telomeri sono le unità alle due estremità dei cromosomi lineari e grazie alle giovani proteine e proteggono le estremità da eventi frequenti come degradazione o ricombinazione.

I telomeri agiscono come origini di replicazione specializzate che permettono alla cellula di replicare le estremità dei cromosomi. I telomeri facilitano la replicazione grazie ad un'enzima la telomerasi.

Durante la divisione cellulare i cromosomi devono essere duplicati e quindi segregati nelle cellule figlie. Nelle cellule barriere che questi eventi avvengono contemporaneamente e cioè non appena il DNA viene copiato, le due copie sono separate ai poli opposti della cellula. Invece le cellule eucariotiche duplicano e segregano il proprio cromosoma in tempi diversi.

Durante la divisione cellulare il num di cromosomi nelle cellule figlie è uguale al num dei cromosomi della cellula parentale. Divisione chiamata divisione mitotica. I1 ciclo cellulare mitotico può essere suddiviso in 4 fasi. G1, S, G2, M. La replicazione del cromosoma avviene nella fase S fase di sintesi. I cromatidi fratelli sono tenuti insieme grazie ad un processo definito coesione dei cromatidi fratelli. Grazie alla telomerasi alle 2 estremità cromatidico.