Biologia Molecolare e Metodiche del DNA ricombinante

Le forme del DNA

La biologia molecolare è una branca della biologia che studia le basi molecolari delle funzioni biologiche, ponendo particolare attenzione a quei processi che coinvolgono gli acidi nucleici. Argomenti centrali della biologia molecolare sono ad esempio:

• Lo studio della struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche (proteine e acidi nucleici), come ad esempio lo studio della proteina spike del coronavirus,
• L'analisi delle relazioni che intercorrono tra la struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche e le funzioni da esse svolte (cioè comprendere il rapporto struttura-funzione),
• Le interazioni molecolari,
• Lo studio dei genomi e dei loro meccanismi di replicazione,
• I processi di trascrizione e traduzione dell'informazione genica.

La nascita della biologia molecolare risale al 1953 quando Francis Crick e James Watson definirono la struttura tridimensionale del DNA. Grazie all’aiuto di Chargaff e Rosalind Franklin, da questi primi dati si poté studiare più approfonditamente il DNA anche nelle forme complesse che poteva assumere, la composizione delle basi e i legami tra di essi. Chargaff ipotizzò un numero equivalente di basi, Franklin invece riuscì a fare enormi progressi nell’ambito dei raggi X e della loro diffrazione per un accurato studio della macromolecola. I loro risultati furono pubblicati sui giornali più prestigiosi e furono considerati come i primissimi scopritori della struttura degli acidi nucleici.

Il gene contiene l'informazione di una specifica proteina, che una volta formata avrà una particolare struttura tridimensionale. Secondo il dogma centrale della biologia, il DNA avrà la possibilità di replicarsi e di trascriversi con l’aiuto di RNA messaggero e, consequenzialmente, quest'ultimo, una volta tradotto, darà origine a proteine utili in tutta la cellula. Ogni amminoacido che costituisce un’intera proteina è dotato di legami laterali, permettendo alla stessa proteina di avere una particolare forma tridimensionale, dato anche l’ordine con cui questi amminoacidi sono collegati (l’ordine degli amminoacidi è detto sequenza amminoacidica primaria).

Localizzazione del DNA

Dove è localizzato il DNA? Dipende: in una cellula eucariotica, il DNA è situato quasi interamente all’interno del nucleo, questo delimitato da una membrana nucleare, nei procarioti invece la molecola è a diretto contatto con il citoplasma e occupa una regione del citoplasma batterico definita nucleoide. Nel nucleo il DNA è costituito da proteine istoniche, viene colorato da coloranti basici ed è complessato fino ad occupare un certo quantitativo di spazio. Le proteine istoniche formeranno la cromatina, definita in due tipologie:

• Eucromatina (meno compressa e colorata debolmente)
• Eterocromatina (più compressa e colorata vivacemente)

Il DNA contenuto nell’eterocromatina è trascrizionalmente inattivo, mentre il DNA dell’eucromatina sarà trascrizionabile. Nel processo di mitosi, la cromatina si addenserà per dare forma ai cromosomi, costituiti da due cromatidi uniti al livello del centromero. Le porzioni finali dei cromatidi si chiamano telomeri. Ogni cromatidio contiene un filamento di DNA di centinaia di milioni di nucleotidi. Il genoma nucleare è formato da molecole di DNA lineare; quante sono queste molecole? Nell’uomo sono 46.

Nel caso delle cellule eucariotiche, una piccola quantità di DNA è localizzata all’interno dei mitocondri. I mitocondri sono dotati di un proprio genoma con numerose copie di DNA circolare. Come hanno fatto i mitocondri ad avere un proprio DNA specifico? Dall’endosimbiosi, il mitocondrio era in passato un batterio con materiale genetico singolare proprio. Come mostrato nell’immagine inerente alla forma del DNA mitocondriale circolare, con 17,000 basi circa, è possibile osservare alcune strutture rettangolari che corrispondono a geni che codificano proteine per il complesso respiratorio (in rosso) e geni trascritti in RNA ribosomiali (in verde). Le piccole palline blu testimoniano la presenza di geni per RNA di trasporto che serviranno per la sintesi proteica. ATTENZIONE: guardando la struttura, si consideri che molti argomenti sono tra loro collegati e non sempre è possibile studiare in processione lineare in base logica. Alcuni argomenti saranno studiati più accuratamente solo dopo aver imparato concetti alla base o superiori in termini di programma e difficoltà scolastica. I mitocondri sono organelli semiautonomi perché possono formare solo una parte delle proteine che necessitano, l’altra parte invece è codificata dal genoma nucleare e dal citoplasma.

