Biologia Molecolare

Caratteristiche del Fago Lambda e del suo ciclo di infezione

trascritti dalla RNA polimerasi del batterio. I due promotori hanno delle sequenze consenso molto forti, quindi l'efficienza per il legame con sigma è molto alta. Avviene, dunque, sia la trascrizione verso destra che verso sinistra.

La proteina prodotta da N, pN è un antiterminatore: si tratta di una proteina che inibisce NusA, il sito che rileva la forcina di terminazione all'interno della RNA polimerasi. Sostanzialmente grazie a pN viene superato ogni codone di stop, sia per i geni di destra che di sinistra, in modo tale che tutti vengano trascritti. Un sito molto importante, che entra in gioco in questo caso, è il sito Nut, che codifica per una proteina che lega pN alla RNA polimerasi.

Dunque la RNA polimerasi trascrive sia i geni di destra che di sinistra:

A destra: vi sono tutti i fattori trascrizionali.

A sinistra: vengono prodotti geni che codificano per proteine come xis e int, le integrasi, che giocano un ruolo importante nella fase

lisogenica.76Vi è da considerare un'altra importante proteina: cI, che se espressa definisce la fase lisogenica. Il promotore di cI sta tra N e cro, ma è un promotore debole e trascrive verso sinistra, viene definito: PRM. E' l'azione combinata di cro e cI che definisce la fase lisogenica piuttosto che quella litica:

• Quando viene espresso cI abbiamo la fase lisogenica.
• Quando viene espresso cro abbiamo la fase litica.

LA FASE PRECOCE

La proteina codificata a partire dal gene cro, pCro è un REPRESSORE TRASCRIZIONALE. Cos'è un repressore trascrizionale? pCro, formando determinati legami, è in grado di reprimere cI. cI invece, è sia un ATTIVATORE che un REPRESSORE: è in grado di reprimere Cro e di attivare la fase lisogenica.77

Durante questa fase è importante l'azione di tre operatori: OR1, OR2, OR3. Quando Cro è sintetizzato si lega a OR1, in questo modo la RNA polimerasi non è in grado di

legarsi alle3sequenze consenso di cI e quindi reprime la sua trascrizione. pCro, ad alteconcentrazioni, si lega a OR e OR , reprimendo se stessa.2 1

Facciamo il punto: come sopracitato, il promotore di cI è debole, quindi quando il fagoinfetta il batterio N e Cro vengono subito attivati, mentre cI no. Questo cosa definisce? Ilfago ha un'azione tendente verso la fase litica. cI, se prodotta, legherà OR e OR , secondo2 1un legame cooperativo dettato dalla concentrazione, in modo tale da reprimere Cro.

Cro è diverso da cI: cI è in grado di compiere due azioni, poiché oltre a reprimere pCrolegando OR e OR , è in grado di legare OR auto attivandosi.2 1 3

LA FASE LITICA

La fase litica si attiva quando pCro si lega a OR e quindi reprime cI. Avviene la3produzione dei geni che seguono Cro tra cui anche Q: Q è simile ad N, è unantiterminatore dei geni tardivi. Dunque è essenziale per produrre proteine del capside.

Vi sono due cose

Tale da aumentare la concentrazione di cI? Semplicemente con la trascrizione verso sinistra viene prodotto un filamento antisenso e complementare a quello trascritto a partire dal gene Cro. In questo modo abbiamo l'appaiamento e la formazione di una doppia elica, che non può essere rilevata dal ribosoma. Quindi cII blocca cro e permette la trascrizione e traduzione di cI.

COSA DETERMINA LA FASE LITICA DA QUELLA LISOGENICA? Il presentarsi o meno di queste due fasi dipende dallo stato del batterio e da cII: Se il batterio è in fase di crescita, sarà ricco di proteasi che possono degradare cII. Dunque, si conviene alla fase litica. Se il batterio non è in crescita, non è ricco di proteasi e quindi non degrada cII. Abbiamo la fase lisogenica.

CHE COSA CONTRIBUISCE AD UNA REGOLAZIONE MOLTO PRECISA? cI si lega a OR1 e OR2 in modo tale da reprimere Cro. Questi due legami non sono indipendenti: sono LEGAMI COOPERATIVI. L'interazione proteina-DNA

è tramite legamideboli: se un monomero forma un tot di legami, essi saranno moltiplicati nel caso di untetramero, quindi si avrà un legame più forte. I monomeri cooperano tra loro per legarsial DNA. Cro, invece, non forma tetrameri ma dimeri e si lega a OR impedendo alla RNA3polimerasi di legarsi al promotore di cI.

