Biologia Molecolare e Metodiche del DNA ricombinante

Il coefficiente di estinzione e la concentrazione della molecola in esame

Il coefficiente di estinzione è generalmente riportato come coefficiente di estinzione molare o millimolare, che rappresenta l'assorbimento di luce UV nel caso delle proteine presentato in una molare o una millimolare. Nel caso degli acidi nucleici il coefficiente di estinzione non può essere espresso in termini molari o millimolari per un semplice motivo: il peso molecolare degli acidi nucleici è spesso eterogeneo e per questo non c'è un valore di riferimento che possa essere utilizzato ai fini della concentrazione. Preparare una soluzione di 1 molare di cloruro di sodio, ad esempio, starebbe a dire prendere una mole e scioglierla in un litro di acqua, ma a questo punto quanto cloruro di sodio dovremmo prendere? Una mole di cloruro di sodio a quanti grammi corrisponde? Consideriamo.Il peso molecolare, che è 58,44 grammi di cloruro di sodio da sciogliere in un litro d'acqua per avere una molare di NaCl. Se si prende in considerazione un acido nucleico allora non parleremo di coefficiente di estinzione molare ma coefficiente di estinzione percentuale. I coefficienti di estinzione percentuali a 200 nm sono pari a 200 O.D./cm per il DNA e 240 O.D./cm per l'RNA (O.D./cm = Densità Ottiche per centimetro). Ipotizziamo di avere un campione di DNA e vogliamo stimare la sua concentrazione. Come proseguiamo? Facciamo una lettura dello spettrofotometro a 260 nm, così che misuriamo l'assorbimento. Poi dividiamo il valore di assorbimento per il coefficiente di estinzione noto (200 O.D./cm), moltiplichiamo il tutto con il percorso ottico (1 cm) ed avremo il risultato sperato con la concentrazione del DNA in esame. Denaturazione termica del DNA e determinazione della temperatura di fusione. Per denaturazione del DNA si intende la perdita della sua.struttura secondaria, cioè la separazione delle due catene polinucleotidiche. La denaturazione del DNA può essere indotta con un aumento della temperatura. La molecola di DNA è stabilizzata da forze idrofobiche tra le basi che si susseguono e da legami ad idrogeno tra purine e pirimidine. Al di sopra degli 80° l'energia termica sarà tale da far separare i due filamenti di DNA, denaturando la molecola. Dalla figura qui riportata vediamo che l'assorbimento di luce ultravioletta è superiore per una molecola a singolo filamento in nanometri rispetto ad una molecola a doppio filamento. In questi casi la denaturazione porterà a ciò che viene chiamato effetto ipercromico, la denaturazione mediante assorbimento dipendente dalla temperatura, utile per monitorare il processo di denaturazione termica. Possiamo stabilire, grazie allo spettrofotometro, se ci sarà assorbimento di DNA di luce ultravioletta senza però considerare il variaredella lunghezza d'onda, ma solo il variare della temperatura. La lunghezza d'onda singola sarà sempre 260 nm. Notiamo in questa diapositiva che con l'aumentare della temperatura l'assorbimento di raggi UV rimane costante fino a quando non arriveremo agli 80° stabiliti, dove osserveremo un picco veloce di assorbimento. *Tm = Melting temperature, temperatura di "scioglimento", quindi denaturazione. Il valore scritto per Tm nella figura è un valore fin troppo basso. La regola standard è riscaldare il campione di DNA a 94° per un minuto, dato che si è sicuri che a quella temperatura e in quel lasso di tempo il DNA sarà denaturato. Predire la Tm: effetto del contenuto in GC e della forza ionica In questa figura sono riportati i profili di transizione termica di tre campioni di DNA che presentano nel primo caso un contenuto in GC pari al 35%, nel secondo caso un contenuto in GC pari al 50% e nel terzo al 66%. Laddove il contenuto in

GC è più basso, la temperatura sarà conseguentemente più bassa; ciò spiega i restanti due esempi con diverse percentuali. All'aumentare delle coppie GC aumenterà anche la stabilità della doppia elica e maggiore dovrà essere la temperatura per denaturare il DNA. La stabilità della doppia elica non dipende solo dal contenuto in GC ma anche dalla forza ionica del solvente, in particolare dei cationi: Sulla sinistra è rappresentata una doppia elica di DNA. Ciascun asse della "scala a pioli" raffigura una catena nucleotidica, mentre gli "scalini" stanno a simboleggiare le coppie di basi. I segni "-" indicano che la molecola di DNA sia un polianione, cioè una molecola costituita da numerose cariche negative, infatti è presente una carica negativa per ogni gruppo fosfato. Le cariche negative dei gruppi fosfato tendono a respingersi tra di loro e rappresentano quindi un fattore.

intrinseco di instabilità del DNA, permettendo alla molecola di denaturarsifacilmente. Ciò non avviene dato che le forze stabilizzanti (interazioni idrofobiche e legami aponte di idrogeno) sono molto più intense. Se il DNA dovesse essere esposto aconcentrazioni saline, i cationi, legandosi ad esso, andranno a contrastare le carichenegative e riducono le repulsioni intramolecolari (tra i due filamenti). Quindi si andrà astabilizzare la doppia elica e inizierà la denaturazione solo a temperature elevate.Alcuni ricercatori hanno provato a rendere più quantitativi questi valori: dopo vari esperimentifu ricavata una formula che ha dato dimostrazione a questi fenomeni.Da questa formula possiamo notare la proporzionalità fra il contenuto in GC e latemperatura di fusione, così come anche per la forza ionica secondo un valorelogaritmico. Questa equazione descrive l’effetto della forza ionica e del contenuto inGC sulla Tm.

