Biologia molecolare II

Segnalazione Tyr-Chinasica

Vedremo tutta la parte della segnalazione che porta poi all’archiviazione trascrizionale dei geni e ci sono diverse vie di segnalazione che coinvolgono le specifiche proteine recettoriali, la maggior parte delle quali vedremo, partendo dai recettori tirosin-chinasi che sono poi quelli che conosciamo di più. Questi recettori sono molto importanti per la regolazione di processi poi legati al differenziamento e alla proliferazione cellulare, perché anche se visto che molte proteine intervengono nella trasmissione del segnale a partire da questi recettori, se in qualche modo regolate diventano responsabili per lo sviluppo dei tumori e di diverse neoplasie e quindi svolgono sicuramente un ruolo centrale nei processi biologici.

I recettori tirosin-chinasi, come dice il nome, sono recettori che hanno di per sé un’attività catalitica, in questo caso lo stesso termine ci aiuta a capire che tipo di attività viene catalizzata, quindi il termine “chinasi” è un termine che indica un enzima in grado di fosforilare una determinata proteina; tirosin-chinasi vuol dire che sono degli enzimi in grado di fosforilare dei residui di tirosina.

Meccanismo di attivazione

Vedremo nel dettaglio il meccanismo di attivazione. Questi recettori, rispetto agli altri che vedremo durante il corso, sono dei recettori che hanno un meccanismo di trasmissione del segnale più complicato a livello citosolico rispetto ad altre vie di segnalazione e si può mettere a confronto (vedi slide), il fatto di avere queste freccette multiple che ci sono a livello del citosol ci fa capire che il network che viene richiamato da questi recettori che servono per trasmettere il segnale, è abbastanza complicato e anche variegato in un certo senso, però poi il punto comune di tutte le vie di trasmissione del segnale sicuramente è l’attivazione di una proteina chiave, in grado di entrare nel nucleo e andare attivamente a promuovere la trascrizione genica.

Quindi, vedremo, quali sono le proteine attivate dai recettori tirosin-chinasi, quale è questa proteina in grado di entrare nel nucleo e quali sono i geni che possono essere accesi durante queste vie di segnalazione.

Recettori per le citochine

Subito dopo aver fatto i recettori tirosin-chinasi, andremo a vedere i recettori per le citochine, anche loro dei recettori tirosin-chinasi, quindi associati all’attività tirosin-chinasica. Questi recettori sono molto importanti per esempio per il differenziamento delle cellule ematopoietiche, come il meccanismo di segnalazione sono abbastanza simili ai recettori tirosin-chinasi, sono però molto più semplici nella trasmissione del segnale, questo perché un recettore una volta attivato è in grado di, a sua volta, attivare una singola proteina, quindi non ha bisogno di una trasmissione molto complessa del segnale, questa proteina che viene attivata si chiama proteina STAT, che sono dei veri e propri fattori di trascrizione che, in assenza di segnale, si ritrovano localizzati a livello del citosol ed invece in seguito ad attivazione e anche fosforilazione vanno direttamente nel nucleo e vanno a funzionare come fattori di trascrizione e quindi promuovono la trascrizione stessa.

Si definiscono recettori associati con attività tirosin-chinasica perché una differenza che c’è tra i recettori tirosin-chinasi veri e propri e questi tipi di recettori è, non soltanto questa differenza nella trasmissione del segnale, ma anche il fatto che il recettore tirosin-chinasi per eccellenza è proprio una proteina transmembrana che ha attività tirosin-chinasica intrinseca, quindi è una proteina enzimatica a tutti gli effetti; i recettori per le citochine sono praticamente delle proteine trasmembrana che non hanno attività tirosin-chinasica, ma si ritrovano, come vedremo, associati in maniera irreversibile e stabile con delle tirosin-chinasi citoplasmatiche, che come vedremo, sono chiamate proteine JAK, che sono delle proteine in grado di fosforilare dei residui di tirosina che si trovano proprio stabilmente associati a quello che è il dominio citosolico di questi recettori.

