Biologia molecolare

EXON SKIPPING.

Nei batteri abbiamo RIBOENZIMI cioè

molecole che effettuano un SELF-SPLICING

autoexcidendosi. E sono quelli del t-RNA e del

r-RNA.

Negli eucarioti invece abbiamo uno

SPLICEOSOMA che effettua lo splicing, ed è

formato da 150 proteine+ 5 vari snRNA, lo spliceosoma riconosce le zone di confine degli introni e le excide.

Si forma una TRASDIESTERIFICAZIONE e quindi un taglio subito dopo l’esone 5’, il secondo taglio è

sull’ultima base dell’introne, si forma cosi un introne a cappio, si ha l’unione con l’esone adiacente e il

rilascio dell’introne.

A volte possono rimanere degli introni del mRNA maturo.

Sul pre-mRNA ci sono anche varie proteine per il riconoscimento, alcune stanno ai confini degli introni er

migliorare il taglio e vengono eliminate con lo splicing, mentre rimangono quelle al CAP e al POLI-a.

Le MUTAZIONI REGOLATORIE si formano prima anche della trascrizione o dello splicing, come per esempio

l’ANEMIA FALCIFORME, gr trasporta male l’ossigeno, si tratta di una β-talassemia.

INTERFERENZA A RNA (RNAi)

Questo fenomeno decide se un rna maturo può andare incontro a traduzione oppure no.

Questo fenomeno è stato studiato nelle piante e poi in ARABIDOPSIS.

Premi Nobel 2006 per Craig Mello e Andrew Fire.

Inserirono rna a doppio filamento dsRNA di una proteina, immettendo l’rna si senso e di non senso, cioè

quello uguale e quello complementare alla sequenza del gene, questo veniva silenziato poiché veniva

degradato l’mRNA corrispondente.

I dsRNA si possono trovare nei virus con rna come genoma e durante la replicazione si formano dei doppi

filamenti di RNA che possono essere inseriti nella cellula, oppure con le strutture a forcina degli RNA .

RNA “house keeping”

-rRna = traduzione

-tRna = traduzione

-snRNA = splicing

-snoRNA = assemblaggio proteine

-75L RNA = per secrezione delle proteine

RNA regolativi:

- miRNA (micro RNA)

- si RNA (smll interfering RNA)

- lnc RNA (long non condition RNA)

RNAi è un meccanismo antico che nasce come difesa dai virus e dai trasposoni, prima era solo siRNA poi

con l’evoluzione anche miRNA. Con l’evoluzione del processo piante e nematodi hanno amplificato i proprio

miRNA. RNAi è usata dai biotecnologi per modulare l’espressione genetica.

Nelle piante si chiama siRNA e serve per silenziare l’infezione del virus.

Nell’uomo ci sono circa 600 miRNA legati alla tumorogenesi.

FONTI DI dsRNA

-virus con genoma a singolo filamento ma si replicano con un intermedio a doppio filamento di RNA

-HERPIN cioè RNA aforcina cioè si formano quando si trovano zone omologhe

-virus a DNA cioè durante la replicazione si formano degli intermedi di rna a doppio filmanto.

Cosa succede quando il virus inietta il suo RNA? DIFESA DALL’INFEZIONE SILENZIANDO RNA VIRALE.

I dsRNA virali vengono riconosciuti dalla ribonucleasiII chiamata DICER che taglia gli RNA in piccoli pezzi

chiamati siRNA. Il complesso proteico RISC + ARGONAUTA lega una sola delle due catene, l’altra viene

degradata (chiamata PASSEGER) e cerca un messaggero complementare e lo distrugge.

Il virus è fuori uso.

DICER riduce gli RNA in piccoli pezzi.

TRASPOSONI, sequenze di DNA che saltano da un punto all’altro del genoma, provocando danni se si

inseriscono nei punti sbagliati. La loro azione prevede un passaggio di sintesi di una catena di RNA a loro

complementare che può inserirsi in qualsiasi punto del genoma, alcune di queste molecole sono a doppio

finalmente e quindi attaccate da DICER.