Nelle cellule eucariotiche quindi il DNA è circolare con svariate milioni di basi. I plasmidi, piccole molecole di DNA circolari, non sono essenziali alla vita del batterio ma quando sono presenti conferiscono resistenza agli antibiotici (grande vantaggio) come nel caso dell’ampicillina che inibisce la sintesi della parete batterica, non permettendo al batterio di crescere e dividere. Ma grazie alla presenza di plasmidi, i batteri possono aggirare questo antibiotico con la insita proprio nel-lattamasi, plasmidio, che produce un gene che idrolizza la ampicillina.

I virus

I virus sono parassiti endocellulari. Essi possono replicarsi soltanto all’interno di una cellula ospite; esistono virus che infettano specificamente cellule eucariotiche e non. Il virus dell’epatite B ad esempio infetta specificamente gli epatociti. Questa preferenza di attacco è dovuto dalla presenza di determinati recettori proteici, imparando a mediare zona di attacco nella cellula ospite (ad esempio la proteina spike che è in grado di interagire solo con il recettore dell’angiotensina ll degli alveoli polmonari). I virus sono dotati di genoma di DNA o RNA, equamente spartiti in natura, racchiusi in un rivestimento proteico detto capside con geometria icosaedrica (come nel caso del batteriofago). Invece nel caso dei virus che attaccano prevalentemente le cellule eucariotiche, il materiale genetico è circondato da un’altra struttura di rivestimento chiamato envelope, un sacchetto costituito da proteine e lipidi.

Cos'è un gene?

Un gene è una porzione segmentata di DNA che codifica una proteina specifica. Più precisamente, esistono tantissimi altri geni che sono trascritti in RNA funzionale (Ribosomale, Trasporto e Messaggero). Per informazione genica si intende l’esatta sequenza delle basi dell’acido nucleico, cioè alla sequenza nucleotidica del DNA. Parlando di geni nel dettaglio, è fondamentale specificare anche le definizioni di genoma, trascrittoma e proteoma:

• Genoma ⇒ Intero contenuto di DNA di una cellula,
• Trascrittoma ⇒ Contenuto di RNA, cioè l’insieme dei trascritti,
• Proteoma ⇒ Contenuto proteico complessivo di una cellula.

L'informazione del genoma viene trascritta e successivamente tradotta. A questo punto, si ricordi di alcune caratteristiche tipiche di embriologia: formazione dello zigote, foglietti embrionali e strutture complesse. Lo sviluppo cellulare permette alle cellule di differenziarsi a seconda della natura delle proteine formate dal DNA, permettendo di svolgere più funzioni diverse tra loro (ad esempio cellule sanguigne, muscolari e scheletriche). In un singolo individuo, come ad esempio in un essere umano, è presente sempre lo stesso unico genoma dallo zigote all’adulto; ogni specie cellulare nell’uomo ha lo stesso genoma. Alcuni geni si possono “disattivare” se la cellula non si trova in zone specifiche dove la codifica di quello stesso gene è necessaria per la creazione di proteine utili. Quindi, il genoma di una cellula è unico, al contrario di trascrittomi e proteomi che possono essere molteplici.

Le unità di misura tipiche nella biologia molecolare sono il milligrammo e il microgrammo, nel caso della massa delle componenti microscopiche, e la lunghezza, determinata in coppie di basi di ogni nucleotide di cui fanno parte i geni. Il numero delle coppie di base cambia a seconda della cellula di cui si fa riferimento. Prendiamo in considerazione tre esempi facili:

• Escherichia coli: questo batterio ha un genoma costituito da 4 mbp (megabasi), cioè 4.000.000 coppie di basi situate in un singolo gene e sono presenti almeno 4.000 geni, il che vuol dire che la distanza minima tra un gene è l’altro è di 1.000 coppie di basi.
• Eucarioti (lievito): il genoma della cellula di lievito è lungo 12.000 coppie di basi in 6.000 geni e i geni sono lontani l’uno dall’altro all’incirca 2.000 coppie di basi.
• Uomo: 30.000 geni diversi, costituito da un genoma di 3 miliardi di coppie di basi.

