Biologia molecolare II

RNA.

Ricordiamo che i ribozimi self-cleaving erano quei ribozimi che da un punto di

vista chimico sfruttavano il gruppo OH presente naturalmente, il gruppo OH

reattivo che l’RNA normalmente ha in posizione 2’.

Quindi abbiamo il gruppo OH, la proteina sfrutta questa istidina 12 non

protonata come catalizzatore basico, quindi sfrutta la proprietà basica per

andare a strappare un protone in corrispondenza di questo gruppo OH.

Lo strappo di questo protone rende questo gruppo un più forte nucleofilo,

perché qui diventa un O , nel senso che il gruppo OH funge da nucleofilo perché

-

ha il doppietto di elettroni che sono in grado di attaccare il legame

fosfodiesterico, ma strappando questo protone, questo gruppo diventa un O ,

-

quindi ha una carica negativa netta e questa carica negativa netta ha una più

forte proprietà nucleofila.

Quindi è un catalizzatore basico perché questo amminoacido favorisce la

formazione di un più forte nucleofilo e quindi favorisce l’attacco di questo

legame fosfodiesterico.

Questo legame fosfodiesterico che viene rotto portava alla fuoriuscita di questo

gruppo uscente, anche qui la proteina, siccome funziona come catalizzatore, avrà

un’istidina 119 che è protonata, e questa istidina funziona come catalizzatore

acido, cioè fornisce l’idrogeno a questo gruppo uscente e fa in modo che si

favorisce l’uscita dell’OH .

’

Quindi, i due prodotti che si formano sono quelli che abbiamo già visto, il 2’-3’-

fosfato ciclico e il 5’-OH libero. 363

La proteina utilizza questi due amminoacidi, uno come catalizzatore basico e

uno come catalizzatore acido, per andare a favorire la rottura di questo legame

fosfodiesterico.

Poi, in realtà, c’è anche un altro residuo di lisina, che è la lisina 41, che è un



residuo carico positivamente perché ha la carica positiva sul gruppo della

catena laterale.

Questa lisina 41, con dei legami idrogeni diretti verso il fosfato che è coinvolto

nel legame fosfodiesterico, stabilizza molto lo stato di transizione.

Quindi ci sono questi tre residui amminoacidici che sono importanti nel

funzionamento di questa proteina e che gli servono per catalizzare in maniera

efficiente la rottura del legame fosfodiesterico.

Sorprendentemente, i ribozimi self-cleaving fanno questa reazione utilizzando

dei nucleotidi specifici, che funzioneranno da catalizzatore acido, catalizzatore

basico e stabilizzatore dello stato di transizione.

Ci sono appunto dei nucleotidi che, tramite queste conformazioni

tridimensionali che abbiamo descritto, sono messi in delle corrette posizioni in

maniera tale che abbracciano il legame fosfodiesterico che deve essere tagliato e

riescono ad operare questa catalisi da soli, senza l’intervento di una proteina

esterna.

Quindi tutti i nucleotidi che abbiamo visto nelle reazioni dei ribozimi fungono da

catalizzatore acido, catalizzatore basico e stabilizzatore dello stato di

transizione, per esempio nei ribozimi hairpin abbiamo la guanina 8 e l’adenina

38 funzionano catalizzatore basico e catalizzatore basico e l’adenina 9 funziona

da stabilizzatore dello stato di transizione.

A livello dei ribozimi self-cleaving questi sono i meccanismi chimici, come

abbiamo visto per gli introni di gruppo I.

Invece, dal punto di vista biologico gli introni di gruppo I hanno questa capacità

di funzionare come polinucleotidil-transferasi oppure hanno anche la capacità di

andare a catalizzare questa reazione di congiunzione fra molecole di RNA

differenti.

Invece i ribozimi self-cleaving, da un punto di vista biologico, quelli hairpin e a

testa di martello servono per operare i meccanismi di duplicazione di alcune

entità che sono i viroidi e i virusoidi.

I viroidi sono delle entità “particolari” perché sono delle entià infettanti che non

hanno il capside, la struttura proteica che poi è tipica dei virus, quindi sono

semplicemente delle molecole di RNA infettanti e molto spesso infettano le

piante, che non hanno la struttura che siamo abituati a pensare per il virus,

364

quindi è semplicemente la molecola di RNA che poi funziona da molecola

infettante e queste molecole di RNA di questi viroidi si duplica attraverso un

meccanismo particolare di duplicazione del DNA, che è il cosiddetto

meccanismo del circolo rotante. Questi ribozimi self-cleaving a

testa di martello e a forcina

servono effettivamente per i

processi di duplicazione di

virusoidi o viroidi e che

spiegano il meccanismo del

circolo rotante, quindi ci sono

questi meccanismi di

duplicazione del DNA un po’

particolari che hanno bisogno poi di questi ribozimi, ma non entriamo nel

dettaglio.

Portiamo, invece, un esempio che poi viene da un articolo scientifico, quindi

sono le ultime cose che stanno venendo fuori, che invece questi ribozimi e

specialmente i ribozimi a testa di martello, in questo caso, si sta vedendo che

sono importanti per il controllo dell’espressione genica.