Recettori TGF-β

Dopo questi recettori, vedremo i recettori del TGF-β (fattore di crescita trasformante-beta), che sono dei recettori che invece, sempre con attività chinasica, ma questa volta però serin/treonin-chinasi, (come sappiamo gli amminoacidi per eccellenza che vengono fosforilati sono tirosina, serina e treonina), quindi i recettori per le citochine e i recettori tirosin-chinasi veri e propri sono recettori ad attività tirosin-chinasica, mentre i recettori per il TGF-β sono recettori Ser/Thr-chinasi, che andranno anche loro ad attivare una serie di proteine nel citosol, come le proteine Smads, fosforilando però questa volta in residui di serina e treonina.

Anche qui il percorso di segnalazione è molto simile; queste proteine Smad, anch’esse come le STAT, sono dei fattori di trascrizione veri e propri che una volta fosforilati entrano nel nucleo e vanno ad attivare una serie di geni specifici. In realtà questa via di segnalazione è ancora più semplificata rispetto a quella dei recettori per le citochine, proprio perché il recettore una volta attivato va a fosforilare le Smad e entrano nel nucleo.

Recettori legati alle proteine G

Riprenderemo in maniera molto veloce i recettori legati alle proteine G, sono recettori che comunque servono per l’accensione dell’AMPciclico e l’attivazione della PKA, questa via di segnalazione regola fondamentalmente la demolizione e l’utilizzo del glucosio, quindi meccanismi a breve termine, legati al metabolismo cellulare. Noi riprenderemo molto velocemente l’attivazione dell’adenilato ciclasi, riduzione dell’AMPciclico, attivazione della PKA, PKA attivata che si dissocia sulle subunità catalitiche, che nel nostro caso sono in grado di entrare nel nucleo e vanno ad attivare una proteina specifica, che è il fattore di trascrizione CREB, è un’altra via di segnalazione che ci porta alla regolazione dell’espressione genica, a livello di completezza la stessa PKA regola anche la trascrizione genica e non solo, quindi il metabolismo cellulare.

Recettori Wntless

Poi ci sono altri tipi di recettori, in particolare i recettori Wntless, che rispondono a questa molecola segnalante e anche qui ci sono delle vie di segnalazione che possibile troviamo anche nei corsi successivi perché regolano la morfogenesi e altri tipi di processi cellulari; già a livello strutturale vediamo la divisione sulla base del fatto che la prima categoria dei recettori di cui abbiamo parlato include tutta una serie di proteine monopasso, quindi vedremo che funzionano tutti in maniera molto analoga andando poi a produrre, alla fine dell’attivazione, una conformazione mimetica, quindi da un ovulo si passa a un dimero, comunque si tratta di proteine monopasso.

Una cosa importante è quello che avviene a livello dell’attivazione delle proteine intermedie di questa cascata di segnalazione; le altre che abbiamo visto finora sono attivazioni per fosforilazioni successive da proteina a proteina fino a che si arriva ad una proteina finale. La trasmissione del segnale in questa via avviene attraverso un meccanismo leggermente diverso, vedremo che l’attivazione comporta la disgregazione di un complesso multiproteico a livello del citosol, disgregazione che porta alla liberazione della proteina chiave, come avviene sempre, che in questo caso è la beta-catenina. Quindi c’è un meccanismo un po’ diverso dalla classica trasmissione del segnale.

Fattore di trascrizione NF-kB

Un’altra via che vedremo è una via legata comunque al fattore di trascrizione NF-kB, questa è una trascrizione che durante il corso nomineremo spesso anche per quanto riguarda il virus HIV, perché il gene NF-kB regola molti geni all’interno della cellula, soltanto a livello della risposta immunitaria sono più di 150, quindi è un fattore di trascrizione che ritroveremo in tanti percorsi. Vedremo quindi come viene attivato questo fattore di trascrizione, contenuto in una forma inattiva nel citosol, tanto che non c’è segnalazione, dopo di che viene rimossa una proteina inibitrice e il fattore di trascrizione fatica ad entrare nel nucleo.

