Biologia molecolare

RNA

Nella bolla di trascrizione c’è una regione ibrida RNA-DNA di

9 nucleotidi che vanno pian piano a formare il nuovo

filamento di RNA.

La fase iniziale è quella più complessa.

Quando viene riconosciuto il promotore, l’RNA polimerasi ricopre un pezzo di 55 nucleotidi

e la subunità sigma riconosce le regioni del promotore. Si apre il doppio filamento

(complesso binario aperto) e la parte coperta del DNA è di circa 75 nucleotidi.

Poi c’è il ripiegamento a 90 gradi.

Poi il complesso binario (chiuso o aperto) diventa ternario perché inizia ad esserci la sintesi

dell’RNA. Il pezzo coperto è di circa 35 nucleotidi. La bolla si stabilizza sui 25.

Gli eventi abortivi ci sono perché l’RNA polimerasi cerca di andare avanti ma torna indietro.

Oppure la polimerasi si allunga e poi si accorcia aprendosi e poi chiudendosi.

Questo avviene fino a quando non si stacca dal promotore perché, quando poi procede

questo, non capita più.

Perché possa avvenire la trascrizione,

l’RNA si deve legare al promotore

(sequenza specifica a doppio filamento

caratterizzata dalle sequenze consenso), regione che precede i geni e che si andrà a

sintetizzare. È la regione alla quale si lega l’RNA polimerasi che deve fare la trascrizione o

fattori proteici che favoriscono la trascrizione, la rallentano (inibiscono) o la spingono.

Il promotore poi può essere forte (l’RNA polimerasi si lega fortemente e la trascrizione è

efficiente) o debole (l’RNA polimerasi non si lega bene al promotore e quindi per far

funzionare bene la trascrizione ci vogliono di attivatori. Quando è debole c’è la sequenza - 10

esteso). A rendere il promotore forte o debole è la sua sequenza.

Il TSS indica il punto nel quale inizia la trascrizione. Le varie sequenze

poi non ci sono sempre ma dipendono dai geni. La sequenza -10

(Pribnow box/TATA box) si trova 10 nucleotidi prima del TSS.

Si chiama TATA box (-10) perché contiene molte T e molte A

(6 nucleotidi). Poi, c’è una sequenza a -35 che è una sequenza

consenso trovata confrontando più sequenze di promotori.

Tra queste due sequenze c’è uno spazio ben definito di 17/19

nucleotidi. A monte della sequenza -35 ci può anche essere una regione/elemento UP

oppure ci può essere a -10 un’estensione di quella regione chiamato elemento -10 esteso.

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Nei geni ribosomiali batterici, c’è la sequenza -10, la -35 e la

regione UP. L’RNA polimerasi ha il fattore sigma (con due

domini) in modo che si possa attaccare al promotore.

Il sigma riconosce le due sequenze. Il dominio 2 riconosce la

regione -10, il dominio 4 la regione -35.

L’elemento UP viene riconosciuto dalla subunità α della RNA

polimerasi. Questa subunità ha un dominio carbossiterminale

(CTD) che forma una parte chiamata α-CTD.

Se c’è l’elemento -10 esteso, questo viene riconosciuto dal dominio 3 del fattore sigma.

A volte la sequenza di riconoscimento non è come quella ideale e quindi il promotore viene

definito debole perché la DNA polimerasi non si lega bene al promotore e quindi si aggiunge

la subunità UP in modo che ci sia un altro sito di attacco.

Una proteina interagisce con il DNA. Un’alfa elica (proteina) è un dominio del fattore sigma.

Questa viene a contatto con il DNA nella sequenza della TATA box grazie a degli

amminoacidi sporgenti dall’elica che interagiscono ai nucleotidi T e A.

Il riconoscimento è molto preciso. Quando il fattore sigma non è legato all’RNA, è ripiegato

su sé stesso e i suoi domini sono chiusi, ravvicinati tra di loro e coperti.

La regione N-terminale copre i domini. Quando incontra la RNA polimerasi, la regione si apre

e i domini si allontanano tra di loro creando spazio e trovandosi nella posizione per far

avvenire il legame con il DNA.

I fattori sigma si possono alternare. Il fattore più frequente è il 70 (riconosce circa 1000 geni)

ma ce ne sono tanti altri che riconoscono geni con sequenze e promotori differenti.

Per questo è fondamentale il fattore sigma perché cambiando questo, cambia il bersaglio

del gene da trascrivere. Il fattore è coinvolto nella regolazione dell’espressione genica.

L’RNA polimerasi ha due meccanismi di correzione:

 Proofreading pirofosforolitico: si ha una immediata

correzione perché il nucleotide errato viene riconosciuto

come tale. La polimerasi rallenta e fa inversione.

Il nucleotide viene liberato perché il pirofosfato sintetizzato

è ancora nelle vicinanze. Si ha la reazione inversa.

 Proofreading idrolitico: il nucleotide errato viene

riconosciuto con l’ausilio del fattore GRE e viene eliminato

un tratto di RNA più lungo con all’interno quel nucleotide. Si ha un blocco dell’RNA

polimerasi, un tratto si stacca, il 3’ esce dal punto catalitico e deve essere tagliato.

Il 3’ deve essere ripristinato quindi verrà risintetizzato il 3’.

La sintesi termina con il distacco dell’RNA polimerasi e dell’RNA secondo due modalità:

 Rho-Indipendente: si ha quando si forma una particolare forcina, una forcina di

terminazione. Viene sintetizzato un tratto di RNA che si ripiega formando una forcina

con molte G nello stelo (molto stabile). Il tratto attaccato al DNA ha delle U.

