Biologia molecolare

BIOLOGIA MOLECOLARE

studia natura dei fenomeni biologici a livello molecolare

nasce nel 1953 con Watson e Crick

PROGETTO GENOMA UMANO (sequenziare il DNA umano)

- solo il 2% sono geni e le regioni codi can sono ancora meno

- l’espressione dei geni dipende anche dall’ambiente

MEDICINA MOLECOLARE: cerca cause gene che/molecolari di varie patologie per sviluppare

terapie mirate e personalizzate

GENOMA: insieme delle informazioni gene che che cara erizzano un organismo

TRASCRITTOMA: insieme dei trascri codi can e non prodo da una determinata popolazione

cellulare

PROTEOMA: insieme delle proteine prodo e da una determinata popolazione cellulare

fenomeni EPIGENETICI: non cambiano la sequenza di DNA ma la sua capacità di esprimersi

CLONAGGIO DNA

clonare = o enere una popolazione di molecole iden che alla molecola di partenza

DNA RICOMBINANTE: DNA da clonare + ve ore (taglia con lo stesso enzima + DNA ligasi)

VETTORI: plasmidi - virus - repliconi - cromosomi ar ciali

PLASMIDI:

- molecola circolare superavvolta

- usano l'apparato di duplicazione del DNA dell’ospite

- non entrano nel cromosoma ba erico

- hanno origine di replicazione ba erica (replicazione indipendente dalla cellula)

- hanno marcatore di resistenza (per resistenza all’an bio co)

- sito mul plo di clonaggio (poli-linker): regione ingegnerizzate per inserire DNA da clonare

ha si di riconoscimento per mol enzimi di restrizione

- inser no a 12/15kb: a volte sono + grandi del ve ore stesso

limi : - può contenere poco DNA

- la trasformazione non avviene in modo e ciente

- le colonie possono crescere a bassa densità (inibizione da conta o)

FAGO LAMBDA:

- inie a il suo genoma all'interno del ba erio

- Lineare: braccio destro e braccio sinistro sono coesivi tra loro

- DNA ller = necessario a nché il DNA sia abbastanza lungo x essere inglobato nel capside

risolve il problema della trasformazione e dell'inibizione da conta o

CROMOSOMI ARTIFICIALI: riproduce la stru ura di un cromosoma ba erico che può contenere

no a milioni di basi ma con le cara eris che di un plasmide (BAC-YAC)

Verrà duplicato ogni volta che la cellula dovrà dividersi (fase S)

ENZIMI DI RESTRIZIONE (endonucleasi di po II):

- tagliano sequenza palindromiche di 4-6-8 nucleo di

- genera estremità complementari/ coesive

- può fare taglio ne o (blunt) o sfalsato➝ le ne e possono unirsi a estremità di altri enzimi

non possono + essere separate da nessuno dei 2 enzimi

la ligasi è + debole (manca legame tra basi compl.)

meccanismo di difesa da DNA estranei

il cromosoma ba erico non viene a accato perché il suo DNA è stato METILATO

tecnica: ve ore plasmidico

isolare plasmide: dissolvo membrana ba erio con detergente SDS

✦ sali fanno precipitare proteine (+ DNA genomico), poi RNAasi x eliminare RNA,…

✦ ➝

tagliare con lo stesso enzima di restrizione il DNA e il ve ore si appaiano: DNA ricombinante

✦

fi tt

ti ti

fi fi ti tt tt tt tt ffi tt tt tt tt

tti fi tt ti tt ti tt ti

fi tt

ti ti

tt tt ti ti ffi ti tt ti

ti fi ti ti tt ti tt tti tt tt tt ti

inserire DNA ricombinante in un sistema cellulare appropriato (ba erio)

✦ TRASFORMAZIONE: soluzione di calcio cloruro crea micro pori x far entrare plasmide nel ba erio

✦ il ba erio si replica e forma colonie

✦ la resistenza all'an bio co ci perme erà di selezionare i ba eri che hanno preso il plasmide

✦

tecnica: ve ore fagico

L'inserto si sos tuisce al DNA ller nel genoma virale per creare DNA ricombinante

✦ (impacche ato dentro virus)