Capita molto spesso che gli stessi fattori di trascrizione combinati con altri fattori di trascrizione poi portano ad effetti cellulari completamente diversi, quindi a cambiare notevolmente quello che è il quadro di espressione genica, questo succede anche perché appunto lo stesso stimolo extracellulare può portare ad attivare all’interno della cellula percorsi di segnalazione completamente differenti, quindi da uno stesso stimolo extracellulare si possono avere quadri di espressione genica completamente diversi che possono diventare anche tessuto specifici, ma può accadere anche il contrario, anche all’interno del citosol possono svilupparsi dei fenomeni di interferenza tra le varie segnalazioni, perché magari appunto le proteine chiave all’interno del citosol possono magari rispondere a stimoli extracellulari differenti e soprattutto queste intersecazioni tra le vie di segnalazione avvengono tra quelle che sono i recettori tirosin-chinasi o recettori per le citochine e i recettori accoppiati alle proteine G, questo perché esse sono, come detto prima, le vie di segnalazione un po’ più complicate che possono richiamare molte proteine differenti e queste proteine differenti possono rispondere a segnali differenti e andare ad interferire l’una con l’altra, mentre le altre segnalazioni che sono molto più dirette in realtà hanno meno possibilità di punti di interferenza, per questo poi alla fine il quadro di espressione viene data da una combinazione di diversi fattori di trascrizione.

Recettori tirosin-chinasi

La slide ci dà un quadro completo di quelli che sono i recettori tirosin-chinasi per eccellenza e ci illustra le caratteristiche strutturali di tutti questi recettori, quindi tutti questi moduli visualizzati qui stanno ad indicare precisi domini proteici, quindi strutture secondarie della proteina importanti per il funzionamento dei recettori stessi.

Innanzitutto il concetto importante che abbiamo già detto, è che i recettori tirosin-chinasi sono tutte proteine monopasso in membrana, quindi tutte queste proteine attraversano il doppio strato fosfolipidico tramite l’α-elica singola, sono proteine monomeriche, quindi tutte queste proteine sono costituite da una singola catena polipeptidica ad eccezione del recettore per l’insulina che è l’unico recettore tirosin-chinasi che ha una struttura tetramerica, in realtà il recettore per l’insulina non ha bisogno di dimerizzare per essere attivo, proprio perché è costituita da un tetramero del tipo legati da legame covalente di α₂β₂, ponti di solfuro, quindi anche la struttura è ben stabilizzata, invece tutti gli altri recettori vedremo che hanno bisogno di questo meccanismo di dimerizzazione per essere attivi, per poter funzionare e questa dimerizzazione deve essere poi in qualche modo mantenuta stabile all’interno della membrana, perché poi il percorso di dimerizzazione viene facilitato dalla fluidità stessa della membrana, due catene polipeptidiche dello stesso tipo del recettore possono avvicinarsi formando un dimero sfruttando la fluidità della membrana plasmatica, ma in realtà l’avvicinamento di questi due recettori deve essere mantenuto in maniera stabile nei tempi per lo meno necessari ad attivare il percorso di segnalazione, vedremo che ci sono diversi meccanismi di dimerizzazione e diverse strategie per mantenere il dimero in forma stabile.

Queste essendo delle proteine dei recettori di membrana il livello funzionale in risposta a una molecola extracellulare, e quindi contenuta nella matrice extracellulare, può avviare il percorso di segnalazione all’interno della cellula che riceve il segnale.

Ovviamente anche a livello di struttura vediamo che cosa si può distinguere:

• Quella che può essere definita la porzione extracellulare del recettore
• La catena transmembrana
• La porzione citosolica

La porzione extracellulare è quella che serve al legame con la molecola segnalante, quindi con il ligando che nella maggior parte dei casi è quasi sempre un fattore di crescita, proprio perché tutti i recettori sono molto importanti nel regolare il processo di differenziamento e proliferazione cellulare, se vediamo le strutture di queste porzioni extracellulari sono molto diversificate da recettore a recettore rispetto a quella che è la rappresentazione grafica della porzione intracellulare, vediamo che confrontando un recettore con un altro la maggiore variabilità delle strutture sta nella porzione extracellulare rispetto a quella intracellulare, questo è abbastanza intuitivo, perché essendo tutti dei recettori tirosin-chinasi, quindi la cui funzione è quella di andare a fosforilare un residuo di tirosina, ovviamente questa funzione catalitica è svolta dalla porzione intracellulare, e avendo tutti questo tipo di funzione, la struttura che opera questo meccanismo è data da recettore a recettore, questo succede sempre in natura, diciamo che quando una funzione viene mantenuta tale e viene conservata viene conservata anche la struttura che poi sta dietro il meccanismo di questa funzione.

