Biologia molecolare

Molecolare

Denaturare DNA: riscaldamento, raffreddandola torna come prima.

Se scaldo le proteine non tornano come prima raffreddandola ma ci sarà una fase LENTA (le due eliche si

devono trovare) e poi VELOCE (si ricostruisce la struttura).

In base all’assorbimento posso vedere quanto DNA c’è in una provetta.

EFFETTO IPERCROMICO: se si estrae DNA e si purifica per vedere quant’è si controlla l’assorbimento e si

vede che aumenta nel tempo.

TECNICA DI NICK.

Il metodo della Nick translation è una tecnica di laboratorio di

biologia molecolare che serve per operare la marcatura del DNA

ovvero a creare sonde radioattive che potranno servire in seguito

per esperimenti quali ad esempio il sequenziamento di un tratto di

acido nucleico. La tecnica consiste nel creare interruzioni nella

catena di acido nucleico con una DNAasi I. Successivamente tale

interruzione viene ripristinata con l'azione della DNA polimerasi I

facendo in modo che questa utilizzi nucleotidi trifosfato marcati

radioattivamente. Quindi si ripete l'esperimento andando a

scindere il legame fosfodiestere al 3' del nucleotide inserito e così

via fino a che non si abbia un intero tratto di DNA marcato (sonda).

La tecnica è realizzabile grazie alla capacità esclusiva della DNA

polimerasi I di rimuovere i nucleotidi di un filamento di DNA in

direzione 5'-3', mentre ne aggiunge di nuovi. Nello specifico si

parla di attività esonucleasica 5'-3'.

Probabilmente in vivo questa attività è espletata dalla DNA

polimerasi I nel contesto di sistemi di riparazione, per riempire

regioni a singolo filamento oppure quando nucleotidi danneggiati

sono rimossi.

Struttura DNA

Il DNA in natura si può trovare in più forma, A,B

che sono destrorse e Z che è sinistrorsa.

La forma B è quella naturale mentre la A è

quella tipica dell’ibrido da DNA e RNA.

La forma B HA UN DIAMTRO DI 10 AMSTRONG

E LA COPPIE BASI/GIRO SONO 10,5.

Affinché ci sia la trascrizione di un gene,

l’enzima deve riconoscere il sito di attacco e

questo avviene grazie ad una proteina che

osserva la doppia elica chiusa senza aprire il

DNA, la proteina esterna vede AADH e capisce

che c’è una coppia G-C, se vede HDAA capisce

che c’è una coppia C-G. questi sono gli

elementi presenti nel solco maggiore che ci

fanno capire cosa c’è da trascrivere. Per quanto

riguarda la coppia A-T, in quanto è molto simmetrica in questo caso vedrà ADAM mentre per T-a vedra

MADA.

Nel solco minore cambia la situazione, è meno informativa e vede sempre solo AHA per A-T e ADA per G-C.

NUCLEASI(fosfodiesterasi)

-desossiribonucleasi/ribonucleasi

-esonucleasi/endonucleasi

• ENDONUCLEASI, tagliano all’interno e di dividono in “p” se tagliano un gruppo fosfato che rimane

attaccato al 5’, o “d” se tagliano in un altro punto.

• ESONUCLEASI, possono tagliare dal 3’ al 5’

Il nostro DNA subisce di continuo danni che vengono

riparati dalle LIGASI.

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE.

Sono enzimi capaci di legare il doppio filamento per

poi tagliarlo, ma solo in punti specifici.

QUESTE SEQUENZE HANNO UNA STRUTTURA

CENTRALE PARTICOLARE.

Per esempio AAATTT/TTTAAA. Questi sistemi di

restrizione sono tipici dei batteri e di solito sono dalle 4

alle 6 basi. Alcuni enzimi tagliano semplicemente nel

mezzo creando due NICK vicine e il DNA si apre. ECO-Ri

è un enzima di restrizione dimerico.

Vengono chiamate estremità coesive o STICKY END,

perché sono complementari. Se si fa la reazione

opposta, la ligasi le unisce molto più efficacemente.

Gli enzimi operano con una frequenza teorica di taglio di 1/4^n

ISOSCHIZOTIERI

Sono enzimi di restrizione presenti in batteri diversi, che riconoscono casualmente la stessa sequenza,

anche se il taglio può essere diverso, tipo una volta a destra e una volta a sinistra. Ma riconoscono sempre

la solita sequenza.

Il superavvolgimento è un modo efficace per proteggersi da DNA virali, questi DNA una volta entrati

vengono trascritti e tradotti e poi liberano nuovi virus.

SISTEMA DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE

-uno riconosce la sequenza e la taglia

-Uno riconosce la sequenza e la protegge (metilasi, aggiunge un gruppo CH3)

L’enzima donatore dei gruppi metilici è S-adenosil metionina.

