Biologia molecolare

RNA

Se un RNA a doppia elica con un numero di bp minore di 20 viene inserito all’interno di un

organismo, esso non viene degradato e puo’ essere utilizzato per innescare svariate funzioni e

applicazioni e su questa struttura si innestano numerose regolazioni, se in seguito ad appaiamento

dell’elica di RNA le sequenze complementari sono molto lunghe (100bp) si innesca un

meccanismo di degradazione dato dalla RNasi H, un RNA possiede dei tipi di compattamenti molto

piu’ dinamici rispetto a quelli utilizzati dal DNA, un RNA viaggia sempre associato a delle proteine,

il complesso RNA-proteine interagisce sempre con altri RNA, i fattori di trascrizione riescono ad

interagire con il DNA attraverso il riconoscimento dei vari solchi, la specificita’ di alcuni gruppi R

per alcun nt, molto spesso gli RNA fanno catalisi e le proteine stabilizzano l’interazione RNA-RNA,

RNA presenta un 2’OH assente nel DNA (che ha 5’OH e 3’OH) che la rende molto reattiva e

instabile, l’RNA tende a essere modificato per modulazione della sua reattivita’, gli istoni vengono

espressi durante la divisione nella fase S (non sono dei geni housekeeping), i gruppi –CH3

tendono a stabilizzare la sostanza, alcuni RNA regolatori si pensa misurino solo 6-7 bp, ordine di

grandezza di un gene batterico: 1000 bp, ordine di grandezza di un gene di mammifero: 100000

bp, lunghezza media di un mRNA equivale a 5500 bp, un genoma di lievito possiede circa 12000

geni (12*10^6 bp), durante il ciclo una cellula utilizza circa il 40-50% del suo genoma (non circa il

2-3% perche’ alcuni geni vengono espressi in quantita’ infime, 10-20 copie), la quantita’ di genoma

trascritto varia dalla complessita’ dell’apparato della cellula (una cellula muscolare usufruisce circa

del 20%), RNAP I fa solo rRNA e RNAP III fa i tRNA, tutti i passaggi di processamento molecolare

(capping, splicing, trasporto) sono cotrascrizionali perfino i primi passaggi di traduzione nei geni

molto lunghi, la trascrizione di geni lunghissimi, ad esempio a distrofina (10^6 bp), puo’ durare

minuti od ore, si possono formare alcune strutture secondarie stabili, grazie anche il

riconoscimento del legame G-U, definite tetra-loop importanti poiche’ espongono regioni con basi

specifiche e in seguito sono riconosciute da molti fattori, RNAP viaggia a una velocita’ costante

regolata da diversi fattori (poco dallo stato della cromatina), maggiore e’ la concentrazione di un

dato fattore di regolazione maggiore e’ la probabilita’ che si leghi alla RNAP o che interagisca con il

macchinario, infatti si pensa che non esiste un nucleoplasma separato dall’involucro ma zone del

nucleo in cui avviene la trascrizione e il nucleo e’ in stretto contatto con il citoplasma, lo splicing

regola in parte l’efficienza della RNAP (la presenza del primo introne e’ associata all’efficienza

mentre quello dell’ultimo introne alla fine della trascrizione), il capping e’ importante per la

trascrizione, questi processi sono studiati grazie all’immunoprecipitazione, il promotore e’ molto

importante per la regolazione del processamento del pre-mRNA, lo spliceosoma deve essere

aiutato a produrre il mRNA corretto (se processo un pre-mRNA in vitro e lo inietto nel nucleo di una

cellula bersaglio l’efficienza di processamento dell’mRNA e’ molto minore), molti fattori di splicing

(SCAFs) sono situati vicino alla coda del RNAP in movimento, RNAP presentante diverse subunita’

tra cui una piu’ grande di 200 kDa, correlata alla polimerasi batterica piu’ efficiente (una sola

subunita’), e presenta un dominio C-terminale formato da un eptapeptide Y-S-P-T-S-P-S ripetuto

piu’ volte (in un mammifero 52, mentre in qualche vertebrato di piu’ (alcuni anfibi), e in lievito 26), il

cui numero delle ripetizioni aumenta all’aumentare della complessita’ dell’organismo, che presenta

delle serine che vengono fosforilate per poter cambiare conformazione alla polimerasi, e il

cambiamento dello stato di fosforilazione (con 100 residui possibili siti di fosforilazione) della coda

determina l’affinita’ per i diversi fattori di processamento, durante l’elongazione la RNAP e’

iperfosforilata, il promotore fornisce il sito di legame a proteine (GTSFs) che presentano i fattori di

taglio (CPSF), la CTD durante l’elongazione puo’ essere defosforilata (soprattutto durante la fase

terminale), un virus possiede una polimerasi molto efficiente poco regolata, la minima regolazione

la possiede la polimerasi di un fago, il promotore misura circa 200 bp e un enhacer circa 100 bp,

se nel promotore sono presenti zone sequenziali conservate allora sono importanti

funzionalmente, la regolazione di un gene e’ dato da una combinazione di fattori sul promotore, su

sequenze che si legano alla polimerasi in trans (ad esempio gli enhancer e i silencer e attivatori

che sono molto piu’ regolati), su inibitori competitivi, quindi la trascrizione di un dato gene e’ data

dalla concentrazione di fattori trascrizionali presenti su quel gene che sono facilitati a legarsi con la

polimerasi, dove la cromatina e’ metilata la concentrazione di questi fattori diminuisce, enhancer

possono trovarsi anche a valle del gene, zone importanti per la regolazione di un gene su un

cromosoma possono trovarsi anche su cromosomi diversi, un retrovirus se si integra in un