I ba eri in coltura liquida vengono infe a dai fagi

✦ Il ba erio trascrive il DNA virale e sinte zza proteine per la replicazione e per il capside

✦ I ba eri infe verranno messi su piastra semi solida

✦ L'infezione causerà la lisi dei ba eri che rilasceranno i nuovi virus nell’ambiente

✦ I virus rilascia andranno infe are i ba eri adiacen (placche di lisi)

✦

ELETTROFORESI

DNA tagliato con enzimi di restrizione creando frammen (lo stacco dal ve ore)

✦ DNA scorre a raverso lastra di gel so oposta a campo ele rico

✦ spesso c’è soluzione tampone ricca di ele roli che conducono corrente ele rica

✦ I frammen si divideranno in base al loro peso molecolare, lunghezza, forma

✦ una molecola super avvolta e più veloce di una lineare

le bande saranno visibile grazie al marcatore che è illuminato con luce UV è uorescente

✦

(es: bromuro di e dio si intercala tra le molecole degli acidi nucleici)

dall’ele roforesi di un DNA ricombinante dovrei o enere 2 bande (plasmide+inserto) altrimen

✦ signi ca che il plasmide era vuoto

x iden care un inserto sconosciuto: MAPPATURA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

✦ taglio il plasmide con diversi enzimi per determinare la presenza/posizione di si di restrizione

LADDER: marcatore di peso molecolare

è un campione di DNA pre preparato contenente frammen di grandezza conosciuta usa

come riferimento per determinare il peso molecolare dei frammen che voglio analizzare

LIBRERIE GENOMICHE

collezione completa di frammen di DNA che coprono l’intero genoma (esoni e introni) di una

specie ciascuno inserito singolarmente in un ve ore di clonaggio

processo con ve ore plasmidico:

puri co DNA + digerisco con enzima di restrizione + inserisco nel ve ore + piastro

✦ dato che la formazione di cloni è casuale verrà piastrato circa il triplo del genoma

✦ ogni molecola è tagliata in modo casuale dagli enzimi

✦ per ricostruire la sequenza bisogna sovrapporre frammen in modo da individuarne l’ordine

✦

processo con fago λ:

taglio DNA con Sau3A poichè crea estremità complementari all’enzima BamH1 (taglia virus)

✦ packaging in vitro del DNA ricombinante

✦ infezione di ba eri piastra

✦

Per il DNA umano uso Sau3A (riconosce 4 basi) perchè crea frammen lunghi

Per il fago uso BamH1 perchè taglia sono 1 volta e genera i due bracci (Sau3A lo farebbe a pezze )

LIBRERIE DI cDNA

collezione di cloni di tu e le specie di mRNA (copiate in cDNA), anche quelle + rare, espresse in un

dato tessuto in una data condizione (dai cloni possiamo derivare dire amente la proteina)

possiamo capire quali geni sono espressi e studiare le sequenze amminoacidiche (mutazioni)

processo:

tt fi

tt

tt fi

tt ti tt fi tt

ti tt tti tt ti tt ti tt ti ti ti

tt ti tt fi tt ti tt tt tt ti tt tt ti ti tt tt ti ti ti tt tt tt tt ti tt

ti tt tt

fl ti ti tt ti tti ti

si scelgono cellule di un determinato po cellulare

✦ lisi cellule con un potente denaturante che rompa la membrana e denaturi le proteine

✦ (altrimen le ribonucleasi degraderebbero l’RNA)

faccio precipitare RNA con soluzioni speci che x poterlo estrarre

✦ separo mRNA dagli altri RNA: so opongo RNA a sequenza ricche di Oligo-dT ( midina) così solo

✦ le code di poli-A degli mRNA si legheranno

in vitro retrotrascriviamo mRNA in cDNA tramite trascri asi inversa puri cata da retrovirus

✦ (Oligo-dT funge da primer per la trascri asi inversa) ➝

inizialmente o engo molecola eteroduplex (RNA+DNA) RNAasi o NaOH degradano RNA

✦ cDNA a singolo lamento si ripiega formando ansa al 3’ che fa da primer x sintesi del 2° lamento