Gli eucarioti hanno evoluto l’interferenza a rna anche per ridurre i danni dei trasposoni.

miRNA, piccoli rna non codificanti di circa 22 nucleotidi. i geni possono essere singoli o raggruppati in classe

e sono trascritti in pri-mRNA con una struttura a forcina, contengono anche migliaia di paia di basi.

Drosha e Pasha fanno maturare il pri-mRNA in pre-mRNA togliendo il capo e la coda.

A questo punto il pre-mRNA viene portato nel citoplasma dall’EXPORTINA54 e processati da DICER che

taglia la parte ad ansa e ottiene un miRNA a doppio filamento che è riconosciuto da RISC che degrada un

filamento e ne riconosce un altro. Se miRNA si lega in modo non perfettamente complementare all’mRNA

che trova, inibisce la trascrizione, se invece il legame è perfettamente complementare porta al

degradamento del messaggero corrispondente.

TRADUZIONE

Partecipano:

-tRNA

-amminoacil-trna sintetasi

-ribosomi

-mRNA che contengono l’OPEN READING FRAME (ORF)

5’CAP-n-n-n-n-n-AUG-AAA-GCA------UGA-n-n-n-n-n-n-AAAAAAAA 3’

ORF

Il tRNA ha una struttura tridimensionale con delle anse, a causa dei legami a idrogeno tracatena. Possiede

dalle 73 alle 93 basi ed ha una struttura a trifoglio. Ne esistono circa 30 tipi diversi.

Ci sono 20 amminoacil-tRNA sintetasi. Queste attivano i tRNA legandoci l’amminoacido corrispondente,

questo passaggio avviene legando l’amminoacido prima all’ATP e poi al tRNA convertendolo in AMP.

Formano un legame fosfoanidridico. C’è anche un PROOF-READING a

livello della reazione, c’è un errore ogni 10^5, ma quando si attacca

l’aminoacido sbagliato ormai è troppo tardi. Gli amminoacil-tRNA

sintetasi sono i veri traduttori, sono enzimi non specifici perché si

occupano di tutti i tRNA, e si dividono in due classi.

I siti di riconoscimento sul tRNA sono lo STELO ACCETTORE e l’ANSA

ANTICODONE.

Gli rRNA derivano da un unico precursore che poi viene successivamente

tagliato.

TRADUZIONE PROCARIOTI

La sequenza SHINE E DALGARNO (AGGAGG) è riconosciuta dalla subunità

minore del ribosoma dopo di che ha inizio la traduzione dopo 3-9 paia di

basi…

Nei procarioti la traduzione è cotrascrizionale.

I geni e i mRNA nei batter molto spesso sono POLISTRONICI, cioè sono OPERONI.

All’inizio del gene non si ha il capping ma tre fosfati.

AUG si presenta nel sito P e solo in questo caso il tRNA della FORMIL-METIONINA (una metionina formilata

a livello dell’azoto) entra nel sito P, a questo punto arriva la subunità maggiore. Il secondo tRNA arriverà nel

sito A, il suo amminoacido verrà legato alla formil-metionina grazie ad una peptidil-trasferasi e il complesso

scorrerà sui ribosomi.

Tutto questo accade grazie a dei fattori di iniziazione:

- IF1, Allontana le subunità 30S e 50S del ribosoma.

- IF2, Promuove il legame del complesso metionina formilata-tRNA al ribosoma 30S. Richiede GTP

che, tuttavia, sembra non essere idrolizzato.

- IF3, Lega l'mRNA alla subunità 30S e, al contempo, impedisce il riaggancio con la subunità 50S.

TRADUZIONE EUCARIOTI

L'inizio della traduzione eucariotica è molto più complesso. Dopo la trascrizione, l'mRNA è processato

mediante gli eventi di “maturazione” che consistono nel capping e nella poliadenilazione. Questi eventi

servono per aumentare il livello di traduzione e sono assenti nei procarioti.

