Biologia molecolare

II

polimerasi II), questo contiene due fattori che a sua volta sono XPB e

XPD che hanno un’azione elicasica sui due filamenti in senso opposto

(uno in direzione 3’ e uno in direzione 5’). Questo fattore apre una sorta

di bolla nel DNA in corrispondenza del punto in cui vi è il difetto. Si

aggiunge poi un fattore detto XPG.

Gli eventi successivi sono descritti dopo perché comuni ai due processi

NER.

Transcription coupled NER: è un meccanismo di riparazione legato alla

trascrizione, non riguarda tutto il genoma ma le aree del DNA che

vengono trascritte, quindi quelle fondamentali perché codificanti e vitali

per la cellula. Il danno viene

individuato dalla polimerasi II

durante la trascrizione. In questa

riparazione agisce la RNA

polimerasi II che deve

sintetizzare un RNA messaggero,

intanto mentre denatura il

filamento avanza trascrivendo

l’RNA, quando incontra un dimero

di pirimidine si arresta perché è

in grado di riconoscere un danno.

Qui agiscono CSA e CSB che

fanno arretrare la polimerasi che

ridissocia e reclutano TH F, XPG

II

e altri. Quindi si passa da una

fase di trascrizione a una fase di

riparazione. È dunque la

polimerasi che mentre effettua la

trascrizione di tratti codificanti si

accorge che il DNA è malformato

e ha dei danni consistenti e

quindi richiama tutte le proteine

necessarie per la correzione di

questo errore.

Entrambi i processi arrivano al

punto in cui sul DNA aperto a bolla si ha legato XPG e TH F, a questo

II

punto interviene RPA che tiene aperta la bolla permettendo il legame di

altre proteine al complesso. Interviene dunque XPA che si lega nel sito

presunto danneggiato e ha il compito di verificare che l’errore ci sia

realmente (questi meccanismi potrebbero essersi formati anche per un

errato arresto della polimerasi senza necessariamente la presenza di un

danno). Se XPA riconosce che c’è veramente un danno iniziano i processi

di taglio (se XPA non si lega il complesso si disassembla). Viene reclutato

dunque XPF che insieme a XPG sono delle nucleasi, che permettono il

taglio a monte a valle del danno, vengono rimossi circa una trentina di

nucleotidi. Poi intervengono le polimerasi replicative (δ e ε) che riparano

il filamento che mediante una ligasi viene saldato a quello già presente.

BER (base excision rapair): riparazione dei danni che interessano le basi.

 Si può formare un sito abasico per idrolisi della base dallo scheletro

zucchero fosfato (che permane intatto), oppure per una rimozione attiva

della base stessa perché riconosciuta come danneggiata. Ci sono enzimi

detti DNA glicosilasi che sono in grado di riconoscere delle

modificazioni specifiche delle basi, queste agiscono andando a rimuovere

le basi riconosciute come scorrette dallo scheletro, quindi anche in

questo caso si ottiene un sito abasico. Esempi di glicosilasi:

UNG=riconosce la presenza di uracili nel DNA; OGG1 = individua basi

ossidate, MPG= riconosce purine alchilate; MBD4 = pirimidine

mismatches. Non riconoscono la distorsione strutturale ma riconoscono

proprio delle modificazioni specifiche chimiche.

Il sito abasico deve dunque essere riparato, la formazione di siti abasici

viene riconosciuta da un’endonucleasi APE, che fa un taglio in 5’ subito

dopo il sito abasico (crea un nick nel filamento che contiene il sito

abasico). È la presenza del Nick che innesca dei meccanismi di

riparazione.

Short patch: interviene una polimerasi che sostituisce un singolo

nucleotide, riconosce il nick e sostituisce quello abasico utilizzando l’altro

filamento come traccia. È la polimerasi β che si lega grazie al fattore

XRCC1. Interviene a questo punto la ligasi III che fa a richiudere il

filamento formando il legame fosfodiestereo.

Long patch: è dato da una polimerasi δ o ε che intervengono in

collaborazione con PCNA, queste sono più processive e sintetizzano un

filamento di circa 10 nucleotidi, questo filamento viene sintetizzato

scalzando il tratto con

il nucleotide abasico,

si forma una falda. A

questo punto la FEN1

(flap endonucleasi)

taglia il frammento

che aveva creato la

falda e che era

rimasto attaccato per

un nucleotide. A

questo punto

interviene la ligasi I

che salda il

frammento. Questo

processo utilizza quasi

tutti gli stessi

componenti molecolari della replicazione del filamento discontinuo.

Non-homologus end-joing:

1) ovvero

saldatura delle estremità in caso di

rottura di doppi filamenti (c’è un

metodo che serve anche nella

ricombinazione del DNA, in crossing

over). Quando la doppia elica è

spezzata non si può usare uno dei

due filamenti come templato

(riparazione dei DBS, double strand

break). Nel riparare questi danni la

cellula può introdurre degli errori, in

particolare la

cellula non riesce

a capire se i due

frammenti prima

della rottura

appartenevano a due zone contigue. Il

sistema riconosce solo se il filamento non

ha termine ma non quale era l’altro frammento adiacente che si è rotto. La

cellula non è detto che sia in grado di giuntare i punti giusti. Le parti tagliate

sono riconosciute da due proteine che si attaccano alle estremità (proteine Ku)

e attirano la DNA-PKcs, cioè la DNA chinasi che è in grado di fosforilare Ku70 e

Ku80, che tendono ad attirare un doppietto simile. Quindi due estremità con un

doppietto proteic Ku si attirano a vicenda e si affiancano. Queste Ku hanno

anche attività elicasica con separazione delle due eliche, si formano delle

estremità coesive, in quanto sono estremità a singolo filamento. Viene

promosso l’appaiamento di queste estremità coesive a singolo filamento per

microomologia (nella migliore delle ipotesi erano contigue quindi si spera che ci

siano delle piccole zone di complementarietà in cui sono possibili degli

appaiamenti che permettano di appaiare le due estremità). La chinasi attiva

anche una proteina Artemis che va a tagliare le zone di Flap che sono le zone a

singolo filamento in cui non è avvenuto l’appaiamento. Una volta tagliate

XRCC4 richiama la DNA ligasi IV che va a saldare i due filamenti della doppia

elica. Nella zona di appaiamento le due sequenze sono state appaiate

forzatamente quindi sono per forza state introdotte delle mutazioni (processo

utilizzato per introdurre delle mutazioni nelle immunoglobuline in cui risulta

utile). Giunzione forzata di estremità che non risultano essere omologhe.

SDSA: Modo alternativo di riparazione di Double strand break per un

meccanismo simile alla ricombinazione. La cellula può sfruttare l’altro

cromosoma omologo, essendo cellule diploidi, che si suppone integro in quel

punto, come stampo per sintetizzare un frammento omologo. Le estremità che

sono pari perché il taglio è fatto negli stessi nucleotidi in entrambi i filamenti del

cromosoma danneggiato viene modificato in modo da allungare l’estremità 3’

rispetto a quella 5’ (in realtà è quella 5’ che si accorcia per l’azione

esonucleasica di un enzima) e portarla per un tratto a singolo filamento, questa

estremità è detta ricombinogenica. Si apre l’elica nel cromosoma omologo e qui

si appaia il singolo filamento che è stato sintetizzato usando come stampo il

cromosoma omologo integro. Infine avviene la saldatura. In questo processo si

possono avere delle mutazioni per riconversione genica.

Ricombinazione DNA:

Processo voluto e naturale perché porta a variabilità genetica. Permette di generare

nuove combinazioni di geni in un genoma. Innanzitutto la variabilità si ottiene per

mutazione in quanto i processi di riparazione non sono perfetti. Ma si ottiene anche da

un processo di ricombinazione, si parla di ricombinazione omologa quando avviene tra

i due cromosomi omologhi nelle cellule gametiche (uno ereditato dal padre e uno dalla

madre), non sono uguali ma molto molto simili. Lo scambio di materiale genetico si

basa sull’omologia, la ricombinazione è un processo casuale, e più due geni sono

distanti più è probabile che possano ricombinare tra loro. Le mappe genetiche si

costruiscono basandosi sulle frequenze di ricombinazione (la massima frequenza di

ricombinazione è 50%). La ricombinazione omologa avviene nei gameti a livello della

meiosi, coinvolge sempre e solo due cromatidi (quelli affiancati e non quelli esterni).

La ricombinazione tra due sequenze omologhe prevede la rottura e lo scambio tra

molecole di DNA. Per studiare la ricombinazione vengono usati dei marker genetici per

verificare se una molecola è ricombinante o meno. I marcatori sono geni che esistono

in forme alleliche diverse e servono per capire se è avvenuta o meno la

ricombinazione.

Uno dei primi ad affrontare il problema è stato Holliday, il quale iniziò a studiare il

processo di ricombinazione che poi venne

migliorato e corretto. Questo sosteneva per

esempio presi due cromosomi con due geni

presenti in combinazioni alleliche diverse, uno con

A e B e l’altro con sequenze alleliche omologhe a’ e

b’ (sequenze simili ma diverse per pochi nucleotidi)

perché avvenga la ricombinazione si formeranno

due nick nelle sequenze omologhe seguiti da uno

scambio incrociato dei filamenti. I filamenti si

riappiano scambiati e le due molecole di DNA

formano un chiasma. Nella prima ipotesi sostiene

che il chiasma potesse migrare lungo la molecola

di un certo tratto creando una zona in cui due

singoli filamenti sono appaiati scambiati, zona

duplex (doppia elica data da singoli filamenti di

provenienza diversa). Le due eliche sono appaiate

e si devono separare per poter andare incontro alla

meiosi, questo secondo Holliday avveniva per

risoluzione del chiasmo, ovvero per inversione del

chiasmo dovuta alla rotazione di due dei filamenti

intorno a uno tenuto come perno. Si forma dunque

la croce di holliday o forma aperta. Ci sono dunque

due possibili piani di taglio per separare le due

molecole, a seconda di quale dei due tagli ottengo una molecola ricombinante oppure

no (la probabilità è del 50%). Se taglio secondo un piano ottengo una molecola ibrida

non ricombinante (questa ha un tratto centrale ibrido duplex ma i marcatori corretti

sono ancora abbinati sullo stesso filamento A→B e a’→b’), mentre nell’altro caso

ottengo una molecola ricombinante con lo stesso un filamento centrale duplex (A→a’ e

B→b’), 50% di possibilità che con il processo avvenga o meno la ricombinazione.

Questo modello è stato successivame