Biologia molecolare

Biologia molecolare del DNA

La cristallografia utilizza precipitati di composti da analizzare. Sull'analisi cristallografica, il DNA è rappresentato come una X tratteggiata. Pauling pensò al DNA come un acido protonato (in cui il fosfato presenta –OH) e i legami delle basi si formano attraverso l’interposizione di ioni metallici. All’inizio, Watson pensò che i legami idrogeno avvenissero tra molecole simili, una in struttura chetonica e l’altra in struttura enolica (utilizzo della tautomeria). Questa ipotesi portava a irregolarità nella doppia elica non evidenziate nella cristallografia.

La forma A del DNA è data in condizioni di disidratazione, le basi azotate sono composti fortemente idrofobici ed è difficile scioglierle (protonazione della citosina può facilitare lo scioglimento). Nella cellula, queste sono esposte all'acqua e per minimizzare il contatto con l'acqua possono: disporle obliquamente mettendole o in parte a contatto (dispone però gran parte delle basi al contatto idrofilico), oppure sovrapporle parzialmente con una leggera rotazione che porta a un angolo di 32-35° per base, che porta al twist, ovvero i legami fosfodiesterici ruotano (10 basi per un giro completo). I componenti idrofilici (formanti lo scheletro fosfodiesterico) devono essere esposti esternamente alla struttura. L’etidio bromuro è un intercalante nei 6 angstrom del legame fosforico ed è un correttore dell’untwisting in quanto può correggere di 26° il twist.

Nelle conformazioni alternative del DNA, il legame glicosidico tra zucchero e base risulta il fautore. Le proteine riescono ad interagire con il DNA per mezzo del riconoscimento dei solchi (l’80% delle proteine si lega al solco maggiore). La presenza di un solco maggiore e uno minore perché i legami glicosidici risultano più vicini su una faccia e più lontani dall’altra. I legami idrogeno vennero scoperti con la cristallografia delle singole basi azotate.

Lo scienziato Hoogsteen propose dei legami tra le basi differenti dovuti al posizionamento delle purine in opposizione alla conformazione Watson e Crick. Il legame Hoogsteen GC può essere buono per le soluzioni acide in quanto la citosina è protonata e sono meno stabili in quanto utilizzano due legami H. I legami sono Watson e Crick in quanto sono più stabili e sono stabili anche a pH fisiologico.

Il DNA a tripla elica veniva ipotizzato secondo legami WC e anche Hoogsteen (può presentarsi in alcuni intermedi replicativi, come le giunzioni di Holliday, viene stabilizzata da particolari proteine, come RecA, e può essere formata artificialmente con l’utilizzo di oligonucleotidi per scopi terapeutici). Ogni 5 coppie di basi, i solchi si invertono, il twist può cambiare di + o – 20° in base alla sequenza; può presentarsi il propeller twist (rotazione a pale d’elica) in cui entrambe le basi ruotano sul loro asse longitudinale indipendentemente l’una dall’altra per ottimizzare lo stacking con le basi al di sopra e al di sotto.

Questa rotazione provoca stress torsionale ai legami H (tra G-C la torsione è più impedita poiché possiedono 3 legami H). In AT, la rotazione va da 10-30° e tra GC da 5-15°; in sequenze poli-A possono avere un propeller twist più solido e meno esposta a deformazioni strutturali poiché viene a formarsi legami H crociati (cross-bonds) tra un A e una T legata alla A successiva. Abbiamo 6 gradi di libertà tra le coppie di basi (3 traslazionali, in Angstrom, e 3 rotazionali, in gradi) grazie alle deduzioni di Eulero.

Traslazioni alto-basso (asse del twist), front-back, roll-slide, alcuni sono impediti energeticamente: quello dell’asse del twist è impedito a causa della proibizione dello stacking, front-back lo stesso, unico movimento traslazionale è roll-slide in alcune sequenze, detto slide, ed è positivo se la coppia di base sovrastante si muove a sinistra della sottostante e negativa se si muove a destra (+ o - 2 A).

Movimenti rotazionali: nella conformazione B, il twist è destrorso (positivo) con ambito di variazione di + o - 20° (con l’inserzione di molecole additive, ad esempio intercalanti, la variazione può aumentare). Il movimento rotazionale che forma un angolo (di tilt) sull’asse front-back porta alla perdita di stacking da una parte della coppia (il tilt è possibile solo se è generalizzato a svariate coppie di base, apportando un’inclinazione complessiva della molecola; ad esempio, la conformazione A presenta un angolo d’inclinazione di 19°).