L'equazione può essere utilizzata per predire la Tm di una molecola di DNA. L'utilizzo di questa formula è essenziale dal momento che decidiamo di studiare quantità di DNA estremamente piccole, anche solo per farne una stima. La soluzione dell'esercizio mostra un valore secondo il rapporto percentuale GC del 40%, ma se avessimo a che fare con una percentuale leggermente più alta, ad esempio 50% (come nell'Escherichia coli) allora avremo una temperatura finale di 88,4 °C. Rinaturazione del DNA Abbiamo visto che la denaturazione del DNA avviene mediante temperature abbastanza elevate da far separare i due filamenti polinucleotidici. Per permettere la rinaturazione del DNA è necessario far abbassare la temperatura al di sotto del punto di fusione per permettere il ricongiungimento dei filamenti. Inizialmente, la riformazione della doppia elica riguarda solo una piccola parte dei due filamenti. Questo dimostra, quindi, che la denaturazionedel DNA è un processo reversibile dipendentemente dalla temperatura a cui l'acido nucleico è esposto. Ciò non vale però per alcune proteine che potrebbero perdere solubilità e tendono ad aggregarsi fra di loro formando dei precipitati amorfi: un esempio veloce è quello della cottura dell'uovo, dove la denaturazione di proteine alimentari (albumina) non può essere reversibile. La velocità di rinaturazione, nel caso del DNA, è influenzata notevolmente dalla temperatura. La velocità massima di rinaturazione si realizza ad una temperatura di circa 20 gradi inferiore rispetto alla temperatura di fusione, senza però scendere troppo. Precipitazione degli acidi nucleici con sali ed etanolo Gli acidi nucleici sono molecole estremamente solubili in acqua, dato che possono creare facilmente numerosi legami a ponte di idrogeno con l'acqua; infatti, le catene polinucleotidiche sono ricche di atomi fortemente.

Elettronegativi (ossigeno e azoto). Variando le condizione della soluzione è possibile indurre gli acidi nucleici un processo di disaggregazione e precipitazione: in opportune condizioni sperimentali le molecole di acido nucleico piuttosto che interagire con il solvente iniziano ad interagire fra di loro formando un precipitato, cioè degli aggregati macromolecolari che "precipitano" (da questo il termine precipitato) sul fondo della provetta. La precipitazione può essere anche velocizzata se si fa uso di un processo di centrifugazione. Come è possibile che gli acidi nucleici formino questi aggregati? Occorre cambiare drasticamente le condizioni della soluzione, aggiungendo un sale, l'acetato di sodio 0,3 molare, e 2,5 volumi di etanolo (alcool etilico).

L'effetto del sale sarà evidente: nell'immagine in alto osserviamo due acidi nucleici in repulsione intramolecolare per via delle cariche negative vicine, rendendole ben solubili in acqua.

Se andassimo ad aumentare la forza ionica, la presenza dei cationi non solo stabilizzerà la doppia elica come visto in precedenza per la temperatura di fusione ma ridurrà anche la repulsione intermolecolare, facilitandone l'unione. Ricordiamo però che la sola aggiunta di sale non basta; l'utilizzo di etanolo in volumi così elevati permette la riduzione di concentrazione dell'acqua, interbidendola, e realizzando ancora più velocemente aggregati molecolari. A che scopo permettere la precipitazione?

1. Concentrare ed isolare l'acido nucleico.
2. Cambiare solvente.
3. Separare l'acido nucleico da nucleotidi liberi.

Tecniche di base per l'analisi del DNA・Lezione

Elettroforesi su gel di agarosio

L'elettroforesi su gel di agarosio è una metodica per la separazione e l'analisi di molecole di DNA o RNA sotto l'influenza di un campo elettrico. In questa diapositiva è mostrata una vaschetta

no anche una maggiore massa, quindi la loro velocità di migrazione è influenzata da entrambi questi fattori. Inoltre, la velocità di migrazione dipende anche dalla dimensione dei pori presenti nel gel di agarosio o poliacrilammide utilizzato nella vaschetta elettroforetica. I pori più piccoli rallentano la migrazione delle molecole più grandi, mentre le molecole più piccole possono attraversare i pori più facilmente e migrare più velocemente verso il polo positivo. In conclusione, durante l'elettroforesi del DNA, le molecole si separano in base alle loro dimensioni e alla loro carica elettrica. Le molecole più grandi e cariche migrano più lentamente, mentre le molecole più piccole e meno cariche migrano più velocemente. Questo processo consente di separare e analizzare il DNA in base alle sue caratteristiche fisiche.