Ciò che viene metilati è il DNA del batterio, in modo che l’enzima di restrizione non lo riconosca e non vada

a tagliare ciò che non deve. Il DNA del virus non viene metilato perché deve essere tagliato.

Se avviene una metilazione prima di un taglio necessario per la cellula, tipo dopo un’infezione, questa

rimane perché il taglio non può essere effettuato. La metilazione è una modifica fisiologica,

CLASSI:

Le classi I e III necessitano di energia per rompere i legami e possono catalizzare anche altre reazioni per

modificare il DNA.

-tipo I, tagliano in punti casuali il DNA

-tipo III, riconoscono specifici siti bersaglio ed effettuano il taglio in corrispondenza o vicino a questi.

-Le endonucleasi di tipo II, gli enzimi di restrizione propriamente detti non necessitano di energia per la loro

funzione ed il taglio avviene in corrispondenza di sequenze molto specifiche.

Il DNA è chimicamente identico, bisogna vedere la sequenza per capire se è umano o di un batterio.

Attività DNA ligasi, c’è una lisina (LYS) sulla ligasi che forma l’enzima e alla fine c’è ATP che forma AMP

pirofosfato.

La ligazione avviene in tre fasi

1. Il DNA ligasi reagisce con l’ATP per formare il complesso ligasi-ATP

2. L’ATP attiva il gruppo fosfato all’estremità 5’ del DNA che deve essere legato

3. Attacco nucleofilo del gruppo -3’OH sul 5’P attivato con la formazione di un legame fosfodiesterico.

Nei cromosomi circolari batterici le TELOMERASI sono sempre attive, mentre nei cromosomi lineari

eucariotici le telomerasi accorciano i telomeri sul filamento a sintesi lenta, ci sono molte proteine che

inibiscono la telomerasi, ma nelle cellule tumorali l’attività telomerasica viene ri-attivata e i tumori non

hanno freno nella proliferazione.

In un batterio troviamo oltre al cromosoma circolare principale di circa un milione di paia di basi, anche dei

PLASMIDI, questi hanno circa mille paia di basi, si replicano indipendentemente dal genoma e possono

essere facilmente purificati da una cellula batterica e modificati “in vitro” o inseriti in un ceppo batterico

tramite trasformazione.

REPLICAZIONE

La replicazione è semiconservativa, c’è un filamento stampo e uno di innesco, di esso il gruppo OH dello

zucchero di lega al P più vicino allo zucchero del nucleotide con la base azotata corretta, liberando un

gruppo pirofosfato. La DNA polimerasi per evitare che vada un ribonulceotide al posto di un

desossiribonuclotide, utilizza un aminoacido discriminatorio

La correzione avviene durante la sintesi che avviene in direzione 5’-3’, ma la correzione avviene anche in

senso inverso.

Nei procarioti abbiamo i REPLICONI, cioè unità di DNA che vengono replicate a partire da un singolo

REPLICATORE, quando si deve replicare in direzione 3’.5’ abbiamo una replicazione discontinua. Il

replicatore si trova in molte copie negli eucarioti. Enzimi della forca replicativa (primasi, DNA elicasi, ssbpr,

topoisomerasi)

La metilazione del DNA prima che questo venga replicato è fondamentale poiché permette poi, durante la

sua replicazione, di distinguere il filamento stampo (che sarà quindi metilato), da quello neosintetizzato

(non ancora metilato).

In questo modo si possono correggere gli errori di appaiamento di basi che possono intercorrere durante la

replicazione. Infatti, conoscendo quale dei due è il filamento stampo (quello metilato) si può procedere con

la rimozione della base errata sul filamento neo-sintetizzato.

Senza la metilazione i due filamenti sarebbero indistinguibili e non si potrebbe capire quale delle 2 basi sia

quella errata, e quale quella originale.

Inoltre, la metilazione permette anche la di controllare la replicazione. Subito dopo la duplicazione del DNA

infatti, questo risulterà metilato solo su un filamento (il DNA sarà emimetilato). Questa emimetilazione

rende inaccessibile Ori-C (il punto di inizio della replicazione) alla Dna-A (una delle proteine coinvolte nella

duplicazione del DNA) ed evita che la replicazione venga ripetuta.

Quando Ori-C è emimetilato invece, può essere riconosciuto da un'altra proteina, detta Seq A, che

permette al DNA di legarsi alla membrana plasmatica batterica.

La DNA polimerasi III è formata da più subunità, la più importante è la SLIDING CLAMP, proteine dimeriche,

a forma di anello che durante la replicazionetiene unito il filamento stampo e quello in formazione e dirige

le operazioni di sintesi poiché indirizza la polimerasi, tutto ciò in un modello definito “ a trombone”.

La topoisomerasi II trasforma superavvolgimenti positivi in super avvolgimenti negativi.