✦ ➝

nucleasi elimina l’ansa si forma cDNA a doppio lamento

✦ ➝

creo DNA ricombinante: uso linkers contengono si x enzimi di restrizione (il cDNA non li ha)

✦ inserisco DNA ricombinante in coltura ba erica x clonarlo

✦ ➝

problema: la trascri asi inversa dopo un tot. sme e di funzionare abbiamo tan 3’ e pochi 5’

(posso usare sequenza casuali di oligonucleo di che se si appaiano fanno da primer)

PER UNO STESSO ORGANISMO POSSO AVERE MOLTE LIBRERIE DI cDNA MA SOLO UNA GENOMICA

IBRIDAZIONE ACIDI NUCLEICI

appaiamento di frammen a singolo lamento provenien da due fon diverse (sonda e bersaglio)

determinare la presenza o la quan tà di acidi nucleici con una sequenza speci ca

l. COMPLEMENTARI = se si appaiano in modo an parallello secondo la regola di Watson e Crick

DENATURAZIONE: separazione dei due lamen tramite la ro ura dei legami H

tramite: soluzione alcalina (pH>13) : s mola dissociazione P (diventano + neg.)

temp. > 94-95°C

bassa forza ionica (viceversa gli ioni + neutralizzano le cariche - di P)

sost. denaturan (urea - formamide)

➝

reversibile abbasso gradualmente temp. (x evitare stru ure 2° intramolecola)

➝ ➝

1° appaiamento = nucleazione dell’elica poi rapid zippering

DEGRADAZIONE: ro ura legami fosfodiestere (endonucleasi - soluzione acida HCl)

RINATURAZIONE: riappaiamento tra 2 lamen della stessa molecola

IBRIDAZIONE: appaiamento tra due lamen appartenen a molecole ≠

DNA DENATURATO: - aumenta l’assonanza della luce UV

- diminuisce la viscosità

Mel ng Temperature (Tm) = temp. alla quale 50% DNA a doppio lamento e 50% è denaturato

dipende dalla lunghezza e dalla sequenza (legami C-G o A-T)

ibridazione inizia a pochi gradi so o la Tm

si riferisce alla SONDA

Tm = (N° G+C) x 4 + (N° A+T) x 2

STRINGENZA:

-condizioni di ibridazioni stringen = richiedono + omologia tra sonda e bersaglio

-condizioni di ibridazione - stringen = richiedono una < percentuale di omologia sonda-bersaglio

condizioni ALTA STRINGENZA: - alta temperatura

- bassa concentrazione salina

- denaturan chimici

condizioni BASSA STRINGENZA: - minore temperatura

- maggiore concentrazione salina

fi ti ti tt fi tt

tt ti tt ti ti ti fi fi ti fi tt fi tt fi ti ti ti ti ti ti tt

ti fi ti tt ti ti

ti tt tt fi ti fi tt ti fi ti fi

- no denaturan chimici

x iden care una sequenza all’interno di una libreria genomica (cDNA)

SONDA: popolazione omogenea di molecole omologhe alla sequenza che voglio trovare

BERSAGLIO: tu i cloni della libreria su piastra

scopo: iden care all’interno del bersaglio quel clone, o quei pochi cloni, che contengono

sequenze complementari alla mia sonda ➝

x rendere visibile l’appaiamento sonda-bersaglio SONDA MARCATA

MARCARE ACIDI NUCLEICI:

denaturo la sonda e, visto che conosco la sequenza, realizzo un primer sinte co che legherà il 3’

✦ DNA polimerasi ba eri puri cata sinte zzerà in vitro il nuovo lamento

✦ se u lizzo oligonucleo di radioa vi/ uorescen per la sintesi il nuovo lamento sarà marcato

✦

marcature radioa ve: - sos tuisco il P in posizione α con P32 o S35

- sos tuisco l’H legato al C2 dello zucchero con in trizio

marcature uorescen : - uorocromi (eme ono uorescenza se illumina con raggi laser)

eme ono in lunghezze d’onda ≠ e quindi vedremo colori ≠

- digossigenina (evidenziata tramite legame con an corpi marca )