L’angolo di roll è permesso ed è positivo quando apre il solco minore e negativo quando apre il solco maggiore (20°, in casi eccezionali anche di 40°) e determina la curvatura del DNA, perciò si hanno 3 gradi di libertà possibili. Lo slide deve esserci per diverse ragioni: quando ci sono sequenze purina-pirimidina-pirimidina-purina (CA/GT) si hanno problemi sterici (steric clash) tra le purine che compromettono il completo stacking (positivo o negativo). Questo comportamento può essere anche dovuto a un aspetto elettrostatico: la coppia GC è sbilanciata ionicamente in quanto le cariche negative sono distribuite prevalentemente sulla G e quelle positive sulla C; più bilanciate sono le cariche della coppia AT.

Lo slide serve per promuovere le forze attrattive delle cariche. Quando si hanno sequenze di questo tipo, lo slide tende a 0 e si ha una tendenza allo slide positivo. Se si hanno sequenze GG/CC, lo slide è sempre diverso da 0 (tra -2 e 1) e solitamente negativo (per la repulsione delle G e delle C), AA/TT hanno roll e slide vicino allo 0 per il terzo ponte crociato. La curvabilità del DNA (dato dalla curva di roll) è fondamentale per molti meccanismi molecolari (nelle strutture nucleosomiche, durante la trascrizione e replicazione causata dalle polimerasi, dal legame della proteina CAP, etc.).

Ci sono curve coerenti che vanno sempre dalla stessa parte e una incoerente in cui si ha una struttura a zig zag. In 4 casi si ha una curva coerente o incoerente:

• 2 punti con un angolo di roll da 45° (sfavorevole dal punto di vista energetico e poco biologico) distanti 10 bp e in questo modo il solco corrispondente non si sposta dalla parte opposta; incoerente quando i roll cambiano di segno.
• Ogni 5 bp si varia l’angolo della stessa misura con segno opposto.
• Il roll ogni 10 bp concerne 2-3 basi contigue e per ogni base l’angolo di roll aumenta.
• Variazione graduale che accompagna la periodicità dei solchi (forma presente nel DNA nucleosomale).

Alcune sequenze sono intrinsecamente curve (AAAAAGCGCGCAAAAGCGC). Quando separiamo il DNA per elettroforesi, esso scorre su dei pori formati dall’agarosio verticalmente; meno lineare è il DNA e più difficoltosa è la corsa e si ferma prima. Si può calcolare da un fattore di ritardo dato dal rapporto tra la lunghezza apparente e quella reale; si accentua il ritardo con l’aumento della concentrazione e diminuisce all’aumentare della temperatura per accelerazione del moto browniano della molecola. Se la curvatura è centrale, il ritardo è maggiore e minore se è laterale a parità d’angolo. Molti promotori batterici hanno una curvatura intrinseca in prossimità dell’inizio di trascrizione.

La DNasi micrococcale riesce a tagliare DNA al di fuori del nucleosoma (sequenze di 147 bp). Con esperimenti condotti da Andrew Travels su eritrociti di pollo (presentano il nucleo a differenza di quelli umani), si è scoperta una piccola occorrenza statistica in alcune sequenze nei nucleosomi: seq d(AATT) vicino alle zone di contatto con l’ottamero mentre le seq d(GGCC) lontano dagli istoni nelle zone di maggiore curvatura e curvatura ogni 10 bp. Conclusione dell’analisi: i nucleosomi una volta legati al DNA si aggiustano la posizione in base a quella che favorisce di più la curvatura della cromatina.

Contatto proteine-DNA

Esistono 2 tipi di contatto proteine-DNA: analogico (una riconoscimento della forma del solco maggiore e minore) e digitale (riconoscimento di specifiche sequenze per la disponibilità di interazioni chimiche caratteristiche per i 2 solchi). Nel solco maggiore viene offerta una maggiore interattività digitale per le coppie GC e AT (tra legami H e idrofobiche). A volte, le alfa eliche tengono fermi le altre subunità che si mettono in contatto digitale col DNA.

Nello zinc-finger, il foglietto beta tenuto tramite lo Zn, che a sua volta tiene due bracci di His, mantiene invece in una posizione geometrica lineare idonea per entrare nel solco maggiore. La curvatura influenza l’interazione delle proteine; la curvatura porta all’interazione di proteine molto lontane sul DNA tra loro. Dopo una prima interazione col DNA di una proteina, per il legame con un’altra proteina bisogna dimostrare un’affinità maggiore per il DNA della seconda.