Nell’uomo, la porzione di basi che codifica una proteina è solo del 5% rispetto al totale. Il resto è DNA intergenico.

La cristallografia a raggi X

La cristallografia a raggi X è una metodica alquanto complessa che viene utilizzata soltanto in laboratori specializzati. Si tratta di poter rappresentare tridimensionalmente una macromolecola biologica con tutti gli atomi di cui è costituita per comprendere la loro funzione e la loro composizione atomica; questo può valere per gli acidi nucleici come può valere per le proteine. Questa metodica viene espletata attraverso una serie di fasi:

• Cristallizzazione della molecola = molte molecole sono solubili in acqua, come gli acidi nucleici e le proteine, formando legami a idrogeno. Per cristallizzare una macromolecola bisogna indurre le molecole ad unirsi fra di loro e a disporsi a formare un reticolo cristallino disponendosi in maniera ordinata, sempre con la stessa distanza ed orientamento. Il più delle volte capita che queste macromolecole non si raggruppano in maniera ordinata ma disordinata, a formare il cosiddetto aggregato amorfo, creando una sorta di polvere sedimentata su una provetta (a quel punto si parla di precipitato). Il precipitato amorfo non servirà ai fini della tecnica cristallografica e per evitare di far precipitare una molecola devono avvenire vari tentativi di sperimentazioni (es. mioglobina e solfato di ammonio in piccole percentuali).
• Diffrazione ai raggi X = il cristallo viene investito da un fascio di raggi x. Alcuni di questi fasci colpiranno in pieno il cristallo, mentre molti altri verranno deviati (diffratti) dalle nubi elettroniche della molecola in esame (più precisamente saranno gli elettroni a respingere i raggi). Si formerà quindi il diffrattogramma, costituito da una serie di punti che rappresenta una singola molecola osservata.
• Calcolo delle mappe di densità elettronica = esistono dei programmi capaci di esaminare questi diffrattogrammi per risalire alla disposizione nello spazio delle nubi elettroniche che hanno deviato i raggi X. Queste mappe si presentano attraverso una serie di linee e hanno un aspetto simile alle mappe topografiche costituite da rilievi e valli.
• Collocazione spaziale della molecola = è l’ultima fase che riguarda il controllo della forma molecolare tridimensionale della proteina, considerando l’ordine degli amminoacidi.

Come può il cristallografo riportare i risultati della propria ricerca? In che modo la struttura tridimensionale di una molecola può essere riassunta e comunicata alla comunità scientifica? Utilizzando una terna di assi cartesiani e analizzando la struttura molecolare da questi 3 assi (X,Y,Z) ottenendo delle coordinate atomiche. Per capire meglio questo concetto bisogna analizzare un file cristallografico, un elenco di atomi. Oltre che a rappresentare la molecola cristallizzata nel suo spazio, la cristallizzazione può anche servire per evidenziare le interazioni atomiche che la molecola compirebbe in rapporto enzima-substrato, osservando ad esempio quali sono i residui amminoacidi e gli inibitori dell’attività enzimatica (come con la trascrittasi inversa dell’HIV).

Modelli cristallografici, legami ed interazioni molecolari

In base a ciò che si è visto nella lezione precedente, la terza lezione riguarderà le metodologie di rappresentazione dei cristalli in modellistica tridimensionale. Quali tipi di modelli si possono visualizzare per osservare le macromolecole biologiche? Un primo modello è il cosiddetto modello a nastro, in cui gli elementi di struttura secondaria vengono osservati proprio come dei nastri, usando un nastro a spirale per le α-eliche ed un nastro disteso per le catene β. Questo è un modello molto semplice dato che non si vedono tutti gli atomi della molecola, ma solo il ripiegamento dello spazio della catena polipeptidica.

Come si può chiaramente osservare, oltre che essere una rappresentazione puramente descrittiva e semplice è anche povera di dettagli, serve solo a tenere d’occhio il folding della molecola in foglietti beta e alfa. Un altro metodo è quello a sferette e bastoncini in cui è possibile osservare tutti gli atomi della molecola. Gli atomi vengono rappresentati di diversi colori caratteristici legati tra loro da bastoncelli che rappresentano invece le interazioni covalenti. È molto utile per cogliere la geometria della molecola e le ibridazioni atomiche rispettive.