- FISH: ibridazione su cromosomi metafasici con sonde speci che x 1 allele

sia la sonda che il bersaglio saranno denatura

✦ il DNA bersaglio a singolo lamento è messo su super cie solida ( ltro di nitrocellulosa) e si lega

✦ covalentemente con esso in un punto speci co

INCUBAZIONE: inserisco la sonda marcata → ibridazione

✦ immergo ltro in soluzione di lavaggio per togliere le sonde non ibridate o ibridate sonda-sonda

✦ visualizzo le sonde ibridate (marcatura radioa va = autoradiogra a su pellicola fotogra ca)

✦

SCREENING GENOTECA: trasferire cloni dalla piastra al ltro di nitrocellulosa

↳ appoggio il ltro sulla piastra: esso si imbeverà di liquido che trasporterà anche proteine/DNA

↳ vengono fa fori sul ltro e sulla piastra x poterli riorientare corre amente

SOUTHERN BLOT

si fa ele roforesi di DNA tagliato in frammen con enzimi di restrizione

✦ trasferire il DNA su ltro in nitrocellulosa: TRASFERIMENTO PER CAPILLARITÀ

✦

- sopra il gel si me e: ltri di carta assorbente + ltro in nitrocellulosa + carta assorbente

- la carta so o assorbe il liquido tampone dal gel

- per capillarità il liquido è richiamato a salire dal primo al secondo strato di carta

- il liquido trascina con se l’acido nucleico che resta sul ltro di nitrocellulosa

- il ltro di nitrocellulosa riporta DNA in = posizione e = quan tà (in proporzione) che aveva sul gel

il ltro in nitrocellulosa è ibridato per trovare DNA bersaglio

✦

es: Southern Blot di plasmide con all’interno un frammento di DNA (bersaglio)

faccio varie ele roforesi con enzimi ≠:

- pozze o M: marcatore di peso molecolare (bande di taglia nota x avere riferimento)

➝

- pozze o P: plasmide non tagliato + bande perchè i plasmidi superavvol sono + veloci

➝

- pozze o P+B: plasmide tagliato con BamH1 è linearizzato forma 1 sola banda

➝

- pozze o P+E: plasmide tagliato con EcoRI separa plasmide e inserto: 2 bande

➝

- pozze o G+E: tu o il DNA genomico tagliato con EcoRI forma tan ssimi frammen ≠

non ci sono bande ma un’unica strisciata

➝

banda discesa = DNA satellite con ene sequenze ripetute molte volte

EcoRI forma tan frammen della = lunghezza

trasferisco sul foglio di nitrocellulosa è ibrido:

- pozze o P: tu e le bande marcate (tu i plasmidi hanno il frammento)

fi

fi ti ti fi

tt fi tt fl ti tt

tt

tt

tt

tt

tt fi tti fi

tti tt tti tt fi tt

tt fi ti ti tt fi fl fi fi

ti

ti tt tti fl ti tt fi tti ti tti

ti ti

fi ti fl ti fi

fi fi ti ti fi ti fi fi tt fi ti ti ti ti ti fi fi ti ti

- pozze o P+B: 1 banda evidenziata (tu i plasmidi hanno il frammento)

- pozze o P+E: 1 banda marcata (si evidenzia solo l’inserto non la banda del plasmide)

- pozze o G+E: 1 banda uguale a quella del pozze o E

la sonda lega solo la sequenza a essa complementare (= all’inserto di P)

da tu a la strisciata solo le molecole di questa grandezza (generate con Eco

RI) che contengono questa sequenza verranno ibridizzate

scopi: - evidenziare mutazioni di RFLP: si o engono bande ≠ dagli stessi alleli

(delezioni o creazioni di si di restrizione: mutazioni con riscontri patologici)

es: mutazione su sito di restrizione che scompare

omozigote sano = 2 bande (entrambi gli alleli sono taglia da ER)

omozigote malato = 1 banda (nessuno dei due alleli è tagliato da ER)

eterozigote = 3 bande (1 allele è tagliato da ER, l’altro no)

NORTHERN BLOT

Simile al Southern Blot ma u lizza RNA (NO enzimi di restrizione)

serve a: - quan care il prodo o dei geni (a raverso l’RNA che trascrivono)