Esistono differenze sostanziali tra i fattori di inizio della traduzione rispetto ai procarioti. Negli eucarioti ci

sono un numero maggiore di elementi che coadiuvano l'inizio del processo, questi elementi rendono più

complesso tutto il sistema della traduzione. C'è da considerare che l'mRNA eucariotico presenta alcune

strutture peculiari tra cui il CAP ed una potenziale forcina che devono essere trattate affinché il ribosoma

possa compiere il proprio lavoro.

- EIF4F

Riconosce il CAP e, grazie ad una attività elicasica, svolge la forcina dell'mRNA.

- EIF2, Coadiuva il legame dell'mRNA alla particella 40S del ribosoma. Aggancia a sé un GTP.

- EIF2B, Serve per l'idrolosi del GTP in GDP presente in EIF2; in questo modo il fattore EIF2 si rilascia

dal complesso ribosomico.

- EIF3, Si lega alla subunità 40S del ribosoma e ne impedisce l'aggancio con la subunità 60S.

- EIF6, Si lega alla subunità 60S del ribosoma e ne impedisce l'aggancio con la subunità 40S.

- EIF5, Coadiuva l'aggancio della subunità 40S e della subunità 60S del ribosoma.

- EIF1, EIF1A, Coadiuvano il “movimento” del complesso ribosomico lungo la catena di mRNA.

Se nei procarioti il primo aminoacido incorporato nella neonascente catena polipeptidica è la n-

formilmetionina negli eucarioti il corrispettivo aminoacido è la metionina. Il codone principale di start è

sempre AUG ma c'è una forma diversa che riguarda il modo con il quale il ribosoma arriva a questo codone

rispetto a quanto avviene nei batteri. Esperimenti hanno dimostrato che esiste una sequenza consensus

altamente conservata che circonda il codone di start. La sequenza prende il nome dalla sua scopritrice

Marylind Kozak che la propose nel 1975. Questa sequenza è:

CCA/GCCAUGC

È da notare che il codone AUG codificante per la metionina è espresso nella sequenza di Kozak.

Esistono delle variazioni a questa sequenza che, comunque, è un modello che fa parte delle cosiddette

regole di Kozak che determinano la formazione ideale di un ORF, acronimo di un open reading frame. Un

ORF non è altro che una parte dell'mRNA che, potenzialmente, può codificare per una proteina; questa

sequenza è data dalla presenza di una zona di “inizio” e da un terminatore, la cui struttura verrò proposta

in avanti.

Allungamento

Nella fase di allungamento alla

neonascente catena polipeptidica

vengono aggiunti gli aminoacidi la cui

informazione, in termini di sequenza,

è conservata nell'mRNA.

È opportuno ricordare che il codice

genetico è di tipo non sovrapponibile

perché i nucleotidi non sono correlati

a più di un codone, e non interrotto

per cui la sequenza di mRNA viene

tradotta senza ambiguità ed

interruzioni a meno di errori

nell'apparato di trascrizione.

Il ribosoma è il luogo dove viene

operato l'allungamento. Possiamo

idealmente suddividere il ribosoma in

tre siti che svolgono differenti ruoli. Il

sito P (peptidico) è quello dove si

trova, temporaneamente, la catena

in fase di allungamento; il sito A

(aminoacidico) è dove viene condotto il nuovo aminoacido legato al tRNA da inserire nella catena; il sito E

(exit) è il sito da dove viene espulso il tRNA.

Due fattori principali contribuiscono alla sintesi del polipeptide e sono EF-Tu ed EF-G. EF-Tu è legato ad un

GTP ed ha il compito di legarsi all'aminoacil-tRNA formando un complesso ternario che viene condotto a

livello del sito A del ribosoma; se il sito P del ribosoma è libero, ad esempio quando la sintesi sta iniziando,

allora EF-Tu con la N-formilmetionina si legano al sito P. All'interno del ribosom