Biologia Molecolare ed applicata - Appunti

BIOMOLECOLE: GLI ACIDI NUCLEICI

Dipendono dalle proteine per la loro organizzazione e sintesi (DNA/RNA polimerasi)
Si trovano a tutte le cellule (eccetto alcune eccezioni, es. globuli rossi)
Formati da nucleotidi che si legano tra loro in maniera lineare a formare catene nucleotidiche.
Funzione: molecola responsabile della ereditarietà dei caratteri, evoluzione biologica.
Oggi usati anche per la terapia genica.

NELLA CELLULA EUCARIOTICA:
1. Nucleo: DNA, mRNA
2. Mitocondrio: mtDNA
3. Ribosoma: rRNA
4. Citoplasma: mRNA, tRNA

NUCLEOTIDI

Sono le unità elementari degli acidi nucleici.
Costituiti da:
1. Base azotata
2. Una molecola di zucchero (a 5 atomi di carbonio)
3. Un gruppo fosfato
Al gruppo fosfato dei nucleotidi si possono aggiungere anche altri gruppi fosfati (max 3)
Il nome di questi nucleotidi è costituito da 3 lettere:
1. La prima: Nucleoside (U per uridina, A per Adenosina, C per citidina, G per guanosina, T per timidina)
2. La seconda: Numero di gruppi fosfato

<M>3. La terza: fosfato DNADNA: Acido deossiribonucleico<br>Materiale genetico delle cellule: ha le informazioni per la biosintesi di proteine e per la<br>regolazione della gran parte degli eventi cellulari.<br>Negli eucarioti<br>Localizzazione: nucleo e in quantità minori mitocondri.<br>1. Associato a proteine (istoni).<br>2. Organizzato in cromosomi.<br>3.Nei procarioti<br>1. Non associato a proteine (istoni).<br>2. Molecola ciclica.<br>Watson e Crick e il modello della doppia elica<br>A seconda del ripiegamento dei filamenti il DNA può assumere 3 forme diverse:<br>DNA-A<br>DNA-B<br>DNA-Z<br>Ogni filamento è il <<negativo>> (stampo molecolare complementare). Il rapporto A/T e<br>G/C deve essere sempre 1. RNA MESSAGGERO<br>DNA ->RNA->PROTEINA RNA TRANSFER (tRNA)<br>Sono gli RNA più piccoli (75-90 nucleotidi).<br>Legano i singoli amminoacidi, li trasportano al complesso ribosoma-mRNA,<br>permettono il legame nella catena

polipeptidica in costruzione seguendo l'ordine dell'mRNA. Esiste almeno uno specifico tRNA per ciascuno dei 20 amminoacidi.

Struttura generale <<a trifoglio>>:

1. Estremità una molecola di acido fosforico.
2. Estremità sequenza -CCA3.
3. Ansa -DHU dell'anticodone.
4. Ansa (amminoacido specifica) 4TψC.
5. Ansa.
6. <<Braccio extra>> variabile.

Funge da <<traduttore chimico>> per la conversione del messaggio da acido nucleico ad amminoacido.

MATURAZIONE tRNA:

• Eliminazione degli spaziatori intergenici tra i diversi tRNA.
• Estremità 5' 3'-terminale.
• Eliminazione di sequenze nucleotidiche alle e.
• Eliminazione dell'introne nella porzione dell'anticodone (solo in alcune specie).
• Modificazione di basi per l'aggiunta di basi rare: es. ipoxantina, pseudouracile, timina.
• 3' 5'-CCA-3' dell'enzima.
• Aggiunta in terminale della sequenza da parte tRNA nucleotidi transferasi.