Il legame con la forcina è debole. Quando viene sintetizzato il pezzo, l’attacco con il

DNA è instabile, quindi, c’è il distacco dell’RNA e la sua uscita.

Terminazione della sintesi intrinseca. 58

 Rho-Dipendente: ad un certo punto viene sintetizzata una sequenza

specifica chiamata RUT (contenente molte C) che viene riconosciuta

dalla proteina Rho. RUT si trova a monte del sito di terminazione, si

trova sul trascritto di RNA. La C fa rallentare l’RNA polimerasi e quindi

la proteina Rho si lega a questa sequenza RUT e si comporta come se

fosse un’elicasi ATP-dipendente muovendosi in direzione 5’-3’. Scorre

sull’RNA fino a quando non incontra la polimerasi, promuovendone il

distacco. Va poi a destabilizzare l’ibrido DNA-RNA. La molecola di RNA

così si stacca. Per terminare la trascrizione, Rho utilizza delle

sequenze di terminazione molto simili ai terminatori intrinseci, ma

con una forcina più breve.

La proteina Rho è esamerica e muovendosi consuma ATP, quindi ha un sito (dominio)

ATPasico (C-terminale). L’estremità N-terminale va a legarsi con l’RNA.

Ha anche un dominio per l’RNA visto che le si lega.

Questo avviene quando sono presenti i ribosomi (solo nei procarioti).

L’inizio della trascrizione è regolato dal legame del fattore sigma.

Regolazione positiva e negativa nei procarioti

L’inizio della trascrizione è regolata dal legame del fattore sigma.

Quando c’è la regolazione negativa vuol dire che è presente un meccanismo che va a

bloccare la trascrizione. Questo può avvenire quando c’è un repressore.

Quando la regolazione è positiva, si ha bisogno di dei fattori per attivare la trascrizione,

altrimenti resta bloccata. Per esempio, ci può essere un attivatore che facilita il legame tra

RNA polimerasi e promotore.

I procarioti possono avere più geni strutturali contigui regolati da un unico promotore (geni

policistronici). Questi geni vengono trascritti insieme. Sono anche correlati tra loro.

Negli eucarioti i geni sono organizzati in monoscistroni e quindi ogni gene ha il proprio

promotore. La regolazione è più accurata.

Il modello dell’operone prevede l’esistenza di un repressore prodotto da un gene regolatore

(R) che si lega ad un sito operatore (O) bloccando l’espressione dei geni strutturali A e B,

posti dopo la sequenza operatore.

Questo repressore potrebbe essere represso a sua volta da altri fattori.

Il repressore si lega anche a un induttore (metabolita) che fa abbassare l’affinità del

repressore per l’operatore e permette l’espressione.

GENE LAC Z: codifica per le β-galattosidasi (tetramero, 500 kD).

GENE LAC Y: codifica per il lattosio permeasi (30 kD). Questo conduce i β-galattosidi nella cellula.

legata alla membrana.

GENE LAC A: codifica per tiogalattosio transacetilasi. Libera la cellula dai tiogalattosidi tossici.

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Operone lattosio

L’operone lattosio è un operone inducibile a controllo negativo

(regolazione specifica).

(A) In assenza di lattosio l’operone è represso poiché una

molecola di repressore è legata al sito operatore e impedisce

alla RNA polimerasi di legarsi al promotore e iniziare la

trascrizione dei geni a valle.

Il repressore è sempre un tetramero o un dimero perché

altrimenti non riuscirebbe a svolgere la sua funzione.

(B) L’allolattosio (derivato del lattosio) o l’IPTG (induttore) si

lega al repressore formando un complesso che non è più in grado di legarsi all’operatore. In

questo caso, la polimerasi troverà il promotore libero e potrà trascrivere i geni strutturali.

Il promotore non ha sequenze identiche a quelle consenso ma ci sono delle piccole

differenze che rendono il promotore debole. La sintesi avviene in modo debole, quindi c’è

bisogno di un attivatore.

La regione dell’operatore è stata studiata per capire come fa ad attaccarsi il repressore.

Il repressore è stato reso radioattivo ed è stato messo insieme ad altri pezzi di DNA per

vedere dove si legavano. Si legano all’operatore e da qui è stato isolato e sequenziato.

Ci sono 2 regioni simmetriche. L’attivatore si lega alla regione CAP solo se c’è del CMP,

libero solo se c’è pochissimo glucosio o non c’è affatto. → Esperimento di Gilbert e

Muller-Hill

Regolazione dell’operone Lac da parte di glucosio e lattosio:

Quando è presente solo il glucosio e manca il lattosio, i geni

sono spenti perché il repressore blocca la trascrizione

(trascrizione repressa).

Se manca sia il glucosio che il lattosio, la trascrizione è repressa

ma l’attivatore c’è.

Se c’è sia glucosio che lattosio, quest’ultimo va a bloccare il

repressore facendo procedere la trascrizione in modo basale

perché c’è anche il glucosio. Però produce gli enzimi che

scindono il lattosio. Basso livello di trascrizione, legame

dell’RNA polimerasi debole. Come induttore c’è l’allolattosio.

Quando il glucosio diminuisce fino a non essercene più si ha la

trascrizione attivata.

Il glucosio provoca il legame di un’altra proteina regolatrice che ne stimola la t