Biologia molecolare

BIOLOGIA MOLECOLARE

Step storici nella scoperta del DNA

1860: Mendel è il primo parlare di geni

● 1868: Miesher isola la nucleina

● 1880: Fleming scopre i cromosomi

● 1884: si scopre che la nucleina è composta da acido desossiribonucleico e proteine

● 1889: Altman definisce un componente della nucleina (acido nucleico)

● 1909: Sutton scopre i cromosomi omologhi

● 1911: Morgan scopre il crossing-over

● 1931: Teoria tetranucleotide di Levene (si crede che le proteine siano più complesse e quindi portatrici

● dell'informazione genetica)

1944: viene scoperto che i geni sono fatti da DNA

● 1953: Watson e Crick presentano la struttura del DNA

●

DNA E RNA

Com’è fatto

Polimero di nucleotidi

● Nucleotide:

● 1) Zuccehro pentoso: ribosio e desossiribosio (non ha l’OH sul 2’)

2) Gruppo fosfato negativo

3) Base azotata: pirimidina (C, T, U) con un anello o purina (A, G) con due anelli eterociclici aromatici

Zucchero + base = nucleoside

● Nucleoside + fosfato = nucleotide o acido (timilico, guanilico, adenilico, uracilico, citosilico)

● Il DNA è composto da due filamenti uniti da legami a idrogeno che scorrono in senso antiparallelo

● L’RNA è formato da un singolo filamento

●

Legami

1) Tra le basi azotate

Legami a idrogeno

● Regola della complementarietà

● Adenina-timina: due legami

● Citosina/uracile-guanina: tre legami

●

2) Fosfodiesterico

Legame covalente ad alta energia

● Tra l’ossidrile (OH) del 3 Carbonio (3’) e il fosfato che fa da ponte con il carbonio 5 (5’) dello zucchero

● successivo

C’è sempre un’estremità con il 3’ libero e una con il fosfato libero

●

Come si uniscono i nucleotidi

Reazione esoergonica e spontanea

● Catalizzata dalla DNA polimerasi

● L’OH del 3’ si lega tramite addizione nucleofila al primo fosfato del deossiribonucleoside-trifosfato

● Si liberano due fosfati: pirofosfati che va incontro a idrolisi e separazione

● Reazione irreversibile

● Si rompe il legame tra fosfati che libera altissima energia

●

Struttura del DNA

Scoperta nel 1953 da Watson e Crick

● Due fili polinucleotidici antiparalleli legati da legami a idrogeno

● Regola della complementarietà che fa sì che il diametro dell'elica sia costante (20 A°)

● Doppia elica

● Scala a pioli con basi azotate interne e zucchero e fosfato esterno

● Ogni 10 basi (1 passo) c’è una rotazione completa dell’elica attorno all’asse

● Ogni passo ci sono un solco maggiore (22 A°) e uno minore (12 A°), zone in cui si vede l'interno dell’elica

● La distanza tra i pioli è di 3,4 A°

●

PROCARIOTI

Replicazione del DNA

Inizia in un’origine di replicazione

● Forma una bolla di replicazione da cui si generano due forche che sintetizzano in entrambe le direzioni

● Enzimi

●

1) Elicasi Forma la bolla rompendo i legami a idrogeno

● Utilizza ATP

● Ai colloca sulla forca di replicazione

●

2) SSB Si legano al DNA a singolo filamento

● Impediscono che il filamento di degradi o che l’elica si riunisca

●

3) Polimerasi

Famiglia di enzimi

● Sintetizzano in direzione 5’ -> 3’

● Hanno bisogno di un innesco a RNA o primer

● Hanno bisogno di uno stampo

● Hanno bisogno di un ossidrile in estremità 3’

● 1) PolA: riparazione, polimerizzazione 5’->3’, esonucleasi 3’->5’ e esonucleasi 5’->3’ (rimozione

dei primers)

2) polB: riparazione: polimerizzazione 5’->3’ e esonucleasi 3’->5’ (proofreading che corregge il

99% degli errori)

3) polC: replicazione: polimerizzazione 5’->3’ e esonucleasi 3’->5’

4) dinB: riparazione SOS

5) umuD2’C: riparazione SOS

DNA polimerasi III

Due che lavorano in contemporaneo

● Composto da un core catalitico: 3 subunità (α,

● ε, θ)

Composto da altre 7 subunità che servono per attaccarsi al DNA e poter scorrere (processività)

● -Pinza scorrevole beta: struttura ad anello che si chiude attorno al DNA in corrispondenza del primer

-Caricatore della pinza: struttura a L che permette alla pinza scorrevole di chiudersi nel punto corretto

Forma di mano

● -Il DNA è poggiato sul palmo

-Le dita aprono la forca sul sito attivo

-Se i nucleotidi sono inseriti correttamente i domini terminale e delle dita si chiudono

-Se i nucleotidi sono inseriti erroneamente i domini si aprono e spostano il filamento sul dominio

esonucleasico

Filamento tardivo e guida

Problema: la DNA polimerasi polimerizza solo in direzione 5’->3’ ma i due filamenti di DNA sono

● antiparalleli e quindi orientati in modo opposto

Sintesi semicontinua

● Il filamento guida viene sintetizzato in maniera continua

● Il filamento ritardato/in ritardo viene sintetizato in maniera discontinua

● Sul filamento tardivo vengono sintetizzati dei frammenti in modo discontinuo: frammenti di Okazaki (nei

● procarioti lunghi 1000 nucleotidi, negli eucarioti 150)