Un altro modello ancora è il modello basato sulle superfici di Van der Waals, in cui si nota che le dimensioni degli atomi della molecola sono di dimensioni effettive, cioè le loro “vere” dimensioni. Le superfici di Van der Waals sono superfici sferiche in cui il raggio atomico corrisponde al raggio di Van der Waals prendendo in considerazione le forze attrattive atomiche. La polarizzazione tra due atomi adiacenti è detta dipolo indotto: la forza attrattiva diminuisce al diminuire della distanza e raggiunge un valore massimo quando la forza di Van der Waals stessa è massima. A questo punto le nubi elettroniche si compenetrano ed iniziano a respingersi. Ricordare che il raggio di Van der Waals è riportato in Angstrom (Å). Da subito, guardando un grafico del modello di Van der Waals, si nota che la tridimensionalità degli atomi è ben visibile, ma non si può dire lo stesso dei legami.

Il modello successivo è il modello utilizzato per le superfici assorbente accessibile ad una molecola. Questa tecnica si svolge attraverso l’uso di una sferetta di acciaio di 1,8 Angstrom che rappresenta una molecola di acqua. Nell’immagine sotto le sferette blu (il solvente) delineano la forma della molecola in sferette verdi (carbonio) e simulano una molecola di acqua che si sta muovendo sulla superficie della molecola tracciando un contorno (la superficie rossa). La parte verde che non viene toccata dalle sferette blu non sarà osservabile né considerabile da un cristallografo. Il modello può essere arricchito riportando i valori elettrostatici superficiali della molecola, formando immagini al computer. Se la carica netta elettrostatica è negativa, si osserveranno sfumature bianche, se invece la carica dovesse essere positiva allora il colore diventerebbe blu (anche a seconda dell’intensità della carica). Gli amminoacidi acidi sono visti di colore rosso.

I legami e le interazioni molecolari

I legami a ponte di idrogeno sono interazioni elettrostatiche tra un atomo fortemente elettronegativo (ad esempio azoto o ossigeno) ed un atomo di idrogeno che è legato ad un secondo atomo elettronegativo. Come specificato già nella definizione, l’idrogeno farà “da ponte” tra due atomi elettronegativi che possono essere 2 atomi di azoto o 2 atomi di ossigeno o anche 1 di azoto e 1 di ossigeno utilizzando un legame covalente ad uno dei due atomi, definito donatore, mentre l’altro atomo è definito accettore. Va considerato che l’azoto e l’idrogeno hanno elettronegatività differenti (l’azoto avrà carica frazionaria negativa dato che è più elettronegativo, mentre l’idrogeno avrà carica frazionaria positiva).

Tipicamente, un legame a ponte di idrogeno viene rappresentato da una linea tratteggiata (osserva la figura sottostante) e sono lunghi all’incirca 3 Angstrom (più di un legame covalente). L’energia di questo legame dipende molto dalla sua geometria: la forza è massima quando i tre atomi sono collineari, cioè giacciono sulla stessa retta. Svolgono un ruolo essenziale nella stabilizzazione dei legami delle proteine. Nel caso degli acidi nucleici, i legami servono ad unire le basi azotate del DNA formando la struttura secondaria della molecola.

Le interazioni idrofobiche sono delle forze attrattive che si stabiliscono tra gruppi chimici apolari in ambiente acquoso. Se versiamo dell’olio in acqua, i due fluidi non si uniranno mai, dato che le molecole di olio hanno una scarsa propensione a fare legami con molecole d’acqua proprio per interazioni idrofobiche (contro l’acqua). Come possiamo osservare, le molecole apolari non si uniranno alle molecole polari, anche se fossero a diretto contatto con l’acqua, e questo mancato legame causa una differenza entropica, facendo sì che lo stato delle molecole sia più disordinato rispetto ad un legame a idrogeno formato. Le interazioni idrofobiche si stabiliscono tra le molecole o i gruppi apolari che venendo a contatto liberano molecole di acqua aumentando l’entropia del sistema.

La struttura degli acidi nucleici

Il DNA e RNA sono molecole polimeriche formate da catene di nucleotidi. Un nucleotide è formato da un pentoso (uno zucchero a 5 atomi di carbonio), al quale sono legati una base azotata ed uno o più gruppi fosfato. Si osservi la posizione dei carboni e dei gruppo fosfati legati al carbonio 5’ dello zucchero. Nell’RNA il pentoso corrisponderebbe al ribosio e in posizione 2’ sarà presente un...