FORMAZIONE

DEL CAPPUCCIO(5’)

Aggiunta di guanosina monofosfato al primo nucleotide trifosfatofosfato e <<capovolgimento>> della metilguanina con formazione di legame 5’-5’

Perdita di uninizia con un estremo 3’OH.

mRNA

Funzioni:

• Protezione della molecola di mRNA.
• dell’inizio
• Facilitazione della traduzione

Processo co-trascrizionale:

Successivamente il cap viene metilato su azoto in posizione 7 (7mGppp), mentre i primi due

dell’mRNA in posizione 2’ (2’O-metilazione).

nucleotidi vengono metilati sul carbonio del ribosio

SPLICING

Taglio del trascritto primario (pre-mRNA o hnRNA, RNA eterogeneo nucleare) a livello degli

introni e ricucitura a livello degli esoni.

Catalizzato da un complesso RNA-proteina (spliceosoma,U) composto da:

• snRNA e Piccole ribonucleoproteine nucleari (snRNP) riconoscono GU/AG.

Endonucleasi

Può formare trascritti semplici (un solo mRNA maturo) o trascritti complessi (più mRNA maturi).

[SPLICING ALTERNATIVO] CODICE

GENETICO1 NUCLEOTIDE= 1 AMMINOACIDO (NO)22 NUCLEOTIDI= 1 AMMINOACIDO ( 4 =16 AMMINOCIDI, NO)33 NUCLEOTIDI = 1AMMINOACIDO (4 =64 AMMINOACIDI, Sì)Tripletta: CODONE64 codoni: 20 amminoacidi + segnali di terminazione. Nei mitocondri il codice genetico è differente.Gli amminoacidi che sono sinonimi sono importanti per la costruzione della proteina.E' GENE: COSAGENE: sequenza polinucleotidica che modifica una particolare sequenza amminoacidica (proteina) o rRNA e tRNA.Formato da:Porzioni codificantiPorzioni non codificanti, ma fondamentali nella regolazione del processo di trascrizione.A differenza dei procarioti, negli eucarioti i geni sono discontinui: 5INTRONI: trascritti ma non tradotti, più bpESONI: trascritti e tradotti in mRNA funzionale, meno bpRNA POLIMERASI II: copia introni ed esoni.hnmRNAKep pulsante che permette il passaggio del mRNA dal nucleo al citoplasma• Coda poli(A): terminale della sintesi del mRNAo rRNA e tRNA quindi è una unità

trascrizionale.

Polimerasi I: rRNA

II: mRNA

III: tRNA

Il sito promotore fa il differenziamento della sintesi delle molecole RNA

Sequenza uscente complementare allo stampo con sostituzione di T con U.

SSP: DNA come singolo filamento.

L'inizio del RNA polimerasi ha bisogno di riconoscere gene.

Come il repressore viene delimitato?

La proteina attivatrice fa tutto il lavoro.

Operone Lac: 3 geni

L'repressore.

Il sito operatore: sito su cui attacca

Ogni DNA polimerasi ha i suoi fattori trascrizionali specifici.

Che cosa è la cromatina?

DNA avvolto su otto istoni. A livello dei mitocondri abbiamo una doppia membrana, per entrare una proteina si denatura per facilitare tutto il processo. L'unica cosa che fa la differenza sono i primi 10-20 amminoacidi.

DELL'REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA

Le polimerasi non possono iniziare ex novo e così mettiamo i tratti del RNA

OKAZAKI FRAGMENTS: I tratti primer

del RNA nella replicazione

Il cromosoma dei batteri è solo uno. I batteri hanno tutte 3 polimerasi.

Si deve capire che nella replicazione del DNA non esiste filamento lento e veloce. Solo filamento continuo e filamento discontinuo. troponina/tropomiosina, l'actina è in grado di legarsi a

Oltre che alle miosine e ai complessi molte altre proteine. impedendo l'assemblaggio.

Timosina si lega alle subunità libera dissociate, centro di nucleazione e rimane legata all'estremità (+) durante l'allungamento.

Formina: funge da all'estremità (-)

Complesso Arp: crea una rete e rimane legata

Cofilina: si lega ai filamenti di ADP-actina accelerandone il disassemblaggio.

all'estremità

Gelsolina: taglia i filamenti e si lega (+).