- capire come e dove sono espressi i geni

tecniche per quan care il prodo o dei geni:

• IBRIDAZIONI: slot blot, Northern blot, ibridazione in situ (FISH), micro e macro arrays

• AMPLIFICAZIONI: PCR

di solito l’abbondanza di RNA è proporzionale al grado di a vità del gene

processo:

lisi cellule con un potente denaturante che rompa la membrana e denaturi le proteine

✦ (altrimen le ribonucleasi degraderebbero l’RNA)

RNA è fa o precipitare con soluzione di sali e alcol assoluto x puri carlo ed estrarlo

✦ tu o l’RNA è separato con ele roforesi su gel denaturante (formaldeide) x evitare che formi

✦ stru ure secondarie (scorrerebbero + velocemente di quelle lineari)

si o ene strisciata perchè ci sono tan RNA di tante taglie diverse:

✦ - bande discrete = abbondanza di RNA della stessa taglia (rRNA 28S e 18S)

l’abbondanza di RNA dipende dal po cellulare da cui è stato estra o

✦ poi trasferisco RNA su ltro di nitrocellulosa e lo lego covalentemente ad esso (CROSS-LINKING)

✦ ibridazione con con un frammento dell’RNA sonda di cui sono interessato a studiare

✦ l’espressione in ques tre campioni

visualizzazione del segnale (autoradiogra a o clorimetria) per analizzare:

✦ - qualità del segnale:

se vedo 2 bande (che avranno = sequenza perchè ibridizzate con la = sonda)

signi ca che è splicing alterna vo o promotore alterna vo o ≠ sito di poli-A

questo spiega perchè le sequenze sebbene uguali hanno PM ≠

- quan tà del segnale: ➝

dipende da quanto RNA era stato caricato nel gel bisogna e e uare un’altra ibridazione

2° ibridazione controllo: pongo il ltro in condizioni denaturan

✦ STRIPPING: RNA resta legato ma la sonda si stacca

✦ ➝

nuova sonda: gene housekeeping RNA che codi ca per proteina essenziale in tu e le cellule

✦ (la sua espressione non varia in condizioni/cellule ≠)

la quan tà di RNA marcato sarà proporzionale alla quan tà di RNA caricato nel gel

✦ cfr. ibridazione con target e ibridazione di controllo (conto n° pixel delle bande):

✦ x ciascun campione divido n° della banda target col n° della banda di controllo

(NORMALIZZAZIONE)

IBRIDAZIONE IN SITU

tt tti tt fi ti tt

ti ti tt

tt

tt ti fi ti fi ti fi tt ti tt

tt ti fi

tt ti

ti ti fi tt tt tti fi tt ti ti tti ti ti ff fi tt tt tt

avviene dire amente su tessu (sezioni istologiche/tessu non seziona : whole mount)

x localizzare l’espressione di un dato mRNA o gene a livello delle cellule

estraggo porzione di tessuto e lo immobilizzo su vetrino

✦ elimino proteine e uso soluzione denaturante

✦ in ne faccio ibridazione e visualizzo i segnali colorimetrici o radioa vi

✦

ibridazione whole mount: su embrioni o tumori (il tessuto non è sezionato)

tra o tessuto con detergente x fare piccoli buchi sulle membrane

✦ u lizzo sonda uorescente che ibridizza col suo mRNA/DNA complementare

✦ ➝

lavo via sonde non legate la quan tà di sonda è proporzionale a quella di mRNA

✦ posso u lizzarlo x localizzare un gene su un cromosoma (x vedere trisomie)

✦

PCR

ampli care sequenza di DNA in vitro senza clonaggio/ba eri (può essere quan ta va o no)

serve: - DNA stampo da ampli care

- deossinucleo di trifosfato (x formare le nuove molecole)

- Taq polimerasi

- PRIMER: 2 oligonucleo di di innesco complementari a due sequenze situate alle estremità

lamen oppos (segano inizio della sequenza da ampli care)

Taq polimerasi: dai ba eri termo li, resiste e funziona no a 95°C

➝

Ogni PCR è composta da circa 30 cicli ( x 2 mld di copie) ogni ciclo:

95