Dalla figura di sopra vediamo che cI ha due domini, uno C-terminale che determina latetramerizzazione, e uno N-terminale che determina il legame con il DNA. Cro, invece, haun solo dominio di 66 amminoacidi, quindi può formare al massimo un dimero.

A livello didattico, per la comprensione, si può dire che:

1. Se cI si legasse ad OR spegnerebbe la trascrizione di Cro ma non sarebbe in grado di attivare la sua stessa sintesi.
2. Se cI si legasse solo ad OR reprimerebbe la trascrizione di Cro e sarebbe in grado di attivare se stesso.
3. Legandosi a OR inibirebbe se stesso provocando la trascrizione di Cro.

Struttura di cI

La struttura di cI ha

Un dominio N-terminale e uno C-terminale. Il dominio N-terminale ha due funzioni:

• Legare il DNA.
• Interagire fisicamente con la RNA polimerasi.

Il dominio C-terminale, invece, funge da:

• Dominio di dimerizzazione.
• Dominio di tetramerizzazione.

Il ponte tra i due domini è una consensus per una specifica proteasi.

Se nella cellula si raggiunge una concentrazione sufficiente, ovvero di 4 molecole, si forma un tetramero che si lega ad OR e OR. Quindi la concentrazione di cI è fondamentale per il legame agli operatori 1 e 2.

Se le molecole di cI sono poche, cI si lega con bassa affinità a OR. Se aumenta la concentrazione forma un tetramero e lega sia OR che OR. Successivamente la RNA polimerasi arriva alla sintesi di cI, aumentando la concentrazione. Se la concentrazione aumenta nettamente allora si lega a OR e inibisce la propria sintesi. Questo processo è quello che definisce un INTERRUTTORE BIOLOGICO, in cui la concentrazione definisce attivazione.

O repressione. Quando la cellula si duplica, la concentrazione diminuisce e si riattiva cI. Se fosse un monomero, all'aumentare della concentrazione aumenterebbe la repressione di Cro in modo lineare. In realtà aumenta in modo esponenziale: con una piccola variazione di concentrazione di cI aumenta rapidamente il legame con il DNA. Si dice che sia un interruttore biologico perché piccoli cambiamenti nel gradiente di cI provocano attivazione o repressione, come se stessimo spegnendo o accendendo.

Dai grafici sottostanti vediamo come per n=1, cioè con un monomero, abbiamo una retta.

Con un tetramero si ha una crescita esponenziale immediata.

IMMUNITÀ

Se cI è nella cellula il genoma virale si integra in quello batterico. Si tratta, sostanzialmente, di un passaggio base della fase lisogenica. Se il batterio si duplica, cI si dimezza e si riattiva la trascrizione di cI: aumenta nuovamente la sua concentrazione, dunque si reprime. Inoltre le quantità

elevate di cI impediscono ad un altro virus dientrare nel batterio in questione: cI si legherebbe a OR e OR e bloccherebbe qualsiasi1 2funzione del virus.Sostanzialmente funge da sistema immunitario.Se diamo Uv ad un provirus, può entrare in fase litica. La radiazione UV attiva larisposta di riparazione del DNA. RecA, una proteasi, taglia le proteine quando riconoscesequenze consensus bersaglio. Nel dominio di congiunzione di cI abbiamo proprioquesta consensus. Quindi RecA taglia i due domini e quindi rimangono solo i monomeridi cI. cI si stacca dal DNA virale, dunque si riattivano i promotori di destra e sinistra. Inbase, poi, alla quantità di cII si potrà attivare o meno la fase litica.Cro non forma dei legami cooperativi: lega OR inibendo cI, poi se aumenta la sua3concentrazione si lega a OR e OR inibendo se stesso.2 187DIFFERENZA TRA LA STRUTTURA DI cI E CroPer legare il DNA è necessaria una struttura ad alfa-elica. Ciascun dimero di lega ad unasequenza palindroma,

Nella consensus dell'operatore. Un'alfa-elica entra nel solcomaggiore e il resto della struttura è necessario a mantenere in posizione l'alfa elica. Si tratta di un legame di tipo cooperativo: dipende dal numero di alfa-eliche che riescono ad inserirsi. L'alfa elica 5 di cI contiene glicina, serina e alanina, e reagiscono, solo questi 3 aa, con metà della sequenza palindromica. In Cro è presente la lisina, al posto dell'alanina. Una differenza importante, dunque, è marcata dalla presenza di un solo diverso amminoacido. Molto importante è l'elica 2: in cI sono presenti al