Il movimento cellulare su un substrato dipende dall'estensione di processi citoplasmatici (filopodi e lamellipodi), a loro volta dipendenti da processi di polimerizzazione regolata di microfilamenti

diactina. Nel processo di avanzamento dei lamellipodi sono implicate proteine ARP2/3 che favoriscono la nucleazione dell'actina.

Esistono veleni in grado di interferire con i processi di assemblaggio e disassemblaggio dei microfilamenti di actina.

Falloidina: composto che deriva da un fungo, viene utilizzata nel laboratorio perché impedisce il disassemblaggio.

L'affinità della falloidina per la F-actina anche nell'ambito della ricerca biomedica, alloè sfruttata a scopo di visualizzare i microfilamenti del citoscheletro. Non ha bisogno di un anticorpo e lega i microfilamenti.

I filamenti intermedi (IF) sono la terza componente del citoscheletro, presenti solo in alcune cellule animali (ad es. vertebrati).

I IF percorrono tutto il citoplasma (sia come filamenti singoli, che come fasci) e rivestono l'involucro la superficie interna nucleare.

Da un punto di vista strutturale, le subunità dei IF sono costituite da una parte centrale fibrosa idrofobica,

Affiancata da due domini globulari. Nei filamenti intermedi non sono polarizzati all'estremità. Di conseguenza, non ci sono i motori molecolari che camminano sui filamenti intermedi da un'estremità all'altra. L'assemblaggio non richiede ATP o GTP.

BLASTOCITI

Il blastocite è una sfera cava con due strati.

CELLULE STAMINALI ADULTE

PRO CONTRO

1. Non presentano rigetto.

1. Sono difficili da coltivare o da isolare.

2. In alcuni casi si trovano già nel tessuto da curare.

2. Presentano una proliferazione più lenta di quelle embrionali.

3. Il loro utilizzo non lede, non sopprime e non danneggia nessun altro essere umano in qualunque stadio del suo sviluppo.

4. Sono già stati ottenuti importanti risultati clinici.

CELLULE STAMINALI DEI TESSUTI

Si trovano:

1. Nella superficie dell'occhio

2. Cervello

3. Pelle

4. Mammella

5. Intestino

6. Testicoli

CELLULE STAMINALI EMBRIONALI

PRO CONTRO

1. Sono tutte totipotenti.

1. Presentano alta

1. Le cellule staminali hanno una probabilità di rigetto molto bassa.

2. Le cellule staminali hanno una grande capacità di proliferazione, ma non hanno ancora raggiunto risultati clinici concreti.

3. Le cellule staminali possono mantenersi più a lungo in coltura, ma non è ancora possibile controllare l'espressione genica che determina l'espansione e la differenziazione. Se impiantate, si sviluppano come tumori.

4. Le cellule staminali hanno una maggiore facilità di prelievo.

CELLULA STAMINALE

Autorigenerazione

Differenziamento

CELLULA STAMINALE

CELLULA SPECIALIZZATA

CHE COSA POSSONO FARE LE CELLULE STAMINALI DEI TESSUTI?

CELLULA STAMINALE DEL SANGUE

SOLO CELLULE SPECIALIZZATE DEL SANGUE

DIFFERENZIAMENTO

Le cellule staminali mesenchimali (MSCs)

CELLULE STAMINALI iPS:

Riprogrammazione genetica

Cellula dell'organismo

Coltivare iPS

COME RACCOGLIERE LE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI?

I. Raccogliere le cellule fresche oppure in fase logaritmica della loro crescita nel caso di linee cellulari.

II. Determinare il numero di

cellule e la percentuale di vitalità.

III. Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il sovranatante.

IV. Preparare il medium di congelamento: medium di coltura al 20% FBS e 10% DMSO.

Risospendere il pellet nel medium di congelamento rapidamente ed in ghiaccio. [DistribuireV. 1ml nelle appropriate criovials oppurtunatemente siglate.]

VI. Dare inizio al processo di congelamento