Curva sigmoide (asse x: concentrazione, asse y: % cooperazione) se si instaura un legame cooperativo. All’inizio, a basse concentrazioni, la cooperazione si innalza lentamente; in seguito si ha una crescita esponenziale della cooperazione fino a giungere a un plateau in cui si ha una saturazione dei siti di legame. La forma A (vista da Franklins e Wilkins in seguito all’analisi di fibre di DNA precipitato in soluzione di etanolo e sale) si ha un idratazione del 40-50% (disidratata), ha una forma più tozza con uno slide maggiore e più corta.

La forma Z del DNA

La forma Z è sinistrorsa, la forma A contiene 11 bp per giro, il solco maggiore è più stretto rispetto alla forma B e quello minore più aperto (forma tozza) poiché le basi sono attaccate al nastro fosfodiesterico in maniera più simmetrica e inoltre l’asse longitudinale forma un angolo di 19° rispetto alle basi. Si trova specialmente in corrispondenza di complessi con proteine ed è simile alla forma del doppio filamento di RNA ed è la struttura assunta dall’eteroduplex DNA-RNA (che si può formare ad esempio durante la trascrizione).

Anche alcune sequenze del DNA (come le poli-A) assumono la forma A (anche in condizioni di normale idratazione). Il DNA in soluzione non è perfettamente in conformazione B perché presenta 10,5 coppie di base per giro e subisce modifiche per il propeller twist. La forma Z, come è stato detto, è sinistrorsa ed è presente soprattutto in eliche che presentano purine e pirimidine alternate (soprattutto nelle coppie GC ripetute, le coppie AT in vitro possono presentarsi in Z ma in vivo è più difficile) in base alla conformazione del legame glicosidico che lega la base sulla posizione 1’ del 2’-deossiribosio: se il legame è anti si ha la conformazione destrorsa, ma si possono trovare legami anti nei residui pirimidinici (C) e sin in quelli purinici (G) che danno luogo all’andamento a zig-zag del DNA Z. In questa conformazione non si riescono a distinguere bene i solchi: in generale, il solco minore è molto stretto e profondo e il solco maggiore è molto appiattito.

La si può trovare nelle regioni metilate del DNA (soprattutto le C metilate che stabilizzano la conformazione in quanto queste permettono un maggiore ingresso dell’acqua all’interno del DNA lasciandola interagire con i gruppi P esterni che fortifica a sua volta l’impalcatura dello scheletro dei Pi) e spesso anche nel DNA complessato a proteine (che probabilmente facilitano l’assunzione della forma, ad es. la topoisomerasi che induce il supercoiling negativo). In soluzione, purine e pirimidine assumono una struttura sinistrorsa se in presenza di elevate concentrazioni di ioni positivi (Sali) che bloccano le cariche dei fosfati.

Un'ulteriore caratteristica che caratterizza la conformazione Z consiste nel supercoiling negativo. Questo tipo di struttura assume un significato fisiologico incerto. Per dimostrare l’esistenza di questa conformazione, lo scopritore Alexander Vinch trovò delle proteine che si legavano al DNA Z. Poi provò che in pazienti affetti da lupus erimatosus sono espressi anticorpi contro il DNA (RNA, RNPs…) tra i quali vi sono alcuni che riconoscono il DNA Z in vitro. Terza prova: utilizzò questi anticorpi per riconoscere dello Z-DNA su cromosomi politenici di Drosophila: dopo aver sottoposto il DNA a un trattamento acido per favorire il distaccamento degli istoni in modo da facilitare la visione delle sequenze GC (non accettata poiché si pensava che l’acidificazione facilitava il processo di aggancio degli anticorpi in seguito alla protonazione delle basi).

Altri esperimenti sono stati fatti su plasmidi superavvolti negativamente su cui può essere indotta la formazione dello Z-DNA e in seguito vengono esaminati i campioni su corse elettroforetiche discriminanti la differenza topologica dei filamenti. È una molecola molto flessibile e possiede dei parametri strutturali che gli permettono cambiamenti topologici in base alle condizioni ioniche e alle interazioni con le proteine.

Telomeri e strutture del DNA

I telomeri sono DNA a singolo filamento ricchi in G che possono formare dei G quartet con legami Hoogsteen che formano delle tipiche piattaforme quadrate sovrapponibili. Le sequenze palindromiche nel doppio filamento possono dare origine a strutture cruciformi con un occhiello alle estremità (in quanto devono essere distanti ameno 4 bp per indurre la loro formazione).