Vediamo che il dominio catalitico (l’asticella blu) è identico in tutti i recettori, l’unica cosa che a volte succede è questo sdoppiamento del dominio catalitico per cui alcuni recettori hanno il dominio catalitico sdoppiato in due porzioni poi però a livello di struttura tridimensionale, il discorso non cambia molto perché poi vedremo in dettaglio cosa succede nel dominio catalitico.

Un’altra piccola differenza che possiamo notare confrontando la porzione citosolica dei vari recettori è la lunghezza di questo braccio che c’è al di sotto del dominio catalitico che in alcuni recettori è più lungo e in altri è più corto e questa viene chiamata coda C-terminale del recettore, mentre l’N-terminale è presente in corrispondenza del ligando, quindi questa coda C-terminale può variare in lunghezza da recettore a recettore, poi in realtà questa è una porzione importante del recettore perché fornisce i punti di attacco per le proteine segnalanti a valle, quindi anche la lunghezza si riflette in una disponibilità maggiore di residui magari fosforilati che vengono riconosciuti dalle proteine-bersaglio a valle.

La porzione extracellulare è abbastanza variegata, questo, per il discorso che abbiamo fatto per la variazione citosolica, è comprensibile perché i recettori devono rispondere in maniera specifica, ognuno ad uno specifico ligando che a differenza di un recettore a livello della porzione extracellulare deve essere abbastanza elevata proprio perché devono essere specifici per un determinato ligando in maniera tale che viene accesa la via di segnalazione specifica.

Abbiamo tutta una serie di strutture, sono importanti i processi di autoregolazione di questi recettori e abbiamo i cosiddetti domini immunoglobulino simili (i riccietti gialli) sono dei domini che prendono il nome dal fatto che sono domini presenti nelle immunoglobuline e vedremo che sono domini che in alcuni recettori servono, non tanto per legare il ligando, ma forniscono dei meccanismi di autoregolazione dal recettore stesso, quindi maggiormente vedremo meccanismi autoinibitori, che regolano in maniera negativa il funzionamento del recettore stesso. Poi molti recettori hanno un’alta concentrazione di cisteine, di porzioni glicosilate, però non le vedremo in dettaglio.

Questa slide ci mostra i meccanismi di attivazione di questi recettori, a grandi linee abbiamo detto che funziona così, cioè un recettore tirosin-chinasico è monomerico e per diventare attivo deve per forza dimerizzare, quindi due catene polipeptidiche della stessa famiglia, dello stesso recettore, si accoppiano tra di loro, si muovono sulla membrana e vanno a formare un dimero in maniera tale che ciascuna catena polipeptidica del recettore si trovi di fronte ad un ‘altra catena polipeptidica identica della stessa famiglia dello stesso recettore.

La porzione extracellulare è quella del ligando, quindi la prima operazione è il riconoscimento della porzione extracellulare con la molecola segnalante, riconoscimento che provoca un cambiamento conformazionale a livello della struttura extracellulare, e il ligando una volta legato alla porzione extracellulare provocherà un cambiamento conformazionale a livello del dominio extracellulare, cambiamento conformazionale che viene in qualche modo risentito dalla porzione intracellulare, che è quella vera e propria ad attività catalitica, il recettore tirosin-chinasico nella porzione catalitica, il cosiddetto dominio catalitico, c’è a sua volta una struttura chiamata loop di attivazione o ansa di attivazione che ha una sorta di tasca a livello del dominio catalitico che è molto importante nel meccanismo di attivazione, perché il recettore tirosin-chinasico per risultare attivo deve andare incontro ad un processo di autofosforilazione, quindi c’è un primo meccanismo di autofosforilazione che avviene proprio a livello di questo loop di attivazione e che è un meccanismo di autofosforilazione in cui un dominio catalitico di una catena polipeptidica va a fosforilare nel dominio catalitico della catena polipeptidica del recettore che si trova di fronte, sempre a livello di questo loop di attivazione.