promotore molto attivo che da’ efficienza alla polimerasi allora il suo RNA si replichera’ subito,

mentre se si localizza in zone a bassa intensita’ puo’ mostrarsi anche dopo anni (sopraggiunge

quindi un periodo di latenza in cui il retrovirus e’ dormiente), TGFs sono conservati pressoche’

nelle specie, come il complesso mediatore che deve legarsi agli attivatori, posizionati a monte del

gene e interagiscono in trans con quest’ultimo, che sono diversi da specie a specie ma presentano

dei domini conservati, si legano anche a rimodellatori di cromatina e acetiltransferasi (HAT), lo

stato trascrizionale puo’ possedere maggior efficienza se il dominio dell’attivatore ha una maggior

affinita’ per il complesso mediatore, la TBP e’ presente nel fattore TFIID ed e’ importante per il

posizionamento di questo fattore (che copre il promotore da -31 a +32), sul promotore si legano

pressoche’ gli stessi elementi su sequenze conservate (ottamero, sito di legame di Oct-1, CAAT

box, sito di CTF, GC box e TATA box), da cellula a cellula non cambiano le sequenze dei promotori

o i vari fattori di trascrizione ma solo la quantita’ di quest’ultimi nei vari geni, in caso di

modificazione di anche un singolo nt prossimale della sequenza genica la trascrizione cala del

50%, percio’ al cambiamento di singole basi possono influenzare piu’ o meno drastcamente

l’efficienza della trascrizione, lo stato della cromatina regola generalmento l’accessibilita’ dei vari

fattori, lo stato di metilazione del DNA e’ molto meno variabile rispetto a quello istonico,

l’inattivazione della trascrizione puo’ essere totale solo se si modifica il promotore, in seguito a

diversi segnali molecolari viene modificato il processamento trascrizionale, un cambiamento

chimico di fattori (normalmente dato da una fosforilazione o defosforilazione, meno frequente)

porta all’attivazione del gene, cambiamento di compartimento (regolato spesso da fosforilazione o

da cofattori che li guidano o scioglimento del legami con inibitori competitivi), molto rari sono quei

fattori che interagiscono con il DNA senza alcuno stimolo (soprattutto a livello embrionale), per

risposte rapide non c’e’ tempo di produrre un nuovo trascritto ma vado a modificare le proteine o il

trascritto sintetizzato a livello post-trascrizionale (il massimo esempio lo abbiamo nel sistema

nervoso attraverso l’elaborazione delle informazioni immediate che riceviamo dall’ambiente

esterno), TBP entra anche nei geni trascritti da RNAP I e III nonostante non ci sia la TATA box

legandosi con altre proteine formando complessi fondamentali per il processamento, normalmente

un RNA nella cellula viene degradato sia in maniera casuale che regolativa a partire dalle

estremita’ poiche’ se non viene regolato porta a modificazioni nel processamento, la pol dopo aver

sintetizzato circa 20 nt si ferma sulla sequenza DPE a +25 (sito di inserzione di TFIID) bloccando

l’RNA nel suo dominio proteico per stabilizzare il messaggero e salvarlo dall’eliminazione, in qusto

modo temporeggia per dare tempo per l’adesione degli enzimi di capping (l’estremita’ 5’ e’ molto

piu’ esposta all’inizio della degradazione) sulla coda CTD e a posizionarsi sull’RNA in formazione,

circa il 70-80% delle trascrizioni vanno con successo in quanto il capping e’ molto difficoltoso e se

agli enzimi di capping viene modificata l’affinita’ per la coda sara’ piu’ difficile lo spostamento verso

il 5’, dal punto di vista trascrizionale le cellule tendono a trascrivere piu’ geni housekeeping di quelli

che servono poiche’ la trascrizione richiede parecchio tempo, i TF solitamento sono costituiti da un

dominio di legame con il DNA che ne veicola uno attivatore che si lega al complesso mediatore

che influenzano l’attivazione della polimerasi, il promotore batterico e’ molto piu’ semplice di uno di

un mammifero, quando un retrovirus si integra in un genoma di una cellula eucariotica poiche’ ha

una regolazione molto sviluppata il virus viene trascritto pochissimo poiche’ o si posiziona su un

punto in cui l’efficienza di trascrizione e’ minima o si posiziona su un introne, per valicare questo

ostacolo il virus porta con se’ non solo la trascrittasi inversa ma anche una proteina che riconosce

il 5’ del proprio RNA che si porta un domino d’attivazione molto forte, l’RNA in trascrizione assume

una morfologia via via sempre piu’ irregolare con zone circolari per il processamento con varie

proteine che lo proteggono dalla degradazione, dopo 40 nt la pol si ferma per dare tempo alle

proteine di legare l’RNA, e si legano ancora in trascrizione a spliceosomi, esistono hnRNPs che

provocano la formazione di strutture dell’RNA allungate con testa proteica arrotondata, Rat1p (dal

5’ al 3’ in lievito) ed Rrp6p (in un complesso proteico detto esosoma) proteine esonucleasiche, se

viene effettuata una mutazione in uno dei geni dell’esosoma il meccanismo viene rallentato in

modo sostanziale, se viene mutato Rat1p nel nucleo la cellula muore, mentre nel citoplasma la

cellula sopravvive, a fine traduzione l’RNAP si stacca perche’ l’enzima si mangia il trascritto molto

velocemente il 5’ senza avere un’interazione specifica con RNAP, prevenire la degradazione per

mezzo del mascheramento dell’estremita’ 5’, primo nt spesso e’ una A a cui viene attaccato una G

testa-testa (5&rsq