Sintesi di DNA

La primasi sitetizza dei primers a RNA

● -Uno sul filamento guida

-Più di uno su quello tardivo

La primasi associata all'elicasi forma il primosoma e si trova a cavallo del filamento tardivo

● La polimerasi rimuove poi i primer attaccandosi al 3’ del frammento di Okazaki e si muove verso

● l'estremità 5’

All’eliminazione del primer segue la polimerizzazione del DNA

● I frammenti di Okazaki senza primer vengono uniti dalla DNA ligasi che sintetizza il legame fosfodiesterico

● I due filamenti replicano insieme (due polimerasi unite dalla subunità tau)

● Il complesso replicativo è detto replisoma

● Il filamento discontinuo crea delle anse che permette alla DNA polimerasi di rimanere vicina

●

Errore 1 ogni 10^9 nucleotidi

● Il proofreading permette di eliminare gli errori (esonucleasi)

● Viene compreso grazie alla modifica dell’angolo che si crea fra le basi appaiate

● Superavvolgimento

● 1) Negativo: se il grado di avvolgimento è minore

2) Positivo: se il grado di avvolgimento è maggiore

La topoisomerasi scioglie i superavvolgimenti positivi tagliando un filamento e sciogliendolo

●

Velocità 1000-2000 nucleotidi al secondo

● Replicazione del cromosoma in 20-40 minuti

●

REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI

Differenze

1) Origini di replicazione

Ci sono varie origini di replicazione

● Sono state mappate solo nel lievito (semplice) e sono 400 (ARS: sequenze di replicazione autonoma)

● Nell’uomo non si sa quante sono (10/100 mila ca.)

● Non sempre nell’uomo vengono usate le stesse origini di replicazione: forse può iniziare in qualunque

● punto

2) DNA polimerasi

Ci sono più di 15 DNA polimerasi chiamate con le lettere greche

● 4 sono implicate nella replicazione

● Alfa, delta e epsilon replicano il DNA nucleare

● La gamma replica il DNA mitocondriale

●

3) Nucleosomi

Alla replicazione vengono arrotolati e poi riarrotolati subito

● Vengono usati sia istoni precedentemente presenti che di neosintesi

●

4) Replicazione delle porzioni terminali delle molecole lineari

I primers in mezzo alla molecola possono sempre essere tolti e sintetizzati per la presenza di estremità 3’

● I primers terminali vengono eliminati ma la regione poi non può essere colmata per l’assenza di

● un'estremità 3’

D ogni replicazione vengono tolti dei pezzettini di DNA

● Il problema è risolto ponendo all’estremità dei cromosomi del DNA non informativo (non contiene geni

● codificante) = telomeri

Telomeri: tratti terminali dei cromosomi costituiti dalla ripetizione in tandem di TTAGGG (500/5000 volte)

● Sintetizzati dalla telomerasi: enzima che possiede un piccolo RNA all’interno del sito attivo. Utilizza questa

● sequenza per allungare il filamento del DNA che già era più lungo

Permette di sintetizzare delle zone cuscinetto alle estremità dei filamenti che possono essere perse nei cicli

● replicativi perchè sono non codificanti

La telomerasi è un enzima in grado di sintetizzare a partire da uno stampo di RNA: trascrittasi inversa

● Nelle cellule germinali e staminali la telomerasi è sempre attiva: si possono dividere tranquillamente anche

● all’infinito

Nelle cellule che vanno incontro a differenziamento la telomerasi viene disattivata: le cellule ad ogni

● divisione per dei pezzetti di telomero e va incontro ad apoptosi

Mutazioni geniche

Errori in processi fisiologici che coinvolgono il DNA

● -Errori di replicazione: Proofreading e MMR

-Azione di sequenze mobili che si spostano nel genoma

-Errori nella ricombinazione genica

-Mutazioni puntiformi: interessano un solo nucleotide

-Inserzione o delezione

-Estese inserzioni o delezioni

Danni che insorgono indipendentemente dai processi fisiologici

● -Danni spontanei

Danni che si verificano indipendentemente da agenti esterni

● Depurinazione: distacco di basi puriniche

● Deaminazione: perdita di un gruppo amminico di alcune basi (citosina più comune che lo

● trasforma in uracile)

Molto frequenti: nei mammiferi 10000 basi ogni giorno vengono perse

●

-Danni indotti da agenti esterni (mutageni) come radioattività e raggi X

Radiazioni ultraviolette: fusione di due timine insieme a formare un anello di ciclobutano (dimero

● di timina)

Agenti alchilanti: inducono l’aggiunta di gruppo metilici in varie posizioni sulle base azotate

● (alchilazione della guanina a formare l'O-6 metil-guanina che si appaia erroneamente alla timina)

Agenti cancerogeni come il benzopirene: aggiungono grandi gruppi chimici alle basi

● Raggi X e radiazioni ionizzanti: producono una rottura di entrambe i filamenti di DNA

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Meccanismi di riparazione

1) Radiazioni ultraviolette

Meccanismo di escissione nucleotidica (NER)

● Prevede il coinvolgimento di proteine (chiamate a seconda dell’organismo in cui si trovano)

● Nell'uomo si chiamano XP

● Rimuove una parte di un filamento di DNA dove si trova il dimero

● Se mancano queste proteine si ha la Xeroderma pigmentosum

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2) Rottura del doppio filamento (DSB)

Meccanismo dipendente dal crossing over: molto preciso

● Meccanismo non dipendente dalla ricombinazione omologa: più comune ma meno preciso

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TRASCRIZIONE

Processo che partendo da una sequenza nucleotidica del DNA produce una sequenza nucleotidica di DNA

● Quando avviene questo processo su un gene che codifica la proteina l’rna è detto mes