TELOMERASI

Quando nei cromosomi lineari

l’innesco viene tolto, il filamento a

5’ sarà più corto del 3’, il compito

della telomerasi è quello di

allungare questi cromosomi di

qualche unità.

Le telomerasi hanno una struttura

particolare, presentano dei t-loop,

l’unico problema è che possano

danneggiare il doppio filamento di

DNA.

Telomerasi unicellulari e metazoi.

- Sono sempre attive negli

organismi unicellulare

- Allungamento ridotto,

decine di nucleotidi

- Attive solo per brevi

periodi nei metazoi

- Allungamento esteso nei metazoi, migliaia di nucleotidi

Alcune cellule non si replicano (SENESCENZA REPLICATIVE), ma altre si e sono le cellule STAMINALI.

In noi esseri umani la telomerasi funziona solo durante l’embriogenesi e a gametogenesi. Durante le

successive replicazioni il telomero si accorcia fino a scomparire e la cellula poi muore, in quelle staminali

invece l’attività telomerica è sempre attiva.

Nei tumori la cellula riacquista queste capacità proliferatici.

Avvengono continuamente danni al DNA che vengono però corretti, ci sono diversi modi in cui una cellula

può subire mutazioni. Durante la replicazione del DNA sono le polimerasi I e III che si occupano delle

correzioni, il DNA è una molecola eterna in quanto ha memoria e una mutazione una volta avvenuta può

rimanere per sempre.

Molte mutazioni= perdita della funzione, tumori

Nessuna mutazione= nessuna possibilità di evoluzione

Poche mutazioni= danni limitati, evoluzione.

Mutazioni possono essere in seguito a:

1. Danni durante la trascrizione, PROOF-READING

2. Danni chimico-fisici del DNA, riparazione

3. Trasposoni, danni limitati, evoluzione

1.Errori sfuggiti ai sistemi di riparazione durante la trascrizione.

Eliminazione de ribonucleotidi sbagliati aggiunti RER, RNAasi HII.

L’MMR (Mismatch Repair) è un sistema molto importante di riparazione del DNA in grado di riconoscere

coppie di nucleotidi male appaiati all’interno della nuova elica in formazione, di rimuovere il nucleotide

sbagliato e di rimpiazzarlo con quello corretto. Tutto ciò presuppone che l’MMR sia in grado di discriminare

il filamento stampo da quello neosintetizzato.

l’MMR per funzionare ha bisogno di un nick, un taglio, presente nel nuovo filamento al 5’ del mismatch, a

partire dal quale l’esonucleasi EXO1 può iniziare a rimuovere nucleotidi. Tale meccanismo risulta

evidentemente facilitato per quanto riguarda il lagging strand, nel quale i frammenti di Okazaki assicurano

la presenza di multipli nick. Diventa invece più complicato comprendere in che modo si possano generare i

nick nel leading strand.

La chiave di tutto risiede nella RNAsi H2, un tagliare e rimuovere ribonucleotidi sbagliati e alcuni

desossiribonucleotidi successivi dell’elica nascente. Ciò permette la creazione di nick anche nel leading

strand e di conseguenza l’intervento di EXO1 e del Mismatch Repair.

2. modificazione chimiche.

-deaminazione della citosina (NH2 viene sostituito con un O) e si forma quindi un URACILE. Deve essere

effettutata una RIPARAZIONE PER EXCISIONE DI BASE (B.E.R.)

L’enzima GLICOSILAS si occupa di rompere il legame glisosidico tra lo zucchero e l’uracile, formando un sito

ABASICO (AP) che deve essere riparato. Interviene un endonucleasi che elimina lo zucchero e il fosfato e

crea un NICK, poi interviene la polimerasi e infine la ligasi.

La deaminazione di adenina porta alla formazione di IPOXANTINA. Questi fenomeni sono spontanei come

anche la DEPURINAZIONE, spesso a carico delle guanine, anche questo è un danno però chimico poiché si

crea un sito abasico (AP) perché viene eliminata una purina (sempre per idrolisi)

La 5-metil citosina se deamina diventa una timina (o 5-metil uracile) e questa NON è riparabile.

Può avvenire l’ossidazione di una guanina che diventa OXO-G che si stabilizza con la timina, oppure la

deaminazione di una guanina diventa XANTINA che stabilizza con la timina.

O il C6 metil-guanina che lega con la timina ma immediatamente riparato eliminando il gruppo CH3.

Altri danni sono quelli di ALCHILAZIONE, per aggiunta di gruppi chimici con alto potenziale di trasferimento.

L’acido NITROSO (HNO2) induce la citosina a deaminare e l’adenina a trasformarsi in citosina.

L’IDROSSILAMMINA modifica la citosina facendola legare ad una adenina.

La NITROSOGUANINA forma una depurinazione, si forma AP.

Sommario

- Idrolisi del legame glicosidico dei purini (A/G) = depurinazione del nucleotide

- Idrolisi del g