Questo, per esempio, è un caso di intervento di un ribozima a testa di martello

nel controllo dell’espressione genica di un gene eucariotico, quindi è importante

vedere che queste strutture che possono sembrarci un po’ strane o comunque

sia insignificanti da un punto di vista funzionale invece sta emergendo che

hanno dei ruoli ben precisi. Questo, per curiosità, è quello che

succede a livello di questo gene,

che è un gene di mammifero che

codifica per le lectine di tipo C,

che sono delle proteine che

intervengono nei meccanismi di

aggregazione piastrinica o

comunque nel controllo e

differenziamento delle piastrine.

Quindi vediamo la porzione

365

codificante di questo gene e la riconosciamo perché c’è il segnale di stop, poi

nella porzione non codificante che precede la coda di poliA, che sappiamo essere

la cosiddetta regione 3’-UTR, quindi nella regione non codificante che precede la

coda di poliA, si è notata la presenza di un ribozima a testa di martello, che

vediamo nella diapositiva, prima a forma lineare molto semplice e poi come si

riarrangia effettivamente a livello della struttura secondaria.

La presenza di questo ribozima a testa di martello, quindi di un ribozima che è

capace di fare una reazione di self-cleaving, si è visto che serve per regolare

l’espressione di questo gene a livello dell’RNA, perché in particolari condizioni

questo ribozima si attiva, attivandosi inizia ad effettuare questa reazione di

auto-taglio e questa reazione porta all’allontanamento della coda di poliA,

perché è posizionata a livello di questa regione 3’-UTR, quindi tagliandosi qui

viene allontanata la coda di poliA.

Quindi, l’allontanamento della coda di poliA poi inficia sul corretto trasporto

dell’RNA messaggero dal nucleo verso il citosol e fondamentalmente la corretta

traduzione dell’RNA messaggero.

Quindi, la perdita della coda di poliA poi effettivamente è un meccanismo che

regola l’espressione di questo gene, ovviamente è un meccanismo che viene

acceso in particolari condizioni, quindi è un meccanismo di regolazione e non un

meccanismo costitutivo, altrimenti questo gene non verrebbe mai espresso, non

sono ancora molto chiare le condizioni per le quali poi questo meccanismo di

regolazione di attiva, però è una delle prime evidenze sperimentali della

presenza di questi ribozimi all’interno di RNA messaggeri, quindi di sequenze

che poi portano alla produzione di particolari proteine e quindi sono

effettivamente delle molecole che possono avere il ruolo di regolare

l’espressione genica.

Infine, vediamo che questa funzione di regolatore dell’espressione genica è ben

conosciuta, invece in questo caso, per un altro ribozima che è il ribozima glmS,

che è una molecola che fa un po’ da ponte fra questi ribozimi (glmS è un gene che

codifica la glucosammina-6-fosfato sintetasi) e un’altra classe di RNA

regolatori che vedremo, che sono i riboswitch.

Il glmS è un enzima che converte il fruttosio-6-fosfato e glutammina in

glutammato e glucosammina-6-fosfato, quindi è un enzima che catalizza questa

reazione.

La glucosammina-6-fosfato è una molecola che serve per la biosintesi delle

parete cellulari batteriche. 366

A monte della sequenza codificante ha un ribozima, cioè un qualcosa che è

capace di auto-tagliarsi.

La differenza con quello che abbiamo visto prima è che qui stiamo a monte della

sequenza codificante, cioè nella regione 5’-UTR, mentre nel caso di prima stava a

valle, cioè nella regione 3’-UTR.

Quand’è che questo ribozima si attiva ed opera questa reazione di taglio e questa

reazione di taglio è responsabile poi di una regolazione dell’espressione?

Questa attivazione è dovuta ad un meccanismo di feedback, cioè quando mano a

mano nella cellula si inizia ad accumulare la glucosammina-6-fosfato, quindi il

prodotto di questa reazione, la glucosammina-6-fosfato va a legarsi a questo

ribozima, cioè questo metabolita è in grado di legarsi a questo ribozima e il

legame di questo metabolita porta all’attivazione del ribozima che quindi va ad

operare questo meccanismo di auto-cleaving.

Questo meccanismo di auto-cleaving porta alla liberazione di un’estremità OH

libera, perché è sempre un taglio di tipo endonucleotidico e l’estremità OH libera

viene riconosciuta da una RNasi specifica cellulare, l’intervento di questa

esonucleasi porta piano piano alla degradazione dell’RNA messaggero.

Quindi effettivamente si ha uno spegnimento della produzione dell’RNA

messaggero, che codifica per la glucosammina-6-fosfato sintetasi.

Quindi è un meccanismo di feedback negativo, perché mano a mano che si forma

il prodotto di questa reazione, il prodotto di questa reazione va ad inibire la

produzione dell’enzima stesso, perché a quel punto ce ne è tanta di

glucosammina-6-fosfato e quindi non c’è più bisogno di produrre l’enzima

necessario alla sua produzione.

Quindi man mano che si accumula il prodotto, questo funziona come effettore

per andare a regolare l’espressione dell’enzima che è necessario alla sua stessa

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produzione e lo fa andando ad attivare un ribozima, quindi una parte dell’RNA

che sta a monte della sequenza codificante di questo RNA messaggero, però

l’attivazione di questo ribozima porta ad un auto-taglio dell’RNA, che viene poi

riconosciuto dalle esonucleasi e quindi questo auto-taglio poi scatena il

“mangiucchiamen