Esiste un altro tipo di acido nucleico sintetizzato artificialmente definito acido peptidonucleico (PNA): il PNA (si pensa che sia la prima forma di acido nucleico utilizzato dalle prime forme viventi) è formato da unità ripetute di N-amminoetil-glicina unite da legami peptidici e le basi sono legate a questo scheletro mediante legami metilene-carbonili. Non avendo nella catena i P, il legame PNA-DNA o PNA-RNA è più stabile e possiede una maggiore specificità di sequenza con DNA complementare: quindi gli accoppiamenti errati risultano molto più destabilizzanti. Sono acidi molto utilizzati poiché non vengono riconosciuti da nucleasi e da proteasi e sono anche stabili a un largo range di pH (possiamo posizionarli ad esempio su un P di un gene o per reprimerlo costitutivamente o per attivarlo).

Topologia e superavvolgimento del DNA

La struttura circolare dei cromosomi procariotici e l'organizzazione in domini del DNA eucariotico, data dall'ancoraggio della fibra all'impalcatura cromosomica o alla matrice nucleare, rendono il DNA in vivo, generalmente, una molecola chiusa e priva di estremità libere. Da questo, o meglio dall'impossibile libera rotazione delle estremità che ne deriva, nasce la possibilità della formazione di superavvolgimenti.

Si ha un superavvolgimento ogni volta che la doppia elica ruotando nello spazio si avvolge intorno al proprio asse. Il superavvolgimento è negativo quando consiste in una rotazione in senso opposto a quello di avvolgimento del DNA, come nel caso del DNA A e B; positivo quando la rotazione è nella stessa direzione dell'avvolgimento del duplex. Nel caso di superavvolgimenti negativi, il DNA si dice sottospiralizzato, mentre è superspiralizzato quando il DNA è avvolto in superavvolgimenti positivi.

Le proprietà topologiche della molecola sono quelle proprietà geometriche che non variano in seguito a deformazione del DNA. La topologia e il grado di superavvolgimento sono descritti mediante l'equazione Lk = Tw + Wr, dove Lk rappresenta il numero di legame che è il numero totale di volte con cui un filamento si incrocia su un altro in una molecola chiusa di DNA. Per convenzione, il numero di legame viene considerato positivo per ogni incrocio dei filamenti nella doppia elica destrorsa; il suo valore è inoltre espresso da un numero intero.

Il numero di legame è composto da Tw (twist number) che è il numero di avvolgimento, ovvero il numero totale di giri d'elica del duplex (Tw = n / A, dove n è il numero di nucleotidi delle molecole ed A il numero di nucleotidi per giro d’elica), nella conformazione B A=10,5, e da Wr (writhing number) o numero di superavvolgimento, che esprime i ripiegamenti dell’asse su sé stesso. Per una molecola rilassata, il numero di legame corrisponde al numero di avvolgimento (Lk = Tw).

Mediante il numero di legame, o meglio, la differenza del numero di legame (dLk = dWr + dTw) è possibile descrivere i cambiamenti topologici del DNA. Il numero di legame è proprietà intrinseca del duplex e non può cambiare a meno che si verifichino rotture dei filamenti. Le interconversioni fra i vari topoisomeri, mediante reazioni di taglio, svolgimento o avvolgimento della molecola e ricongiunzione delle estremità tagliate, avvengono ad opera delle DNA topoisomerasi.

Molecole di DNA identiche a meno del numero di legame vengono dette isomeri topologici o topoisomeri e sperimentalmente possono essere separate ricorrendo a tecniche di elettroforesi: una molecola di DNA rilassata, infatti, migra più lentamente della sua corrispondente superavvolta, a causa del diverso comportamento idrodinamico.

Conseguenze del superavvolgimento del DNA

La molecola superavvolta è ad un livello energetico superiore rispetto a quella rilassata e il superavvolgimento è considerabile come una riserva di energia. Processi quali replicazione, trascrizione e ricombinazione, richiedono uno svolgimento locale del DNA; qualsiasi forza torsionale che agevola lo svolgimento faciliterà la realizzazione di questi processi.

L’energia in eccesso, posseduta dal DNA superavvolto negativamente, può essere utilizzata per fornire l’energia necessaria a separare la molecola nei due filamenti che la compongono o, almeno, per dare l’avvio a tale processo. In altri termini, il superavvolgimento negativo, avendo verso opposto rispetto all’avvolgimento del DNA destrorso, causa una diminuzione delle costrizioni topologiche permettendo al DNA di subire transizioni strutturali che non potrebbe compiere se fosse rilassato. Il grado medio di superavvolgimento, stimato intorno ad uno ogni 200 paia di basi, fluttua lungo il genoma. Una misura del grado di superavvolgimento è rappresentata dalla densità di superelica sigma.